Anda di halaman 1dari 12

BLOK MEDIKOLEGAL

PENUGASAN PRAKTIKUM
BIOKIMIA

Disusun oleh
Nama

: Jondra Widodo

Nim

: 10711142

kelompok

:B

FAKULTAS KEDOKTERAN
UNIVERSITAS ISLAM INDONESIA
YOGYAKARTA
2013

Pendahuluan
Isolasi DNA merupakan salah satu pemeriksaan yang digunakan dalam
ilmu forensic. Isolasi DNA dapat dilakukan dengan cara pemisahan DNA dari
molekul-molekul lain yang terdapat dalam inti sel. Prinsip yang digunakan dalam
pemisahan DNA dengan molekul salah satunya dengan melakukan sentrifugasi.
Teknik sentrifugasi mempunyai mekanisme

pemisahan DNA campuran

berdasarkan berat masing-masing molekul dengan komponennya, dimana molekul


yang memiliki berat yang lebih besar akan berada di bagian bawah pada tabung
sedangkan molekul yang ringan akan berada pada bagian atas tabung. Dari teknik
sentrifugasi akan diperoleh dua macam fraksi yang terpisah secara jelas, yaitu
pada bagian atas terlihat supernatan dan bagian bawah terlihat pelet.
Isolasi DNA yang dilakukan dengan cara

teknik sentrifugasi akan

menghasilkan endapkan DNA. Hasil isolasi DNA murni tersebut nanti tidak akan
tercampur bersama molekul-molekul yang lainnya, karena di dalam proses isolasi
tersebut akan ditambahkan berbagai macam larutan diantaranya adalah Larutan A
yang berfungsi sebagai resuspensi. Resuspensi disini merupakan penggabungan
kembali pelet yang sudah terbentuk bersama larutan yang dicampurkan. Selain itu
larutan A juga memiliki fungsi sebagai buffer dan juga sebagai pengkelat.
Pemilihan buffer tersebut dapat dilihat berdasarkan kemampuan dari buffer yang
menghasilhkan arus listrik. Sedangkan Larutan B yang terdiri dari SDS dan NaOH
berfungsi untuk larutan pelisis. Sedangkan

NaOH dapat berfungsi

sebagai

pendenaturasi protein. Dan larutan C fungsinya juga sebagai pendenaturasi protein


kembali. Kemudian larutan Etanol 70% digunakan sebagai pengeluaran endapan
dari garam karena Na+ memiliki muatan positif sedangkan DNA memiliki muatan
negatif. Larutan vortex digunakan untuk memudahkan bakteri menjadi
tersuspensi. Bakteri yang sudah diendapkan nanti akan mengalami lisis dengan
ditambahkan larutan buffer. Untuk mendapatkan proses penlisisan bakteri yang
sempurna maka larutan dibolak-balik dengan kuat . Bakteri yang telah mengalami
lisis akan ditandai dengan terlihatnya adanya lendir. Kemudian Cairan DNA yang
dihasilkan dapat dipisahkan dari endapannya. Cairan DNA ini akan ditambahkan

dengan RNase dengan tujuan untuk melisiskan RNA supaya hasil yang diisolasi
nantinya berupa DNA yang murni.
Tujuan Penulisan
Penulisan ini bertujuan untuk meresume kembali mengenai berbagai
macam metode-metode yang dilakukan dalam isolasi DNA. Dengan harapan yang
sangat besar untuk menambah ilmu dan pengetahuan penulis mengenai berbagai
metode-metode dalam melakukan isolasi DNA secara jelas serta mengetahui
perbedaan-perbedaan pada setiap metode yang dilakukan dalam isolasi DNA.
Pembahasan
DNA merupakan asam nukleat yg terdapat pada bagian dalam & bagian
luar dari inti sel (nukleuis). DNA memilik fungsi secara umum didalam sel
sebagai materi genetik, yang arti nya adalah DNA dapat menyimmpan blueprint
bagi setiap aktifitas sel & mngendalikan fungsi biologis secara seluler. Materi
genetik tersbut merupakan suatru faktor pembawa sifat organisme yaitru gen.
DNAa ada dapat ditemukan di nukleus, mitokondria & kloroplas dari sebuah
organ manusia. Diman dari setiap DNA yang dperoleh baik dari nukleus,
mitokondriakloroplas memiliki perbedaan struktural maupun bentuk. DNA
nukleus memiliki bentuk lini dan berasosiasi dengan protein histon DNA
Mitokondria & kloroplas bentuknya sirkuler tidak berasossiasi dengan protein
histonSelain itu DNA mitokondria dan kloroplas memiliki ciri khas yaitu hanta
meqarisi sifat yang berasal dari garis ibu, sedangkn DNA yang berasal dari
nukleus yang memiliki ppola pewarisan sifat kedua orang tuanya. dari
organismenya struktur DNA prokariot deda dengan struktur DNA eukariot &
DNA prokariot tidak punyas protein histon bentuk sirkular. Kmudian DNA
eukariot punya bentuk linier dn memiliki protein histon. DNA adalah
makromolekul dengan fungsi penting pada jasad hidup. DNA merupakan polimer
asam nukleat dengan susunan sistematis dan meembawa informasi genetik yang
diturunkan(1).
DNA berupa pilinan ganda antiparalel dengan komponen komponen
seperti gula pentosa, gugus fosfat juga pasangan basa, pasangn basa DNA terdiri

dari dua macam; basa purin & pirimidin. Basa purin adalah adenin & guanin
dengan struktur cicin ganda, basa pirimidin terdiri dari sitosin & timin yang terdiri
dari struktur cincin tunggal. Adenin yang terikat dg timin hanya membentuk dua
ikatan hidrogen, satu komponen building block DNA terdiri dari 1 gula pentosa, 1
gugus fosfat serta 1 pasang basa yang dikenal dengan nukleotida. Satu sel dengan
DNA materi genetik punya sifat herediter di semua sitem kehidupan. Berikutnya
genom itu menjadddi sel lengmap dari materi genetik yang ada pada satu
orrrganisem yang terorganisasi dalam kromosom.
DNA dapat diisolasi baik dari manusia hewan/tumbuhan bisa di isolasi
daridarah,yang kita tahu darah manusia itu kan terdiri dari plasmaglobulus
lemak,kimia substansi/ substansi kimia (ptotein, karbohidrat dan juga hormon)
oksigen, karbon dioksida, nitrogen, dan plasma darah sendiri terdiri dari eritrosit
& leukosit atau sel darah putih dan juga trombosit atau platelet, kemudian
darah/komponenkomponen darah yang diisolasi mempunyai DNA. Ditumbuhan
DNA dapat diisolasi misal tamanaman bawang merah, pisangg. pada manusia
DNA ada didalam nukleos om sedangkan nukleosom sendiri ada dalam
kromnatin, llalu kromatik sendiri ada dalam kromosom.
Isolasi DNA menjadi proses pemisahan molekul DNA dari molekulmolekul lain diinti sel. Prinsip isolasi DNA adalah melisiskan selmemisahkan
DNA dari protein, mengendapkan DNA, mlelarutkan kembali DNA, menghitung
jumlah DNA yang diperoleh serta menilai kemurnian DNA. Selanjutnya dengan
presitasi garam, DNA genom dipisahkan dari protein plasma dan inti. Akhirnya
DNA genom diisolasi dengan presipitasi dengan alkohol dan pelarutan kembali
endapan yang terbentuk dari larutan dapar yang mengandung suatu bahan
pengawet DNA. Hasil isolasi DNA dikatakan baik jika didapatkan DNA yang
murni dan utuh(2).
Terdapat 3 tahap dasar & 2 tahapan lanjutan dalam prosedur isolasi DNA
ini, yaitu preparasi ekstraks DNA perusakan dinding sel & penghancuran
membran sel serta pemurnian DNA & presipitasi DNA juga serta pemisahan
terhadap protein dengan protease juga RNA (dengan RNAse). dari ssetiap maksud
penggunaan DNA yg beragam membutuhkan persyararan kuwalitas DNA yang

berbeda. Kualitas DNA terseut ditentukan dengan hal-hal berikut ntaranya


kemurnian DNA, panjaang DNA, dan juga bisa dipotong oleh enzim apapun,
tidak mengalami modifikasi selama proses isolasi itu terjadi. Oleh karena itu ada
bebrapa teknik isolasi DNA yang disesuaikan sama penggunaan dn kualitas yang
ingain didapatkan atau ingin dicapa.
Sampel yang dapat digunakan untuk isolasi DNA antara lain:
1. whhole blood (leukosit : buffer coart) diambil leukositnya sebelum itu
eritrositnya itu dilisiskan dengan lisi buffer (EBL = erythrocyte lisi
buffer) paling sering digunakan 3-5 ml darah fresh cukup banyak
menghasilkan DNA.
2. jaringan biopsi atau reseksi (otot, usus dll) sebelum ekstraksi lebih
dulu di inkubasi untuk menghancurkan jaringan ikat.
3. amnioticfluid atau villi choriales untuk kepentingan pre natal
diagnosis, di mana jumlah DNA yang di peroleh sangat sedikit.
4. jaringan lainnya digunakan untuk kpentingan forensik, jaringan rusak
atau membusuk/terbakar, folikel rambut,kuku, tulang & lain-lain.
Bahan2 yang digunakan dalm praktikum isolasi DNA ini adalah :
1. TNES urea
Karakteristi bahan ini brbahaya karena bisa menyebabkan iritasi
berfungsi untuk melisiskan membrane sel
2. Proteinase
Karakteristik bahan ini adalah bersifat katalisator. Berfungsi sebagai
enzim yang dapat mendegradasi proteinn.
3. RNAse
Karakteristiknya adalah sebaga ikatalisator dan fungsinya adalah
sebagai enzim yang dapat mendegradsasi RNA
4. PCIAA (Phenol ChlorofomIsoamyl Alcohol)
Karakteristik itu bersifast korosif kuat sehingga harus hindarkan
dengan kontak kulit, sebsab apabila terjasdi atau kontak langsung
dengan kulit akan menimbulkan luka bakar dgengan cepat, mudah
larut dalam methanol, dietileter, airdingin, air panas, danaseton, dan
juga sensitive terhadap cahdaya dan berubah warna saat terkena

cahaya, serta bersifat reaktif dengan agen pengoksidasi, logam, alkali,


dan asam. Penyimpanan senyawa ini pada suhu 2 sampai 80C
Fungsinya untukk memisahkan komponen lipid dan polisakarida dari
larutan
5. Etanolabsolut
Karakteristik : disebut juga etanol anhidfrat, berupa cairan tidak
berwarna, titik didih 16, 60C, bersifat mudah terbakar danqq menguap.
Bersifat qbahaya karena menyebabkan iritasi kulitt & saluran
pernafasan, kerusakan gianjaldanjantung, gangguanvfertilitas, &
depresi system sarafpusat, juga menyebabkan efek mutagenik
(karsinogenik). Penyimpanana di baw ah suhu 230C, wadah tertutup
rapat, berventilasi baik dan sejuk, serta hindarkan dari percikan api.
Fungsinya untuk presipitasi dnas.
6. Etanol 70%
Karakteristik : berupa cairan tidak berwarna, bau alkohol, mudah
terbakar pada fase cair/uap, sehingga mudah menguap. Dapat
menyebabkan gangguan pernafasan, system saraf pusa tdepresi,
menyebabkan

gangguan

mata,

krusakan

ginjal

dan

jantung,

menyebabkan sianosis, & penyebab iritasi gastrointestinal seperti


muntah dan mual. Penyimpanannya hindarkan dari percikan api,
simpan di tempat sejuk dan kering, dan jauhkan dari bahanbahan
pengoksidasi. Fungsinya untuk purfikasi DNA
7. TE (Tris-EDTA)
Karakteristik : Disebut pula trometamin, berupa

larutan tidak

berwarna dan tidak berbau atau berupa bubuk kristal putih. Dapat
menyebabkan iritasi kulit, saluran pernafasan, dan mata.Penyimpanan
di wadah tertutup, sejuk, kering, ventifasi baik, jauhkan dari sumber
api dan bahan oksidator. Fungsinyasebaaipelarut DNA atau RNA
8.

Sodium Asetat
Karakteristik dan fungsi : sebagai senawa berbentuk larutan untuk
presipitasi yakni mengendapkan DNA

9. Buffer Ekstraks

Karakteristik an fungsi : untuk melisiskan membrane sel dan


membrane fosfolipid bilayers
Isolasi DNA dari sampel biolgis merupakan langkah penting dalam proses
tes biologi molekular berbasis DNA. DNA yang diekstrksi dari jaringan tanaman
atau hewan atau dari bakteri, harus urni atau bebas dari kontaminan protein,
karbohidrat) untuk digunakan dalam bebagai aplikasi dalam biologi molekular
termasuk PCR, genotip, sekuensing DNA, dll

(3)

. Bberapa metode untuk Isolasi

DNA memiliki teknik, alat & bahan yang berbeda-beda. Metode tersebut antara
lain :
1. RAPD atau Teknik Random Amplified Polymorphic DNA
Teknik pengujian polimorfisme DNA itu sendiri berdasarkan pada
amplifikasi dari segmen-segmen DNA secara acak yang menggunakan
primer tunggal yang sekuen nukleotidanya ditentukan dengan acak dimana
Primer tunggal ini biasanya berukuran 10 basa. selanjutnya PCR sendiri
dilakukan pada suhu anealing yang cukup rendah yang memungkinkan
primer untuk menempel pada beberapa lokus pada DNA. dimana aturan
sederhana untuk prier adalah terdiri dari 18-28 susunan basa dengan
persentasenya itu adalah G+C 50-60%.
2. Metode Salting Outh
Salting out merupakan metode yang digunakan untuk memisahkan protein
yang didasarkan padka prinsip bahwa protein kurang terlarut ketika berada
pada daerah yang konsentrasi kadar garamnya tinggi. Konsentrasi garam
diibutuhkan oleh proetein untuk mempercepat keluarnya larutan yang
berbeda dari protein satu ke protein yang lainya(4).

3. Silica Gely
Silica gel dapat mengikat DNA dengan perantaraan garam/buffer tertentu
(NaI), Cepfat, tetapi recovery DNA kurang. Metode silica merupakan

proses ekstraksi asam nukleat adalah dengan melakukan perubahan kimia


pada matriks silika sehingga akan secara spesifik berikatan dengan protein
atau polisakarida (prosesnya berkebalikan dengan penjelasan sebelumnya).
Ekstraksi asam nukleat berbasis silika ini telah menjadi dasar metode
ekstraksi asam nukleat kit komersial. Matriks silika dalam kit komersial
tersebut dapat ditemukan dalam berbagai bentuk, seperti filter (spin
column), gel (glassmilk, silica gel), suspensi (celite, plain-coarse silicate),
bahkan partikel berselubung magnetik (Dynabeads). Filtrasi, sentrifugasi,
atau penggulnaan magnet memungkinkan pemisahan asam nukleat yang
berikatan dengan silika dari kontaminasi lemak, karbohidrat dan protein
melalui langkah pembilasan yang multipel. Metode ini juga mendasari
pembuatan alfat ekstraksi asam nukleat.

4. Metode CTAoB (cetyltrimetilammonium bromide)


CTAB merupakan sejenis deterjen yang dapat mendegradasi dinding sel,
denaturasi protein, memisahkan karbohidrat, merusak membran sel dan
melarutkan DNA. Apabila dinding sel terdegradasi maka semua isi sel
dapat keluar termasuk DNA dan dilepaskan ke dalam buffer ekstraksi.
Menghasilkan rpita DNA yang berukuran tebal dan dapat memisahkan
DNA dari polisakarida karena adanya perbedaan karakteristik kelarutan
(differensial of solubility). Disamping diperoleh fragmen DNA, dengan
metode CTAB 6juga akan diperoleh RNA dengan pita tipis yang terletak
jauh berada di bawah pita DNA. Keberadaan pita RNA tergantung bahan
yang diekstraksi.s Metode ini tidak membutuhkan biaya yang lebih mahal
dibandingkan denkgan menggunakan metode lain. Selain itu, kelebihan
dari ektraksi ini sadalah pita DNA yang diperoleh lebih tebal bila
dibandinglan denganl ektraksi metode fenol dan tanpa fenol. Akan tetapi,
dari hasil dengan metode ini masih terdapat pita smear dan DNA yang
dihasilkan lebih sedihkit daripada isolasi dengan menggunakan metode
yang lain.s

5. Phenol: chtloroform
Mengunakaln senyawa Phenol-choloroform-isoamyl alcokhol, Metode
standard untuk ekstraksi DNA, Akhir-akhir ini ditinggalkan, karena sifat
toksik phenol. Metode ini menggunakan bahan antara lain : sodium
Dodecylsulfate (SDS) dan Proteinase Kare ditambahkan untuk membuka
dinding sel sepanjang protein yang melindungi molekul DNA saelagi
mereka

ada

di

dalama

kromosom.

Selanjutnaya

campuran

phenol/cloroform ditambahkan untuk memisahkan protein dari DNA.


DNA menjadi lebih dapat larut di dalam air yang menagandung campuran
organic-aqueous. Ketika proses sentrifuge, bekas peninggalan protein dan
selsular yang tak dikehendaki dipisahkan dari tahap yang mengandunag air
dan menggandakan molekul DNA a sehingga dapat ditransfer dengan baik
untuk diaanalisa.

6.

Metode Guanidin Isotiosianat


Metode ini lebiah cepat dibanding dua metode sebelumnya, Thioacyanate
bersifat toksik, untuk lisis dinding sel, Memerlukan chloroformg untuk
denatlurasi protein. Prinsip metodre ini yaitu pelarut organik akan
mengibkat, menarik, dan mempresipitasi prwotein sehingga fase air yang
akan

terpisah

mengandung

DNA.

Larutan

disentrifugasi

untuk

mengendapkan protein sehingga larutan yang berada pada lapisan atas


mengandung DNA dapat diambil dan dianhalisis. Metode ini memakan
waktku lebih lama dan metode ini bergantung pada pemisahan fase
campurran air dan larutan yang mengandung fenol, kloroform dengan
melalui sentrifugasio(5).
7. PCR (Polymerase Chgain Reaction)
ini adalah merupakan qsuatu teknik perbanyakan atau amplifikasi
potongan DNA secara in vitro pada daerah yang spesiefik yang dibatasi
dengan dua buah prdimer oligonukleotida. dengan Primera yang
digunakan sebagai pembadtas didaerah yang dfiperbanyak adalah DNA
untai tunggal yang diman urutannya komplemen fdengan DNA

tempflatnya. dimana prosefs ini mirip dengan proses replikasi DNA yang
secara in vivo yang bersifat ysemi konservatif.
Tahap-tahap dari Isolasi DNAu
1. Isolasi jaringan dalah t
eTahap pertama yang akan dilakukan yaitu mengisolasi jaringan yang
iungin atau akan digunakan.
2. Pelisisan dinding dan kmembran sel
dan tahap selanjutnya ya,itu melisiskan dinding sel dan juga membran sel
dengan cara penggerusan 2atau homogenasi , sentrifugasi dengan
kecepatan yang

lebih dari 10.0u00 rpm atau dengan menggunaka;n

larutan pelisis sel atau buffer yang ekstraksi. dan Inti sel harus dilisiskank,
karena nantai substansi gen yang diinginkan ada didalamnya. dan dengasn
penambahand larutan pelisis sel ini adalah bertujuan uontuk melisiskan sel
yang tidak mengandung DNA supaya sel yang mengandung inti sel nanti
dapat diisolasi ataug dapat dipisahkan dari komponen-komponen sel
lainnyya yang sudah tidkak berfungsi lagi.
3. Pengekastraksian dalam larutan
dan kemgudian selanjutnya supernatan yang tkerbentuk itu dibuang dan
kemudian dilakukan tekstraksi di dalam larutan tersebut. Haol tersebut ini
bertujuan agafr supaya didapat ekstrak.
4. Purifikasid
Tahap ini awdalah bertujuan untuk membersihkan hasiul ekstrak yang
berasal dari zat-zat lainnya.h dan kemudian pada lasrutan tersebut
kemudian dfiberikan RNAse dan diinkubasi selama 10 mefnit pada suhu
65C. Hal baerikut ini bertujuan untuk mengoptimalkan kerja enzim yang
sangat dipengaruhi dengan temperatur. dan juEga penambahan RNAse
berguna untuk menyingkirkan kontaminasi RNtA sehingga selanjutnya
DNA nya tersebut dapat diisolasi secara utuhs.
5. Presipitasis
ini adalahi tahap terakhir, dimana presipitasi itu [bertujuan untuk
mengendapkan protein histo[n, yang sehingga dimana u[ntai-untai DNA
tidak lagi menggulung

atau coiling dan kemudian

berikatan dengan

protein histon dan menyebabkan DNsA menjadi terlihatdan tahap


presipitasi ini dilawkukan dengan cara rmeneteskan larutan presipitasi

protein

dan

yangs

kemudian

divortex

yang

bertujuan

untuk

menghomogenkan larutan. dimana larutan presipitasi protein terdiri dari


amonium asetat yang gjika berikatan sama

protein nantinya akan

mengakibatkan terbentuknya senyawa barug dengan kelarutan yang lebih


rendah, dan sehingga menyebsabkan protein itu mengendap dandimana
Larutan tersebut kemudian disentrifugasi kembali selama 5 menit dengan
kecepatan nya itu mencapai 1f3.000 rpm. dimana prinsip utama dari
sentrifugasi adalah untuk memisahkan substansi berdausarkan berat jenis
molekul dengan cara yaitu memberikan gaya sentrifuagal sehingga nanti
substansi yaang lebih berat itu akan berada di dasar dan

sedangkan

substansi yang lebih ringan akan terletak dibagian atas.


Manfaat isolaasi DNA
Isolasi DNA ini gdiperlukan untuk analisis lgenetik, yang bertujuan
atau digunakan untuk tutjuan ilmiah, medis,g ataupun untuk keperluan
forensik. dimana para ilmuwan menggunakana DNA didalam berbagi
aplikasi, seperti pengenalan DNA ke dalam sael dan binatang ataupun
didalam taanaman, atau untuk tujuan diagnostik. Ilmu forensik DNA perlu
untuk gidentifikasi individu bagi pemerkosaatau kasus pemerkosaan,
kecelakjaan, atau juga pada koprban perang dan juga penentuan ayah atau
identifikasi hewan.c
Kesimpulan
Dari berbagai metode-metode isolasi DNA yang sudah di jjelaskan
diatas maka metode isolasi DNA memiliki keunggulan dan kelemahan dari
setiap metode satu dengan yang lainnya. Dimana memiliki tujuan yang
sama yaitu untuk memisahkan DNA dengan molekul-molekul lain yang
ada di sekitar DNA agar DNA mudah untuk di periksa. Hal yang perlu
diingat adalah prinsisp yang digunakan dalam setiap metode-metode
isolasi DNA tersebut dengan teknik ssentrifugasi. Yang mana tujuan
dilakukan teknik sentrifugasi adalah untuk memisahkan campuran dengan
berdasarkan berat molekul-molekul komponen yang ada. Molekul yang

memiliki berat molekul besar nanti akan berada di bagian bawah tabung
dan molekul yang ringan itu akan berada pada bagian atas tabung. Isolasi
DNA dengan teknik sentrifugasi juga akan mengendapkan DNkA agar
nantinya mendaptkan hasil isolasi berupa DNA yang murni yang tidak
tercampur dengan tmolekul-molekul yang lain maka dalam aproses
isolasinya dicampurdukan berbagai macam larutan-larutan yang sudah di
jelaskan diatas.

Daftar Pustaka