Anda di halaman 1dari 17

LAPORAN PRAKTIKUM KIMIA ANALISIS

Hight Performance Liquid Chromatography


(HPLC)

Asisten

: Bu Emi

Golongan/Kelompok

:S/E

Nama kelompok

Albertus Kristian Siswanto (2443013047)


Dwi Augusnita (2443013099)
Fransisca Yunita Dwi Wulandari (2443013304)
Maria Kyriensia (2443013154)

LABORATORIUM KIMIA ANALISIS


FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS KATOLIK WIDYA MANDALA SURABAYA
2015

I.

DASAR TEORI
Teknik HPLC merupakan satu teknik kromatografi cair - cair yang dapat digunakan
baik untuk keperluan pemisahan maupun analisis kuantitatif. Analisis kuantitatif dengan
teknik HPLC didasarkan kepada pengukuran luas atau area puncak analit dalam
kromatogram, dibandingkan dengan luas atau area larutan standar (Khopkar, 1990).
Prinsip dasar dari HPLC, dan semua metode kromatografi adalah memisahkan setiap
komponen dalam sampel untuk selanjutnya diidentifikasi (kualitatif) dan dihitung berapa
konsentrasi dari masing-masing komponen tersebut (kuantitatif). Analisa kualitatif bertujuan
untuk mengetahui informasi tentang identitas kimia dari analit dalam suatu sampel.
Sedangkan analisa kuantitatif untuk mengetahui jumlah dan konsentrasi analit tersebut
dalam sampel (Khopkar, 1990).
HPLC menggunakan fasa gerak untuk memisahkan komponen dari sebuah campuran
komponen (analit). Prinsip keja HPLC adalah pemisahan setiap komponen dalam sampel
berdasarkan kepolarannya. Yang paling membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya
adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak. Contoh fasa diam
yang digunakan (pada kolom) HPLC jenis fasa terbalik adalah RP18, dimana R adalah rantai
alkana C-18 atau C-8. Sementara fasa geraknya berupa larutan yang diatur komposisinya
(gradien elusi), hal ini bergantung pada kepolaran analit yang akan dipisahkan. Campuran
analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya, dan waktu retensinya akan berbeda, hal ini
akan teramati pada spektrum yang puncak-puncaknya terpisah (Khopkar, 1990).
Komponen utama HPLC adalah :

Reservoir pelarut : zat pelarut yang dipakai polaritasnya dapat bervariasi tergantung
dari senyawa yang dianalisis, yang perlu diperhatikan adalah bahwa tempat pelarut
tersebut harus memungkinkan untuk proses menghilangkan gas atau udara yang ada

dalam pelarut.
Pompa : digunakan untuk mengalirkan pelarut sebagai fase gerak dengan kecepatan

dan tekanan yang tetap.


Injektor : saat sampel diinjeksikan ke dalam kolom, diharapkan agar pelarut tidak
mengganggu masuknya keseluruhan sampel ke dalam kolom. Injeksi dapat
menggunakan syringe.

Kolom kromatografi : kolom yang dipakai memiliki panjang 10 25 cm dan diameter


4,5 5 mm yang diisi dengan fase stasioner berukuran 5-10 mikrometer dan terbuat

dari logam atau stainless steel.


Detektor : digunakan untuk mendeteksi sampel. Detektor dibutuhkan untuk
mempunyai sensitivitas yang tinggi, linear untuk jangka konsentrasi tertentu dan
dapat mendekati eluen tanpa mempengaruhi resolusi kromatografi (Adnan,1997).

Kegunaan umum HPLC adalah untuk pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik,
maupun senyawa biologis, penentuan molekul - molekul netral, ionic, maupun zwitter ion, isolasi
dan pemurnian senyawa, pemisahan senyawa-senyawa yang strukturnya hampir sama, HPLC
merupakan metode yang tidak destruktif dan dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif
maupun kuantitatif (Adnan,1997).
Zat dengan kepolaran berbeda dapat dipisahkan dengan HPLC berdasarkan partisi caircair. Prinsip HPLC menggunakan prinsip kromatografi adsorbsi dan banyak digunakan dalam
industi farmasi dan pestisida. HPLC sering digunakan antara lain untuk menetapkan kadar
senyawa aktif pada obat, produk hasil samping proses sintesis, atau produk - produk degradasi
dalam sediaan farmasi. Keterbatasan metode HPLC ini adalah untuk identifikasi senyawa,
kecuali jika HPLC dihubungkan dengan spektrometer massa (MS). Keterbatasan lainnya adalah
sampel sangat kompleks maka resolusi yang baik sulit diperoleh (Adnan,1997).
Sistem Peralatan HPLC
Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah fase gerak, pompa, alat untuk
memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor, wadah penampung buangan fase gerak,
dan suatu komputer atau integrator atau perekam.
Diagram skematik sistem kromatografi cair seperti ini :

1. Wadah Fase gerak dan Fase gerak


Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut kosong ataupun
labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini biasanya dapat
menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut. Fase gerak atau eluen biasanya
terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan
dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas
keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel. Untuk
fase normal (fase diam lebih polar daripada fase gerak), kemampuan elusi meningkat
dengan meningkatnya polaritas pelarut. Sementara untuk fase terbalik (fase diam kurang
polar daripada fase gerak), kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas
pelarut.
Fase gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk menghindari
partikel-partikel kecil ini. Selain itu, adanya gas dalam fase gerak juga harus dihilangkan,
sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan detektor
sehingga akan mengacaukan analisis. Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik
(komposisi fase gerak tetap selama elusi) atau dengan cara bergradien (komposisi fase
gerak berubah-ubah selama elusi) yang analog dengan pemrograman suhu pada
kromatografi gas. Elusi bergradien digunakan untuk meningkatkan resolusi campuran
yang kompleks terutama jika sampel mempunyai kisaran polaritas yang luas. Fase gerak
yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik adalah campuran
larutan bufer dengan metanol atau campuran air dengan asetonitril. Untuk pemisahan
dengan fase normal, fase gerak yang paling sering digunakan adalah campuran pelarutpelarut hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi atau menggunakan pelarut-pelarut
jenis alkohol. Pemisahan dengan fase normal ini kurang umum dibanding dengan fase
terbalik.
2. Pompa
Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang mempunyai syarat
sebagaimana syarat wadah pelarut yakni: pompa harus inert terhadap fase gerak. Bahan
yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, Teflon, dan batu nilam.
Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan

mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 mL/menit. Untuk tujuan
preparatif, pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase gerak dengan
kecepatan 20 mL/menit. Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak
adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat,
reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan. Ada 2 jenis pompa dalam HPLC yaitu:
pompa dengan tekanan konstan, dan pompa dengan aliran fase gerak yang konstan. Tipe
pompa dengan aliran fase gerak yang konstan sejauh ini lebih umum dibandingkan
dengan tipe pompa dengan tekanan konstan.
3. Tempat penyuntikan sampel
Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam fase gerak
yang mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang
terbuat dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel
(sample loop) internal atau eksternal.

Posisi pada saat memuat sampel

Posisi pada saat menyuntik sampel

4. Kolom dan Fase diam


Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor.
Kolom merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk berlangsungnya
proses pemisahan solut/analit.
Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan kolom
konvensional, yakni:

Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil dibanding
dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase

gerak lebih lambat (10 -100 l/menit).


Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal

jika digabung dengan spektrometer massa.


Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya
jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel klinis.
Meskipun demikian dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan kolom

konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin. Kebanyakan fase diam
pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tidak
dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen. Permukaan silika adalah
polar

dan

sedikit

asam

karena

adanya

residu

gugus

silanol

(Si-OH).

Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan reagen-reagen seperti


klorosilan. Reagen-reagen ini akan bereaksi dengan gugus silanol dan menggantinya
dengan gugus-gugus fungsional yang lain.
Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling banyak
digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah,
sedang, maupun tinggi. Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih sesuai untuk
solut yang polar. Silika-silika aminopropil dan sianopropil (nitril) lebih cocok sebagai
pengganti silika yang tidak dimodifikasi. Silika yang tidak dimodifikasi akan
memberikan waktu retensi yang bervariasi disebabkan karena adanya kandungan air yang
digunakan.

5. Detektor HPLC
Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor
universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak
bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa; dan
golongan detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan
selektif,

seperti

detektor

UV-Vis,

detektor

fluoresensi,

dan

Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut:

elektrokimia.

Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel.


Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar

yang sangat kecil.


Stabil dalam pengopersiannya.
Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran

pita.
Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran

yang luas (kisaran dinamis linier).


Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.
Beberapa detektor yang paling sering digunakan pada HPLC dengan karakteristik

detektor seperti berikut :


Detektor

Sensitifitas
(g/ml)

Kisaran
linier

Karakteristik

5 x 10-10
5 x 10-10
> 2 x 10-10

104
105
105

Fluoresensi

10-12

104

Indeks bias

5 x 10-7

104

Sensitivitas bagus, paling


sering digunakan, selektif
terhadap gugus-gugus dan
struktur-struktur yang tidak
jenuh.
Sensitifitas sangat bagus,
selektif, Tidak peka terhadap
perubahan suhu dan kecepatan
alir fase gerak.
Hampir bersifat universal akan
tetapi sensitivitasnya sedang.
Sangat sensitif terhadap suhu,
dan tidak dapat digunakan
pada elusi bergradien

10-8
10-12

104
105

Absorbansi Uv-vis
Fotometer filter
Spektrofotometer
spektrometer photodiode array

Elektrokimia
Konduktimetri
Amperometri

JENIS HPLC

Peka terhadap perubahan suhu


dan kecepatan alir fase gerak,
tidak dapat digunakan pada
elusi
bergradien.
Hanya
mendeteksi solut-solut ionik.
Sensitifitas sangat bagus,
selektif tetapi timbul masalah
dengan adanya kontaminasi
elektroda.

Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal (jika fase diamnya lebih
polar dibanding dengan fase geraknya) atau fase terbalik (jika fase diamnya kurang non polar
dibanding dengan fase geraknya). Berdasarkan pada kedua pemisahan ini, sering kali HPLC
dikelompokkan menjadi HPLC fase normal dan HPLC fase terbalik. Selain klasifikasi di atas,
HPLC juga dapat dikelompokkan berdasarkan pada sifat fase diam dan atau berdasarkan pada
mekanisme sorpsi solut, dengan jenis-jenis HPLC sebagai berikut:
1. Kromatografi Adsorbsi
Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam kromatografi
kolom dan kromatografi lapis tipis. Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya
menggunakan fase normal dengan menggunakan fase diam silika gel dan alumina,
meskipun demikian sekitar 90% kromatografi ini memakai silika sebagai fase diamnya.
Pada silika dan alumina terdapat gugus hidroksi yang akan berinteraksi dengan solut.
Gugus silanol pada silika mempunyai reaktifitas yang berbeda, karenanya solut dapat
terikat secara kuat sehingga dapat menyebabkan puncak yang berekor.
2. Kromatografi fase terikat
Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi secara
kimiawi atau fase terikat. Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika adalah
hidrokarbon-hidrokarbon non-polar seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau
dengan fenil. Fase diam yang paling populer digunakan adalah oktadesilsilan (ODS atau
C18) dan kebanyakan pemisahannya adalah fase terbalik. Sebagai fase gerak adalah
campuran metanol atau asetonitril dengan air atau dengan larutan bufer. Untuk solut yang
bersifat asam lemah atau basa lemah, peranan pH sangat krusial karena kalau pH fase
gerak tidak diatur maka solut akan mengalami ionisasi atau protonasi. Terbentuknya
spesies yang terionisasi ini menyebabkan ikatannya dengan fase diam menjadi lebih
lemah dibanding jika solut dalam bentuk spesies yang tidak terionisasi karenanya spesies
yang mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat.
3. Kromatografi penukar ion
KCKT penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau
anion dengan suatu fase gerak. Ada banyak penukar ion yang beredar di pasaran,
meskipun demikian yang paling luas penggunaannya adalah polistiren resin.
Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan media air
karena sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut campuran misalnya air-

alkohol dan juga pelarut organik. Kromatografi penukar ion dengan fase gerak air, retensi
puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak.
Kenaikan kadar garam dalam fase gerak menurunkan retensi solut. Hal ini disebabkan
oleh penurunan kemampuan ion sampel bersaing dengan ion fase gerak untuk gugus
penukar ion pada resin.
4. Kromatografi Pasangan ion
Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan sampelsampel ionik dan mengatasi masalah-masalah yang melekat pada metode penukaran ion.
Sampel ionik ditutup dengan ion yang mempunyai muatan yang berlawanan.
5. Kromatografi Eksklusi Ukuran
Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat
digunakan untuk memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul > 2000
dalton. Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porus
sehingga solut dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau berdifusi lewat fase
diam. Molekul solut yang mempunyai BM yang jauh lebih besar, akan terelusi terlebih
dahulu, kemudian molekul-molekul yang ukuran medium, dan terakhir adalah molekul
yang jauh lebih kecil. Hal ini disebabkan solut dengan BM yang besar tidak melewati
porus, akan tetapi lewat diantara partikel fase diam. Dengan demikian, dalam pemisahan
dengan eksklusi ukuran ini tidak terjadi interaksi kimia antara solut dan fase diam seperti
6.

tipe kromatografi yang lain.


Kromatografi Afinitas
Dalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi yang
sangat spesifik. Fase diam mengandung gugus-gugus molekul yang hanya dapat
menyerap sampel jika ada kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu
pada sampel yang sesuai (sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan antibodi).
Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein (enzim) dari campuran
yang sangat kompleks (Rivai, 1995).

DERIVATISASI PADA HPLC


Derivatisasi melibatkan suatu reaksi kimia antara suatu analit dengan suatu reagen untuk
mengubah sifat fisika-kimia suatu analit. Tujuan utama penggunaan derivatisasi pada HPLC
adalah untuk:

1. Meningkatkan deteksi
2. Merubah struktur molekul atau polaritas analit sehingga akan menghasilkan puncak
kromatografi yang lebih baik
3. Merubah matriks sehingga diperoleh pemisahan yang lebih baik
4. Menstabilkan ana analit yang sensitif.
Detektor yang paling banyak digunakan dalam HPLC adalah detektor UV-Vis sehingga
banyak metode yang dikembangkan untuk memasang atau menambahkan gugus kromofor yang
akan menyerap cahaya pada panjang gelombang tertentu. Di samping itu, juga dikembangkan
suatu metode untuk menghasilkan fluorofor (senyawa yang mamapu berfluoresensi) sehingga
dapat dideteksi dengan fluorometri.Suatu reaksi derivatisasi harus mempunyai syarat-syarat
sebagai berikut, yakni: produk yang dihasilkan harus mampu menyerap baik sinar ultraviolet
atau sinar tampak atau dapat membentuk senyawa berfluoresen sehingga dapat dideteksi dengan
spektrofluorometri; proses derivatisasi harus cepat dan menghasilkan produk yang sebesar
mungkin (100 %); produk hasil derivatisasi harus stabil selama proses derivatisasi dan deteksi;
serta sisa pereaksi untuk derivatisasi harus tidak menganggu pemisahan kromatografi (Rivai,
1995).
SIFAT BAHAN
1. Paracetamol / Asetaminofen
o C8H9NO2
o BM = 151,16
o Pemerian
Serbuk hablur, putih, tidak berbau : rasa sedikit pahit
o Kelarutan
Larut dalam air mendidih dan dalam NaOH 1N mudah larut dalam etanol
2. Kofeinum
o C8H10N4O2
o BM = 194,19
o Pemerian
Serbuk putih atau bentuk jarum mengkilat putih, biasanya menggumpal; tidak
berbau; rasa pahit. Larutan bersifat netral terhadap kertas lakmus. Bentuk hidratnya
mekar di udara.

o Kelarutan
Agar sukar larut dalam air, dalam etanol, mudah larut dalam kloroform, sukar dalam
eter.

II.

III.

I.

Fase gerak

II.

Fase gerak

= Metanol : Air
= 55
: 45
= Metanol : Air
= 45
: 55

ALAT BAHAN
Alat
HPLC
Labu ukur 25 mL, 5 Ml
Bekker glass
Botol timbang
Neraca analitik
Pipet volum

Bahan
Paracetamol
Coffein
Methanol for HPLC
Methanol for pa

CARA KERJA
Pembuatan paracetamol 30 ppm
30 mg paracetamol dilarutkan dalam 25ml methanol
= 30mg/ 25 ml
= 120 mg/ 100 ml
= 1200 ppm
Pengenceran

30 ppm
1200 ppm

x 5 ml

= 0,125 ml ~ 125 l ad 5 ml methanol

Pembuatan coffein 30 ppm


30 mg coffein dilarutkan dalam 25ml methanol
= 30mg/ 25 ml
= 120 mg/ 100 ml
= 1200 ppm
Pengenceran

30 ppm
1200 ppm

x 5 ml

= 0,125 ml ~ 125 l ad 5 ml methanol

Pembuatan campuran paracetamol dan coffein


Pipet paracetamol 125 l ke dalam labu ukur 5 ml + coffein 125 l

ad kan

dengan methanol hingga tanda.


1. Pembuatan fase gerak
Buat cammpuran methanol : air (45:55)
Saring dengan membrane filter
Degassing selama 15 menit
2. Pembuatan larutan uji
*Larutan standar paracetamol dalam methanol konsentrasi 30 ppm
Saring dengan membrane filter
Degassing selama 5 menit
*Larutan standar coffein dalam methanol konsentrasi 30 ppm
Saring dengan membrane filter
Degassing selama 5 menit
*Larutan campuran standar coffein-paracetamol dalam methanol konsentrasi 30 ppm
Saring dengan membrane filter
Degassing selama 5 menit
3. Penentuan panjang gelombang terpilih
Mengamati spektrum tunggal paracetamol maupun coffein dengan spektro UV
Mentukan panjang gelombang dan lakukan pengamatan secara HPLC
4. Pemisahan paracetamol coffein dengan HPLC
Setting HPLC denga panjang gelombang detector UV (atur flow rate 1 ml/min)
Flushing kolom dengan methanol for HPLC yang telah disaring dan didegass
Mengganti methanol dengan fase gerak methanol : air (45:55), tunggu kolom sampai
stabil
Menginject larutan standar paracetamol, coffein, campuran keduanya, amati kromaogram
Mengubah komposisi fase gerak methanol : air (55:45) untuk mendapatkan hasil
pemisahan yang baik

IV.

HASIL PENGAMATAN
Pembuatan fase gerak dan larutan yang dipakai dalam praktikum tidak dilakukan
praktikan karena bahan tersebut telah tersedia di laboratorium.

Hasil pengamatan pada perbandingan pelarut methanol : Air (45 : 55)


Tr A = 2,72 cm
Wa
= 0,55 cm
Tr B = 4,00 cm
Wb
= 0,4 cm
Tr = 4,00-2,72 = 1,28 cm
Wa+Wb= 0,95
Rs

2.( Tr )
Wa+Wb

2 X 1,28
0,95

2,56
0,95

= 2,6
Hasil pengamatan pada perbandingan pelarut methanol : Air (65 : 35)
Tr A = 2,48 cm
Wa
= 0,4 cm
Tr B = 3,3 cm
Wb
= 0,5 cm
Tr = 8,8-7,3 = 1,5 cm
Wa+Wb= 0,9
Rs

2.( Tr )
Wa+Wb

2 X 0,82
0,9

1,64
0,9

= 1,8
V.

PEMBAHASAN
Pada praktikum kali ini, praktikan melakukan pemisahan paracetamol dan coffein
dalam suatu sampel obat. Instrumen yang dipilih pada percobaan ini adalah kromatografi
cairan kinerja tinggi (HPLC). Teknik HPLC merupakan salah satu teknik kromatografi caircair, yaitu suatu metode pemisahan dari suatu analit berdasarkan perbedaan interaksi antara

fasa diam dengan fasa geraknya. Teknik HPLC ini dapat digunakan untuk analisis kuantitatif
dan kualitatif. Analisis kuantitatif dapat dilihat dari pengukuran luas puncak/area dari analit
pada kromatogram yang dibandingkan dengan luas area standar dengan menggunakan kurva
kalibrasi, pada percobaan kali ini digunakan dua deret larutan standar. Analisis kualitatif
dapat dilihat dari waktu retensinya yang dibandingkan dengan standar.
Penggunaan jenis kromatografi fasa terbalik (reverse phase) ini karena sampel yang
akan kita pisahkan bersifat polar, oleh karena itu dalam jenis kromatografi ini fasa gerak
yang digunakan memiliki sifat yang polar yaitu campuran antara air : methanol dengan
perbandingan 45:55 dan fasa diamnya bersifat nonpolar biasanya fasa diam yang memiliki
rantai alkil 8 (C-8) atau 18 (C-18) dan dalam praktikum ini digunakan adalah oktadesilan
(ODS) .
Dalam melakukan analisis perlu diperhatikan setiap tahapnya agar kesalahan yang
terjadi menjadi seminimal mungkin. Sampel uji harus disaring dahulu dengan membran
PTFE agar tidak terjadi penyumbatan dalam kolom dan menghilangkan udara atau gas dari
pelarutnya. Karena jika sampel masih ada gas yang terlarut dapat menyebabkan gangguan
pada sistem pengatur gradient dari eluennya.
Di dalam kolom HPLC komponen-komponen dipisahkan berdasarkan perbedaan
kekuatan interaksi solut terhadap fasa diamnya. Solut yang berinteraksi kurang kuat maka
akan keluar lebih lambat dari kolom daripada solut yang lebih kuat interaksinya. Prinsipnya
juga dapat dikatakan sama dengan proses KLT yakni like dissolve like, dimana senyawa
yang lebih polar akan keluar lebih dahulu keluar kolom karena mengikuti fase gerak yang
bersifat polar juga. Komponen tersebut selanjutnya keluar dari kolom dengan kecepatan
yang berbeda dan apabila puncak keluar saling berdekatan sehingga sulit untuk dibedakan
mana puncak parasetamol dan coffein maka fase gerak harus dibuat lebih polar.
Penginjekan pertama adalah campuran parasetamol-coffein dengan fase gerak air :
methanol (45:55). Read out dari hasil analisis dengan HPLC adalah suatu kromatogram.
Kromatogram adalah grafik yang menghubungkan antara intensitas komponen yang dibawa
oleh fasa gerak terhadap waktu retensi. Banyaknya puncak menunjukkan jumlah komponen,
sedangkan luas peak menyatakan konsentrasi. Dari hasil penginjekan pertama terlihat dua
peak yang muncul pada kromatogram dan diantara dua puncak tersebut terlihat juga ada
puncak kecil yang nampak. Dari hasil ini belum dipastikan secara jelas peak yang keluar

lebih dahulu merupakan peak dari paracetamol atau coffein. Oleh karena itu, praktikan
melakukan penginjekan larutan standar paracetamol ke dalam kolom dengan kondisi fase
gerak yang sama. Dari hasil kromatogram terlihat bahwa peak yang muncul memiliki waktu
retensi 2,78. Waktu retensi tersebut merupakan jangka waktu yang terukur saat sampel
melewati kolom HPLC. Hasil tersebut memiliki kesamaan dengan kromatogram pertama
pada peak pertama. Hal ini menunjukan bahwa peak yang yang muncul pertama pada
penginjekan campuran pertama adalah paracetamol. Dari hasil tersebut juga menunjukan
bahwa memang benar paracetamol lebih polar dari coffein. Pada hasil kromatogram juga
terlihat peak kecil yang sama seperti peak yang muncul di antara kedua peak pada
kromatogram campuran pertama tadi. Data tersebut menunjukan bahwa peak kecil tersebut
hanya merupakan pengotor dan pengotor tersebut berasal dari sampel paracetamol. Setelah
penginjekan larutan standar parasetamol, praktikan tidak melakukan penginjekan larutan
standar coffein karena hanya terdapat dua peak pada kromatogram campuran dan sudah
dapat disimpulkan bahwa peak yang muncul terakhir adalah coffein.
Dari data kromtogram sampel didapatkan puncak dari kafein lebih kecil dari pada
puncak paracetamol karena kadar dari kafein dalam sampel lebih sedikit. Dari data
kromatogram tersebut juga menunjukan bahwa pemisahan antara paracetamol dan coffein
terlihat sempit. Hal tersebut dapat terlihat jelas dari gambar yang ditunjukan dan dari rasio
waktu retensi yang sempit. Oleh karena itu, praktikan mengubah fase gerak menjadi lebih
polar yakni air: methanol (55:45). Setelah sampel diukur, didapat kromatogram dari sampel.
Dari data kromatogram terlihat bahwa gambar pemisahan terlihat jelas dengan perbedaan
waktu retensi kedua senyawa tersebut adalah 1,28. Dan puncaknya semakin bergeser ke
kanan. Dari kromatogram tersebut diperoleh harga Rs yakni 2,6. Dibandingkan dengan
kromatogram campuran pertama didapat perbedaan waktu retensi kedua senyawa adalah
0,82 dan harga Rs adalah 1,82.
Pada dua fase gerak yang berbeda ini terlihat spektrum parasetamol dan coffein yang
berbeda, dapat terlihat mana pemisahan yang lebih baik antara campuran air : methanol
(45:55) dan air : methanol (55:45). Panjang gelombang yang digunakan adalah panjang
gelombang terpilih, bukan panjang gelombang maksimum. Pada praktikum ini panjang
gelombang yan g digunakan adalah 260 nm. Panjang gelombang maksimum adalah panjang
gelombang tertinggi dari parasetamol maupun coffein, tetapi bila digunakan panjang

gelombang tersebut ada kemungkinan spektrum salah satu (parasetamol atau coffein) tidak
nampak. Sehingga digunakan panjang gelombang terpilih, panjang gelobang ini tidak harus
maksimalnya dari panjang gelombang sampel. Panjang gelombang dipilih supaya kedua
sampel spektrumnya dapat teramati. Rs yang baik adalah 1,5. Rs yang didapat pada
percobaan sudah sesuai dengan harga Rs yang baik sehingga pemisahan dapat dikatakan
baik.
Waktu keluarnya spectrum pada campuran air : methanol (45:55) adalah parasetamol
pada menit 2,2, coffein pada menit 3,0 Sedangkan pada air : methanol (55:45) parasetamol
keluar pada menit ke 2,5, coffein keluar pada menit 3,4. Pemisahan lebih baik terjadi pada
campuran air : methanol (55:45) karena kurva tidak berhimpitan, pada campuran air :
methanol (45:55) kurva berhimpitan. Untuk mendapatkan pemisahan yang baik adalah
dengan meningkatkan kepolaran fase gerak dimana dalam praktikum ini yang ditambahkan
volume fase geraknya adalah air. .
VI.

KESIMPULAN
Pada percobaan menggunakan instrument HPLC didapatkan puncak parasetamol
lebih besar dibandingkan dengan coffein. Pemisahan paracetamol dan coffein yang paling
bagus adalah pada perbandingan konsentrasi methanol : air (55:45) dengan harga Rs = 2,6.
Untuk mendapatkan pemisahan yang baik maka diubah kondisi fase gerak ke arah polar
apabila pemisahan terlalu sempit (Rs kecil).

VII.

DAFTAR PUSTAKA
Adnan, M. 1997. Teknik Kromatografi untuk Analisis Bahan

Makanan. Andi Offset:

Yogyakarta.
Khopkar, S.M., 1990. Konsep Dasar Kimia Analitik. Universitas Indonesia : Jakarta.
Rivai, H. 1995. Asas Pemeriksaan Kimia. Penerbit UI : Jakarta.

VIII.

Lampiran.