Anda di halaman 1dari 25

TU

High-Performance Liquid
Chromatography
FA2 - UNJANI 2014

Tursino, M.Si., Apt.

HPLC : Topik Bahasan


Prinsip
Instrumentasi
Kolom
Kromatogram
Aplikasi Analisis :
UKS
Identifikasi
Kemurnian
Kadar

HPLC

Prinsip
Kromatografi (FI IV, hal. 1002) adalah metode atau prosedur

pemisahan zat terlarut oleh suatu proses migrasi diferensial


dinamis dalam system yang terdiri dari dua fase atau lebih, salah
satunya bergerak secara berkesinambungan dalam arah tertentu
dan di dalamnya zat-zat itu menunjukkan perbedaan mobilitas
disebabkan adanya perbedaan dalam adsorpsi, partisi, kelarutan
tekanan uap, ukuran molekul atau kerapatan muatan ion (FI IV).

Klasifikasi Kromatografi

HPLC
Merupakan salah satu jenis kromatografi cair, yang melibatkan
penggunaan teknologi kolom baru, sistem pompa tekanan tinggi, dan

detektor yang sensitif, yang memungkinkan sistem pemisahan


dengan kecepatan dan efisiensi tinggi.
Fase gerak dipompa dengan tekanan tinggi melewati suatu kolom

berlubang kecil (2-5 mm) yang berisi suatu partikel kecil (3-50 m).
Mekanisme pemisahan : adsorpsi, partisi, penukar ion, dll.
HPLC banyak digunakan dalam identifikasi , uji kemurnian dan

penetapan kadar zat aktif baik dalam bahan baku maupun sediaan.

Beberapa hal yang berkaitan dengan HPLC


Fase Diam, Fase Gerak/Eluen, Solut
Fase gerak tunggal atau campuran : organik, aqueous, dapar pH
tertentu, + ion-pair, dll
Fase diam silica gel, alumina, C18, C8, dll
Kromatografi Fase Normal (KFN) vs Kromatografi Fase Balik (KFB)
Sistem Elusi : Isokratik vs Gradien
Sistem deteksi : detektor UV, det. Fluoresensi, det. RI, det.
Elektrokimia.
Kondisi : suhu kolom, laju alir
Penyiapan bahan/larutan dan preparasi sampel jika diperlukan
UKS
Kromatogram waktu retensi, AUC, lebar puncak, tinggi puncak

Ion Pair vs Penekan Ion pada HPLC

Kapan ditambahkan iop pair pada fase gerak ?

Instrumentasi

Kolom HPLC : C-18, C-8

Kromatogram

Sinyal detektor

R, k`, N, H, T

AUC, tR, lebar


puncak, tinggi
puncak

Analisis
Kualitatif dan
Kuantitatif

Uji Kesesuaian Sistem


Tes kesesuaian sistem merupakan bagian yang tidak terpisahkan dari metode
kromatografi gas ataupun cair. Pengujian ini dilakukan untuk memverifikasi
apakah resolusi dan reprodusibilitas dari sistem kromatografi yang akan
digunakan masih memadai untuk analisis yang dimaksud.
Pengujian dilakukan dengan 6 kali penyuntikan suatu larutan identik, biasanya
larutan standar, kemudian ditentukan paameter seperti pada tabel berikut :

Untuk limitnya tersendiri biasanya dicantumkan di monografi dari senyawa obat


yang diuji.

Aplikasi KCKT dalam Bidang Farmasi


Bahan Baku
Identifikasi
Kemurnian
Penetapan Kadar
Sediaan
Identifikasi
Penetapan Kadar
Kinerja Sediaan : Disolusi

Identifikasi Senyawa Obat dengan HPLC

Larutan uji vs larutan baku (konsentrasi dan pelarut sama)


disuntikkan ke sistem KCKT
Untuk bahan baku larutkan dengan pelarut yg sesuai,
Sediaan dilakukan preparasi/ektraksi terlebih dahulu
dengan pelarut yg sesuai
Kromatogram :
Bandingkan waktu retensi (tR) puncak utama dari larutan
uji terhadap larutan baku std eksternal
Bandingkan waktu retensi relatif (Rr) puncak utama dari
larutan uji terhadap larutan baku std. Internal

Sistem sudah dilakukan UKS terlebih dahulu.

Uji Kemurnian Bahan Baku dengan HPLC

Kemurnian Kromatografi
Sistem kormatografinya elusi gradien ?
Larutan uji disuntikkan ke sistem
Kromatogram penafsiran kemurnian senyawa obat :
Tidak ada puncak selain puncak utama (puncak analit);
atau
Jumlah cemaran tidak lebih dari yang dipersyaratkan
ada puncak lain selain puncak utama.

Contoh :
Doksorubisin HCl kemurnian kromatografi : Jumlah cemaran tidak lebih dari 3,0
%, dihitung menggunakan larutan uji 0,5 mg/ml.
Bagaimana cara analisis dan perhitungannya?

Analisis Kuantitatif Obat dengan HPLC


Standar Eksternal vs Standar Internal
Kurva kalibrasi vs one point method
Kurva kalibrasi dibuat 20% dari kadar analit teoritis. Kadar analit teoritis
diperhitungkan berdasarkan kadar yang tertera dietiket dan prosedur
analisis yang dilakukan (penimbangan, pelarutan, dan pengenceran).
One point method konsentrasi standar vs konsentrasi sampel tidak boleh
terlalu jauh, 0.5 1.5 kalinya, analsisi dilakukan pada rentang linier kurva
kalibrasi.
Misalkan,
Kadar dalam etiket 500 mg/tab : 1 tablet digerus dan dilarutkan hingga 1 L
kadarnya 500 mg/1000 mL = 500 g/mL (larutan uji) maka kurva kalibrasi
dibuat pada rentang 80% x 500 bpj 120% x 500 bpj = 400 600 bpj dibuat 6
seri larutan standar, equidistant.

Contoh Soal

HPLC-1 : Jelaskan mengapa tR triamcinolon paling cepat


sedangkan tR progesteron paling lama.

HPLC-2 : Jelaskan mengapa tR normorphine paling cepat


sedangkan tR benzylmorphine paling lama !
Mengapa eluen mengandung dapar ?

HPLC-3: Pen. Kadar Parasetamol dg Standar Eksternal


KCKT : ODS, asam asetat 0,05
M/asetonitril (90:15), UV 243
nm, 1 ml/men, 25oC,

Lar. Baku
(mg/100 ml)

AUC

0,504

17994

1,009

36109

1,513

54121

2,018

71988

2,522

89984

Hitung kadar mg P/tab dan %


P/tab !!!

Etiket : 500 mg/tablet


Prosedur Lar. Uji :
20 tab ditimbang 12,1891 g
Timbang serbuk setara 125 mg P/250
ml asam asetat 0,05 M 150.5 mg
25 ml filtrat/100 ml 10 ml/100 ml :
lar. uji
Ukur AUC lar. uji AUC = 45205

% thd etiket =
102,5 %

HPLC-4

HPLC-6 : Analisis Kuantitatif Obat dengan KCKT


Standar Internal
Penentuan ethinyl estradiol dg KCKT (FI IV hal. 368)

Sistem KCKT = L1 (C-18), air-asetonitril (1:1), 1 ml/men, UV 280 nm.


Lar. Baku Internal = 0,5 mg/ml etil paraben
Lar. Baku = 10 mg baku + 5 ml LBI/50 ml konsentrasi ?
Lar. Uji = 25 mg BB/25 ml 10, 0 ml + 5,0 ml LBI/50 ml
UKS dg larutan baku Rs 4,5; RSD 2,0 %

Data yang diperoleh :


Baku = 10,2 mg
Sampel = 25,7 mg
Larutan Baku AUCee = 238999
AUCep = 158278
Larutan Uji AUCee = 240142
AUCep = 160098
Hitung kadar bahan baku EE tsb !!!

Terima kasih