Spektrofotometri

Spektrofotometri merupakan salah satu metode dalam kimia analisis yang digunakan
untuk menentukan komposisi suatu sampel baik secara kuantitatif dan kualitatif
yang didasarkan pada interaksi antara materi dengan cahaya. Peralatan yang
digunakan dalam spektrofotometri disebut spektrofotometer. Cahaya yang
dimaksud dapat berupa cahaya visibel, UV dan inframerah, sedangkan materi dapat
berupa atom dan molekul namun yang lebih berperan adalah elektron valensi.
Sinar atau cahaya yang berasal dari sumber tertentu disebut juga sebagai
radiasi elektromagnetik. Radiasi elektromagnetik yang dijumpai dalam kehidupan
sehari-hari adalah cahaya matahari.
Dalam interaksi materi dengan cahaya atau radiasi elektromagnetik, radiasi
elektromagnetik kemungkinanan dihamburkan, diabsorbsi atau dihamburkan
sehingga dikenal adanya spektroskopi hamburan, spektroskopi absorbsi ataupun
spektroskopi emisi.
Pengertian spektroskopi dan spektrofotometri pada dasarnya sama yaitu di
dasarkan pada interaksi antara materi dengan radiasi elektromagnetik. Namun
pengertian spektrofotometri lebih spesifik atau pengertiannya lebih sempit karena
ditunjukan pada interaksi antara materi dengan cahaya (baik yang dilihat maupun
tidak terlihat). Sedangkan pengertian spektroskopi lebih luas misalnya cahaya
maupun medan magnet termasuk gelombang elektromagnetik.
Radiasi elektromagnetik memiliki sifat ganda yang disebut sebagai sifat
dualistik cahaya yaitu:
1) Sebagai gelombang
2) Sebagai partikel-partikel energi yang disebut foton.

Karena sifat tersebut maka beberapa parameter perlu diketahui misalnya

panjang gelombang, frekuensi dan energi tiap foton. Panjang gelombang (l)
didefinisikan sebagai jarak antara dua puncak.

ubungan dari ketiga parameter di atas dirumuskan oleh Planck yang dikenal
denganpersamaan Planck. Hubungan antara panjang gelombang frekuensi dirumuskan
sebagai
c = . v atau = c/v atau v = c/
Persamaan Planck: hubungan antara energi tiap foton dengan frekuensi
E=h.v
E = h . c/
dimana
E = energi tiap foton
h = tetapan Planck (6,626 x 10-34 J.s),
v = frekuensi sinar
c = kecepatan cahaya (3 x 108 m.s-1).
Dari rumus di atas dapat diketahui bahwa energi dan frekuensi suatu foton akan
berbanding terbalik dengan panjang gelombang tetapi energi yang dimiliki suatu
foton akan berbanding lurus dengan
frekuensinya.

Misalnya: energi yang dihasilkan cahaya UV lebih besar dari pada energi
yang dihasilkan sinar tampak. Hal ini disebabkan UV memiliki panjang gelombang ()
yang lebih pendek (100400 nm) dibanding panjang gelombang yang dimiliki sinar
tampak (400800 nm).
Interaksi antara materi dengan cahaya disini adalah terjadi penyerapan cahaya,
baik cahaya Uv, Vis maupun Ir oleh materi sehingga spektrofotometri disebut juga
sebagaispektroskopi absorbsi.
Dari 4 jenis spektrofotometri ini (UV, Vis, UV-Vis dan Ir) memiliki prinsip
kerja yang sama yaitu adanya interaksi antara materi dengan cahaya yang memiliki
panjang gelombang tertentu. Perbedaannya terletak pada panjang gelombang yang
digunakan.
Secara sederhana Instrumen spektrofotometri yang disebut spektrofotometer
terdiri dari :
sumber cahaya monokromator sel sampel detektor read out (pembaca).

Fungsi masing-masing bagian:

1. Sumber sinar polikromatis berfungsi sebagai sumber sinar polikromatis dengan
berbagai macam rentang panjang gelombang. Untuk sepktrofotometer
UV menggunakan lampu deuterium atau disebut juga heavi hidrogen
VIS menggunakan lampu tungsten yang sering disebut lampu wolfram
UV-VIS menggunan photodiode yang telah dilengkapi monokromator.
Infra merah, lampu pada panjang gelombang IR.

2. Monokromator berfungsi sebagai penyeleksi panjang gelombang yaitu mengubah

cahaya yang berasal dari sumber sinar polikromatis menjadi cahaya monaokromatis.
Jenis monokromator yang saat ini banyak digunakan adalan gratting atau lensa
prisma dan filter optik.
Jika digunakan grating maka cahaya akan dirubah menjadi spektrum cahaya.
Sedangkan filter optik berupa lensa berwarna sehingga cahaya yang diteruskan
sesuai dengan warnya lensa yang dikenai cahaya. Ada banyak lensa warna dalam satu
alat yang digunakan sesuai dengan jenis pemeriksaan.
Pada gambar di atas disebut sebagai pendispersi atau penyebar cahaya. dengan
adanya pendispersi hanya satu jenis cahaya atau cahaya dengan panjang gelombang
tunggal yang mengenai sel sampel. Pada gambar di atas hanya cahaya hijau yang
melewati pintu keluar. Proses dispersi atau penyebaran cahaya seperti yang tertera
pada gambar.

3. Sel sampel berfungsi sebagai tempat meletakan sampel

- UV, VIS dan UV-VIS menggunakan kuvet sebagai tempat sampel. Kuvet biasanya
terbuat dari kuarsa atau gelas, namun kuvet dari kuarsa yang terbuat dari silika
memiliki kualitas yang lebih baik. Hal ini disebabkan yang terbuat dari kaca dan
plastik dapat menyerap UV sehingga penggunaannya hanya pada spektrofotometer
sinar tampak (VIS). Cuvet biasanya berbentuk persegi panjang dengan lebar 1 cm.
- IR, untuk sampel cair dan padat (dalam bentuk pasta) biasanya dioleskan pada dua
lempeng natrium klorida. Untuk sampel dalam bentuk larutan dimasukan ke dalam sel
natrium klorida. Sel ini akan dipecahkan untuk mengambil kembali larutan yang
dianalisis, jika sampel yang dimiliki sangat sedikit dan harganya mahal.
4. Detektor berfungsi menangkap cahaya yang diteruskan dari sampel dan
mengubahnya menjadi arus listrik. Syarat-syarat sebuah detektor :

Kepekaan yang tinggi

Perbandingan isyarat atau signal dengan bising tinggi
Respon konstan pada berbagai panjang gelombang.
Waktu respon cepat dan signal minimum tanpa radiasi.
Signal listrik yang dihasilkan harus sebanding dengan tenaga radiasi.

Macam-macam detektor :
Detektor foto (Photo detector)
Photocell, misalnya CdS.
Phototube
Hantaran foto
Dioda foto
Detektor panas
5. Read out merupakan suatu sistem baca yang menangkap besarnya isyarat listrik
yang berasal dari detektor.
Proses Absorbsi Cahaya pada Spektrofotometri
Ketika cahaya dengan panjang berbagai panjang gelombang (cahaya
polikromatis) mengenai suatu zat, maka cahaya dengan panjang gelombang tertentu
saja yang akan diserap. Di dalam suatu molekul yang memegang peranan penting
adalah elektron valensi dari setiap atom yang ada hingga terbentuk suatu materi.
Elektron-elektron yang dimiliki oleh suatu molekul dapat berpindah (eksitasi),
berputar (rotasi) dan bergetar (vibrasi) jika dikenai suatu energi.
Jika zat menyerap cahaya tampak dan UV maka akan terjadi perpindahan
elektron dari keadaan dasar menuju ke keadaan tereksitasi. Perpindahan elektron
ini disebut transisi elektronik. Apabila cahaya yang diserap adalah cahaya
inframerah maka elektron yang ada dalam atom atau elektron ikatan pada suatu
molekul dapat hanya akan bergetar (vibrasi). Sedangkan gerakan berputar elektron
terjadi pada energi yang lebih rendah lagi misalnya pada gelombang radio.

Atas dasar inilah spektrofotometri dirancang untuk mengukur konsentrasi

suatu suatu yang ada dalam suatu sampel. Dimana zat yang ada dalam sel sampel
disinari dengan cahaya yang memiliki panjang gelombang tertentu. Ketika cahaya
mengenai sampel sebagian akan diserap, sebagian akan dihamburkan dan sebagian
lagi akan diteruskan.
Pada spektrofotometri, cahaya datang atau cahaya masuk atau cahaya yang
mengenai permukaan zat dan cahaya setelah melewati zat tidak dapat diukur, yang
dapat diukur adalah It/I0 atau I0/It (perbandingan cahaya datang dengan cahaya
setelah melewati materi (sampel)). Proses penyerapan cahaya oleh suatu zat dapat
digambarkan sebagai berikut:

Gambar Proses penyerapan cahaya oleh zat dalam sel sampel. dari gambar terlihat
bahwa zat sebelum melewati sel sampel lebih terang atau lebih banyak di banding
cahaya setelah melewati sel sampel
Cahaya yang diserap diukur sebagai absorbansi (A) sedangkan cahaya yang
hamburkan diukur sebagai transmitansi (T), dinyatakan dengan hukum lambert-beer
atau Hukum Beer, berbunyi:
jumlah radiasi cahaya tampak (ultraviolet, inframerah dan sebagainya) yang diserap
atau ditransmisikan oleh suatu larutan merupakan suatu fungsi eksponen dari
konsentrasi zat dan tebal larutan.
Berdasarkan hukum Lambert-Beer, rumus yang digunakan untuk
menghitung banyaknya cahaya yang hamburkan:

dan absorbansi dinyatakan dengan rumus:

dimana I0 merupakan intensitas cahaya datang dan It atau I1 adalah intensitas

cahaya setelah melewati sampel.
Rumus yang diturunkan dari Hukum Beer dapat ditulis sebagai:
A= a . b . c atau A = . b . c
dimana:
A = absorbansi
b atau terkadang digunakan l = tebal larutan (tebal kuvet diperhitungkan juga
umumnya 1 cm)
c = konsentrasi larutan yang diukur
= tetapan absorptivitas molar (jika konsentrasi larutan yang diukur dalam molar)
a = tetapan absorptivitas (jika konsentrasi larutan yang diukur dalam ppm).
Secara eksperimen hukum Lambert-beer akan terpenuhi apabila peralatan
yang digunakan memenuhi kriteria-kriteria berikut:
Sinar yang masuk atau sinar yang mengenai sel sampel berupa sinar dengan dengan
panjang gelombang tunggal (monokromatis).
Penyerapan sinar oleh suatu molekul yang ada di dalam larutan tidak dipengaruhi
oleh molekul yang lain yang ada bersama dalam satu larutan.
Penyerapan terjadi di dalam volume larutan yang luas penampang (tebal kuvet) yang
sama.
Penyerapan tidak menghasilkan pemancaran sinar pendafluor. Artinya larutan yang
diukur harus benar-benar jernih agar tidak terjadi hamburan cahaya oleh partikelpartikel koloid atau suspensi yang ada di dalam larutan.
Konsentrasi analit rendah. Karena apabila konsentrasi tinggi akan menggangu
kelinearan grafik absorbansi versus konsntrasi.

Faktor-faktor yang sering menyebabkan kesalahan dalam menggunakan

spektrofotometer dalam mengukur konsentrasi suatu analit:
Adanya serapan oleh pelarut. Hal ini dapat diatasi dengan penggunaan blangko, yaitu
larutan yang berisi selain komponen yang akan dianalisis termasuk zat pembentuk
warna.
Serapan oleh kuvet. Kuvet yang ada biasanya dari bahan gelas atau kuarsa, namun
kuvet dari kuarsa memiliki kualitas yang lebih baik.
Kesalahan fotometrik normal pada pengukuran dengan absorbansi sangat rendah
atau sangat tinggi, hal ini dapat diatur dengan pengaturan konsentrasi, sesuai
dengan kisaran sensitivitas dari alat yang digunakan (melalui pengenceran atau
pemekatan).
Spektrum UV, VIS, UV-VIS dan IR
Data-data yang dikeluarkan oleh UV atau VIS dapat berupa absorbansi atau
transmitansi yang langsung dibaca pada spektrofotometer. Namun untuk UV, VIS,
UV-VIS dan IR data yang dikeluarkan dapat berupa spektrum jika telah
dihubungkan dengan komputer.
Spektrum yang dikeluarkan oleh UV, VIS dan UV-VIS berupa pita yang lebar
sedangkan pada pita yang dikeluarkan oleh IR berupa garis atau puncak tajam.
Pita melebar dari UV-VIS disebabkan karena energi yang dimiliki selain
menyebabkan transisi elektronik terjadi pula rotasi dan vibrasi elektron dalam
molekul. Sedangkan pada IR hanya terjadi vibrasi elektron maka spektrum yang
dihasilkan berupa garis atau puncak tajam. Selain pada IR, spektrum berupa garis
dapat terjadi pula pada spektroskopi NMR karena hanya terjadi rotasi elektron.
Spektrum yang dihasilkan dari setiap spektroskopi berbeda antara satu
dengan yang lainnya. Para kimiawan spektrum UV, VIS maupun IR dapat dibedakan
dengan mudah. Spektrum yang dihasilkan oleh UV, VIS dan UV-VIS tidak berbeda
jauh namun sangat sangat berbeda bila dibanding spektrum IR. Untuk
membedakannya dapat dilihat pada gambar:

Gambar spektrum UV. Namun spektrum dari spektrofotometer VIS dan UV-VIS
menyerupai spektrum UV

Gambar spektrum IR. Pita tertinggi mengarah ke bawah sedangkan pada UV pita
yang paling tinggi mengarah ke atas hal ini disebabkan spektrofotometer IR ditulis
dalam bentung bilangan gelombang
Spektrofotometri visible disebut juga spektrofotometri sinar tampak. Yang
dimaksud sinar tampak adalah sinar yang dapat dilihat oleh mata manusia. Cahaya
yang dapat dilihat oleh mata manusia adalah cahaya dengan panjang gelombang 400800 nm dan memiliki energi sebesar 299149 kJ/mol.
Elektron pada keadaan normal atau berada pada kulit atom dengan energi
terendah disebut keadaan dasar (ground-state). Energi yang dimiliki sinar tampak
mampu membuat elektron tereksitasi dari keadaan dasar menuju kulit atom yang
memiliki energi lebih tinggi atau menuju keadaan tereksitasi.
Cahaya yang diserap oleh suatu zat berbeda dengan cahaya yang ditangkap
oleh mata manusia. Cahaya yang tampak atau cahaya yang dilihat dalam kehidupan
sehari-hari disebut warna komplementer. Misalnya suatu zat akan berwarna orange
bila menyerap warna biru dari spektrum sinar tampak dan suatu zat akan berwarna
hitam bila menyerap semua warna yang terdapat pada spektrum sinar tampak. Untuk
lebih jelasnya perhatikan tabel berikut.

Panjang
gelombang (nm)

Warna warna yang

diserap

Warna komplementer
(warna yang terlihat)

400 435

Ungu

Hijau kekuningan

435 480

Biru

Kuning

480 490

Biru kehijauan

Jingga

490 500

Hijau kebiruan

Merah

500 560

Hijau

Ungu kemerahan

560 580

Hijau kekuningan

Ungu

580 595

Kuning

Biru

595 610

Jingga

Biru kehijauan

610 800

Merah

Hijau kebiruan

Pada spektrofotometer sinar tampak, sumber cahaya biasanya menggunakan

lampu tungsten yang sering disebut lampu wolfram. Wolfram merupakan salah satu
unsur kimia, dalam tabel periodik unsur wolfram termasuk golongan unsur transisi
tepatnya golongan VIB atau golongan 6 dengan simbol W dan nomor atom 74.
Wolfram digunakan sebagai lampu pada spektrofotometri tidak terlepas dari
sifatnya yang memiliki titik didih yang sangat tinggi yakni 5930 C.

Gambar 2 jenis spektronic-20 yang bekerja pada rentang panjang gelombang sinar
tanpak. Gambar atas merupakan spectronic-20 lama yang sudah jarang bahkan
mungkin tidak diproduksi lagi. Sedangkan gambar kedua adalah spectronic-20
terbaru.
Panjang gelombang yang digunakan untuk melakukan analisis adalah panjang
gelombang dimana suatu zat memberikan penyerapan paling tinggi yang disebut
maks. Hal ini disebabkan jika pengukuran dilakukan pada panjang gelombang yang
sama, maka data yang diperoleh makin akurat atau kesalahan yang muncul makin
kecil.
Berdasarkan hukum Beer absorbansi akan berbanding lurus dengan
konsentrasi, karena b atau l harganya 1 cm dapat diabaikan dan merupakan suatu
tetapan. Artinya konsentrasi makin tinggi maka absorbansi yang dihasilkan makin
tinggi, begitupun sebaliknya konsentrasi makin rendah absorbansi yang dihasilkan
makin rendah. (Hukum Lamber-Beer dan syarat peralatan yang digunakan agar
terpenuhi hukum Lambert-Beer
Hubungan antara absorbansi terhadap konsentrasi akan linear (AC) apabila nilai
absorbansi larutan antara 0,2-0,8 (0,2 A 0,8) atau sering disebut sebagai daerah
berlaku hukum Lambert-Beer. Jika absorbansi yang diperoleh lebih besar maka
hubungan absorbansi tidak linear lagi. Kurva kalibarasi hubungan antara absorbansi
versus konsentrasi dapat dilihat pada Gambar.

Gambar Kurva hubungan absorbansi vs konsentrasi

Faktor-faktor yang menyebabkan absorbansi vs konsentrasi tidak linear:
Adanya serapan oleh pelarut. Hal ini dapat diatasi dengan penggunaan blangko, yaitu
larutan yang berisi selain komponen yang akan dianalisis termasuk zat pembentuk
warna.

Serapan oleh kuvet. Kuvet yang ada biasanya dari bahan gelas atau kuarsa, namun
kuvet dari kuarsa memiliki kualitas yang lebih baik.
Kesalahan fotometrik normal pada pengukuran dengan absorbansi sangat rendah
atau sangat tinggi, hal ini dapat diatur dengan pengaturan konsentrasi, sesuai
dengan kisaran sensitivitas dari alat yang digunakan (melalui pengenceran atau
pemekatan).
Zat yang dapat dianalisis menggunakan spektrofotometri sinar tampak adalah
zat dalam bentuk larutan dan zat tersebut harus tampak berwarna, sehingga
analisis yang didasarkan pada pembentukan larutan berwarna disebut juga metode
kolorimetri.
Jika tidak berwarna maka larutan tersebut harus dijadikan berwarna dengan
cara memberi reagen tertentu yang spesifik. Dikatakan spesifik karena hanya
bereaksi dengan spesi yang akan dianalisis. Reagen ini disebut reagen pembentuk
warna (chromogenik reagent). Berikut adalah sifat-sifat yang harus dimiliki oleh
reagen pembentuk warna:
Kestabilan dalam larutan. Pereaksi-pereaksi yang berubah sifatnya dalam waktu
beberapa jam, dapat menyebabkan timbulnya semacam cendawan bila disimpan. Oleh
sebab itu harus dibuat baru dan kurva kalibarasi yang baru harus dibuat saat setiap
kali analisis.
Pembentukan warna yang dianalisis harus cepat.
Reaksi dengan komponen yang dianalisa harus berlangsung secara stoikiometrik.
Pereaksi tidak boleh menyerap cahaya dalam spektrum dimana dilakukan
pengukuran.
Pereaksi harus selektif dan spesifik (khas) untuk komponen yang dianalisa, sehingga
warna yang terjadi benar-benar merupakan ukuran bagi komponen tersebut saja.
Tidak boleh ada gangguan-gangguan dari komponen-komponen lain dalam larutan
yang dapat mengubah zat pereaksi atau komponen komponen yang dianalisa menjadi
suatu bentuk atau kompleks yang tidak berwarna, sehingga pembentukan warna yang
dikehandaki tidak sempurna.
Pereaksi yang dipakai harus dapat menimbulkan hasil reaksi berwarna yang
dikehendaki dengan komponen yang dianalisa, dalam pelarut yang dipakai.

Setelah ditambahkan reagen atau zat pembentuk warna maka larutan

tersebut harus memiliki lima sifat di bawah ini:
Kestabilan warna yang cukup lama guna memungkinkan pengukuran absorbansi
dengan teliti. Ketidakstabilan, yang mengakibatkan menyusutnya warna larutan
(fading), disebabkan oleh oksidasi oleh udara, penguraian secara fotokimia,
pengaruh keasaman, suhu dan jenis pelarut. Namun kadang-kadang dengan mengubah
kondisi larutan dapat diperoleh kestabilan yang lebih baik.
Warna larutan yang akan diukur harus mempunyai intensitas yang cukup tinggi
(warna harus cukup tua) yang berarti bahwa absortivitas molarnya () besar. Hal ini
dapat dikontrol dengan mengubah pelarutnya. Dalam hal ini dengan memilih pereaksi
yang memiliki kepekaan yang cukup tinggi.
Warna larutan yang diukur sebaiknya bebas daripada pengaruh variasi-variasi kecil
kecil dalam nilai pH, suhu maupun kondisis-kondisi yang lain.
Hasil reaksi yang berwarna ini harus larut dalam pelarut yang dipakai.
Sistem yang berwarna ini harus memenuhi Hukum Lambert-Beer.

Menentukan konsentrasi sampel dengan cara kurva kalibrasi

Konsentrasi sampel dalam suatu larutan dapat ditentukan dengan rumus yang
diturunkan dari hukum lambert beer (A= a . b . c atau A = . b . c). Namun ada cara
lain yang dapat digunakan untuk menentukan konsentrasi suatu spesi yang ada dalam
suatu larutan yakni dengan cara kurva kalibarasi. Cara ini sebenarnya masih tetap
bertumpu pada hukum Lambert-Beer yakni absorbansi berbanding lurus dengan
konsentrasi.
Langkah-langkah yang perlu dilakukan dalam penentuan konsentrasi zat
dengan kurva kalibarasi:
Maching kuvet : mencari dua buah kuvet yang memiliki absorbansi atau transmitansi
sama atau hampir sama. Dua buah kuvet inilah yang akan digunakan untuk analisis,
satu untuk blanko, satu untuk sampel. Dalam melakukan analisis Maching kuvet harus
dilakukan agar kesalahannya makin kecil.
Membuat larutan standar pada berbagai konsentrasi. Larutan standar yaitu larutan
yang konsentrasinya telah diketahui secara pasti. Konsentrasi larutan standar

dibuat dari yang lebih kecil sampai lebih besar dari konsentrasi analit yang
diperkirakan.
Ambilah salah satu larutan standar, kemudian ukur pada berbagai panjang
gelombang. Hal ini dilakukan untuk mengetahui pada panjang gelombang berapa,
absorbansi yang dihasilkan paling besar. Panjang gelombang yang menghasilkan
absorbansi paling besar atau paling tinggi disebut panjang gelombang maksimum
(lmaks).
Ukurlah absorbansi semua larutan standar yang telah dibuat pada panjang
gelombang maksimum.
Catat absorbansi yang dihasilkan dari semua larutan standar, kemudian alurkan pada
grafik absorbansi vs konsentrasi sehingga diperoleh suatu kurva yang
disebutkurva kalibarasi. Dari hukum Lambart-Beer jika absorbansi yang dihasilkan
berkisar antara 0,2-0,8 maka grafik akan berbentuk garis lurus, namun hal ini tidak
dapat dipastikan.
Misalkan absorbansi yang dihasilkan dari larutan standar yang telah dibuat adalah
Absorbansi
(ABS)

0,2

konsentras
i
2
(ppm)

0,3

0,4

0,5

0,6

10

0,7

0,8

12

14

0,9

16

Grafiknya adalah

6. Ukurlah absorbansi larutan yang belum diketahui konsentrasinya. Setelah

diperoleh absorbansinya, masukan nilai tersebut pada grafik yang diperoleh pada
langkah 5. Misalkan absorbansi yang diperoleh 0,6. Maka jika ditarik garis lurus

konsentrasi sampel akan sama dengan konsentrasi larutan standar 10 ppm. Maka
grafiknya sebagai berikut:

Selain dengan cara diatas konsentrasi sampel dapat dihitung dengan persamaan
regresi linear:

persamaan di atas dapat dihitung dengan bantuan kalkulator. Setelah diperoleh

persamaan di atas, absorbansi sampel yang diperoleh dimasukan sebagai nila y
sehingga diperoleh nila x. Nilai x yang diperoleh merupakan konsentrasi sampel yang
dianalisis.
Spektrofotometri terdiri dari beberapa jenis berdasar sumber cahaya yang
digunakan. Diantaranya adalah sebagai berikut:
1. Spektrofotometri Vis (Visible)
2. Spektrofotometri UV (Ultra Violet)
3. Spektrofotometri UV-Vis
4. Spektrofotometri IR (Infra Red)
1. Spektrofotometri Visible (Spektro Vis)

Pada spektrofotometri ini yang digunakan sebagai sumber sinar/energi adalah

cahaya tampak (visible). Cahaya visible termasuk spektrum elektromagnetik yang
dapat ditangkap oleh mata manusia. Panjang gelombang sinar tampak adalah 380
sampai 750 nm. Sehingga semua sinar yang dapat dilihat oleh kita, entah itu putih,
merah, biru, hijau, apapun.. selama ia dapat dilihat oleh mata, maka sinar tersebut
termasuk ke dalam sinar tampak (visible).
Sumber sinar tampak yang umumnya dipakai pada spektro visible adalah lampu
Tungsten. Tungsten yang dikenal juga dengan nama Wolfram merupakan unsur kimia
dengan simbol W dan no atom 74. Tungsten mempunyai titik didih yang tertinggi

(3422 C) dibanding logam lainnya. karena sifat inilah maka ia digunakan sebagai
sumber lampu.
Sample yang dapat dianalisa dengan metode ini hanya sample yang memilii warna. Hal
ini menjadi kelemahan tersendiri dari metode spektrofotometri visible.
Oleh karena itu, untuk sample yang tidak memiliki warna harus terlebih dulu dibuat
berwarna dengan menggunakan reagent spesifik yang akan menghasilkan senyawa
berwarna. Reagent yang digunakan harus betul-betul spesifik hanya bereaksi dengan
analat yang akan dianalisa. Selain itu juga produk senyawa berwarna yang dihasilkan
harus benar-benar stabil.
Salah satu contohnya adalah pada analisa kadar protein terlarut (soluble protein).
Protein terlarut dalam larutan tidak memiliki warna. Oleh karena itu, larutan ini
harus dibuat berwarna agar dapat dianalisa. Reagent yang biasa digunakan adalah
reagent Folin.
Saat protein terlarut direaksikan dengan Folin dalam suasana sedikit basa, ikatan
peptide pada protein akan membentuk senyawa kompleks yang berwarna biru yang
dapat dideteksi pada panjang gelombang sekitar 578 nm. Semakin tinggi intensitas
warna biru menandakan banyaknya senyawa kompleks yang terbentuk yang berarti
semakin besar konsentrasi protein terlarut dalam sample.
2. Spektrofotometri UV (ultraviolet)

Berbeda dengan spektrofotometri visible, pada spektrofotometri

UV berdasarkan interaksi sample dengan sinar UV. Sinar UV memiliki panjang
gelombang 190-380 nm. Sebagai sumber sinar dapat digunakan lampu deuterium.
Deuterium disebut juga heavy hidrogen. Dia merupakan isotop hidrogen yang stabil
yang terdapat berlimpah di laut dan daratan. Inti atom deuterium mempunyai satu
proton dan satu neutron, sementara hidrogen hanya memiliki satu proton dan tidak
memiliki neutron. Nama deuterium diambil dari bahasa Yunani, deuteros, yang
berarti dua, mengacu pada intinya yang memiliki dua pertikel.
Karena sinar UV tidak dapat dideteksi oleh mata kita, maka senyawa yang dapat
menyerap sinar ini terkadang merupakan senyawa yang tidak memiliki warna. Bening
dan transparan.

Oleh karena itu, sample tidak berwarna tidak perlu dibuat berwarna dengan
penambahan reagent tertentu. Bahkan sample dapat langsung dianalisa meskipun
tanpa preparasi. Namun perlu diingat, sample keruh tetap harus dibuat jernih
dengan filtrasi atau centrifugasi. Prinsip dasar pada spektrofotometri adalah
sample harus jernih dan larut sempurna. Tidak ada partikel koloid apalagi suspensi.
Sebagai contoh pada analisa protein terlarut (soluble protein). Jika menggunakan
spektrofotometri visible, sample terlebih dulu dibuat berwarna dengan reagent
Folin, maka bila menggunakan spektrofotometri UV, sample dapat langsung dianalisa.
Ikatan peptide pada protein terlarut akan menyerap sinar UV pada panjang
gelombang sekitar 280 nm. Sehingga semakin banyak sinar yang diserap sample
(Absorbansi tinggi), maka konsentrasi protein terlarut semakin besar.
Spektrofotometri UV memang lebih simple dan mudah dibanding spektrofotometri
visible, terutama pada bagian preparasi sample. Namun harus hati-hati juga, karena
banyak kemungkinan terjadi interferensi dari senyawa lain selain analat yang juga
menyerap pada panjang gelombang UV. Hal ini berpotensi menimbulkan bias pada
hasil analisa.
3. Spektrofotometri UV-Vis
Spektrofotometri ini merupakan gabungan antara spektrofotometri UV dan Visible.
Menggunakan dua buah sumber cahaya berbeda, sumber cahaya UV dan sumber
cahaya visible. Meskipun untuk alat yang lebih canggih sudah menggunakan hanya
satu sumber sinar sebagai sumber UV dan Vis, yaitu photodiode yang dilengkapi
dengan monokromator.
Untuk sistem spektrofotometri, UV-Vis paling banyak tersedia dan paling populer
digunakan. Kemudahan metode ini adalah dapat digunakan baik untuk sample
berwarna juga untuk sample tak berwarna.
4. Spektrofotometri IR (Infra Red)

Dari namanya sudah bisa dimengerti bahwa spektrofotometri

ini berdasar pada penyerapan panjang gelombang infra merah. Cahaya infra merah
terbagi menjadi infra merah dekat, pertengahan, dan jauh. Infra merah pada

spektrofotometri adalah infra merah jauh dan pertengahan yang mempunyai

panjang gelombang 2.5-1000 m.
Pada spektro IR meskipun bisa digunakan untuk analisa kuantitatif, namun biasanya
lebih kepada analisa kualitatif. Umumnya spektro IR digunakan untuk
mengidentifikasi gugus fungsi pada suatu senyawa, terutama senyawa organik.
Setiap serapan pada panjang gelombang tertentu menggambarkan adanya suatu
gugus fungsi spesifik.

Hasil analisa biasanya berupa signal kromatogram hubungan intensitas IR terhadap

panjang gelombang. Untuk identifikasi, signal sample akan dibandingkan dengan
signal standard. Perlu juga diketahui bahwa sample untuk metode ini harus dalam
bentuk murni. Karena bila tidak, gangguan dari gugus fungsi kontaminan akan
mengganggu signal kurva yang diperoleh.
Terdapat juga satu jenis spektrofotometri IR lainnya yang berdasar pada
penyerapan sinar IR pendek. Spektrofotometri ini di sebut Near Infrared
Spectropgotometry (NIR). Aplikasi NIR banyak digunakan pada industri pakan dan
pangan guna analisa bahan baku yang bersifat rutin dan cepat.

contoh contoh alat spektro