Anda di halaman 1dari 8

LAPORAN STRUKTUR DAN FUNGSI BIOMOLEKUL KI3161

Percobaan 2
Karakterisasi Protein:
Penentuan Kadar dan Elektroforeis Gel Akrilamid

Nama

: Muhammad Hairuddin

NIM

: 10513050

Kelompok

:2

Nama Asisten

Tanggal Percobaan

: 29 September 2015

Tanggal Pengumpulan

: 1 Oktober 2015

LABORATORIUM BIOKIMIA
PROGRAM STUDI KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG
2015

PERCOBAAN 2
KARAKTERISASI PROTEIN:
Penentuan Kadar dan Elektroforesis Gel Akrilamid

I.

Tujuan
- Menentukan kadar protein dengan metode Lowry dan Bradford
- Menentukan karakter fisik protein

II.

Teori Percobaan
Untuk menentukan kadar suatu protein terdapat beberapa metode yang biasa
digunakan antara lain yaitu metode Biuret, metode Lowry, metode Bradford, dan lain
sebagainya. Masing-masing metode tersebut memiliki kelebihan dan kekurangannya
masing-masing. Terdapat beberapa faktor yang harus diperhatikan dalam pemilihan
metode yang terbaik dan tepat antara lain yaitu banyaknya material atau sampel yang
tersedia, waktu yang diperlukan untuk melakukan pengukuran, dan ketersediaanya alat
spektrofotometri UV dan VIS.
Penentuan kadar protein dengan metode Lowry adalah suatu metode penentuan
yang menggunakan reagen pendeteksi gugus-gugus fenolik seperti reagen Folin-Ciocalteu.
Reagen Folin-Ciocalteu ini adalah fosfomolibdat dan fosfotungstat. Metode Lowry ini
adalah modifikasi dari metode Biuret, dimana penambahan reagen Biuret pada metode
Lowry akan meningkatkan sensitivitasnya. Karena kompleks Cu-protein yang dihasilkan
pada metode Biuret akan mereduksi fosfotungstat dan fosfomolibdat yang akan
menghasilkan tungsten dan molybdenum yang memberikan warna biru.
Penentuan kadar protein dengan metode Bradford tidak jauh berbeda dengan
metode Lowry yaitu sama-sama sensitif mendeteksi gugus-gugus fenolik seperti tirosin,
dan tiptopan. Namun pada metode Bradford reagen yang digunakan adalah CBBG
(Coomaise Briliant Blue G250). Reagen CBBG bebas memiliki warna merah kecoklatan
dengan Imaks=465 nm, di dalam kondisi basa reagen ini akan berupa anion yang aktif
mengikat protein sehingga menghasilkan warna biru dengan nilai Imaks=595 nm. Jumlah
CBBG yang terikat dengan protein akan proporsional dengan muatan positif yang
ditemukan pada protein.
Elektroforesis merupakan salah satu teknik yang digunakan untuk memisahkan
suatu molekul, dalam hal ini makromolekul didalam media berpori dan bermedan listrik (
bermuatan). Makromolekul yang banyak dipisahkan atau dikarakterisasi dengan teknik ini
adalah protein dan asam nukleat. Pemisahan protein ini menggunakan media akrilamid dan
pemisahan asam nukleat (DNA) dengan menggunakan agarosa. Teknik elektroforesis
poliakrilamid menggunakan sodium dodesil sulfat (SDS). Adanya penambahan SDS akan

menghomogenkan muatan globular atau denaturasi protein dengan muatan negatif dari
SDS sehingga molekul sampel akan bermigrasi dari kutub negatif ke kutub positif.
Eletroforesis dengan akrilamid mengandung SDS-PAGE (Sodium Dodecyl SulfatePoliacrylamid Gel Electrophoresis). Pada SDS-PAGE ini terdapat dua bagian penting yaitu
stacking gel dan separating gel.
III.

Data pengamatan
1. Penentuan kadar protein dengan metode Lowry

Standar 1
Standar 2
Standar 3
Standar 4
Standar 5
Sampel 1
Sampel 2
Sampel 3

Konsentrasi (g/L)
40
80
120
160
200

Absorban (A)
0.073
0.118
0.210
0.308
0.275
0.066
0.1108
0.427

2. Penentuan kadar protein dengan metode Bradford

Standar 1
Standar 2
Standar 3
Standar 4
Standar 5
Sampel 1
Sampel 2
Sampel 3

Konsentrasi (g/L)
4
8
12
16
20

Absorban (A)
0.218
0.290
0.357
0.474
0.493
0.316
0.801
0.840

Fraksi 2
0.4
0.7
1.5
2
2.6

Fraksi 3
0.6
1.7
2.8
-

3. SDS-PAGE
Fraksi 1
1.5
2.6
-

Pengolahan data
1. Penentuan kadar protein dengan metode Lowry

Kurva Konsentrasi VS Absorbansi


0.35
0.31

0.3

Absorbansi (A)

IV.

0.25
0.21

0.2
0.15
0.12

0.1

y = 0.002x - 0.022
R = 0.9758

0.07
0.05
0
0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

Konsentrasi (g/L)

Persamaan kurva = y= 0.002x-0.022


Dengan y= absorbansi dan x= konsentrasi
Sampel 1:
y= 0.002x-0.022
0.066 = 0.002x-0.022
0.066+0.022=0.002x
0.088=0.002x
x= 44 g/L
dengan cara yang sama untuk sampel 2 dan 3 di dapatkan konsentrasinya masingmasing adalah 66.4 g/L dan 224.5 g/L

2. Penentuan kadar protein dengan metode Bradford

Kurva Konsentrasi VS Absorbansi


0.6

Absorbansi (A)

0.5

0.493

0.4
0.357
0.3

0.29
0.218

0.2

y = 0.0171x + 0.1511
R = 0.9998

0.1
0
0

10

15

20

25

Konsentrasi (g/L)

Persamaan kurva = y= 0.0171x+0.1511


Dengan y= absorbansi dan x= konsentrasi
Sampel 1:
y= 0.0171x+0.1511
0.316 = 0.0171x+0.1511
0.316-0.1511=0.0171x
0.1649=0.0171x
x= 9.643 g/L
dengan cara yang sama untuk sampel 2 dan 3 di dapatkan konsentrasinya masingmasing adalah 38.005 g/L dan 40.2865 g/L

V.

Pembahasan

VI.

Kesimpulan

VII.

Daftar pustaka
Colowick, S.P and Kaplan, N.O (1957), Methods in Enzymology, vol. V, Acad. Press
Inc, New York, p. 448-450.
Holme, D.J and Peck, H (1993), Analytical Biochemistry, 2nd Ed., Longman
Scientific and Technical, New York.
Lowry, O.H., Rosebrough, N.J., Farr, L.A and Randall, R.J (1951), Protein measurement
with the folin phenol reagent, The Journal of Biological Chemistry, p.265-275.
Alexander, R.R and Griffiths, J.M (1993), Basic Biochemical Methods, 2nd Ed., A John
Wiley & Sons, Inc., New Cork.

Anda mungkin juga menyukai