BAB III

METODE PENELITIAN
III.1. Jenis Penelitian
Penelitian ini menggunakan eksperimental laboratorik dengan metode
pendekatan post test-only control group design yang menggunakan kultur sel dalam
sumuran sebagai unit penelitian. Perlakuan pemberian 5-FU dan Triamsinolon pada
biakan fibroblast jaringan keloid kulit manusia yang diambil dari 1 keloid donor
dengan keluaran sintesis kolagen baru dan proliferasi fibroblas.
III.2. Rancangan Penelitian
Fibroblas dari
Keloid pasien

Kultur + isolasi
fibroblas

5-fluorourasil

Triamsinolone
Asetonide

kontrol

Sirius Red Assey

Kolagen baru yang Terlarut

Gambar 5. Rancangan Penelitian

18

III.3. Populasi dan Sampel Penelitian

Populasi pada penelitian ini adalah kultur fibroblast keloid manusia yang
diambil dari seorang penderita keloid dan dibiakkan dalam Dulbecos Modified
Eagles Medium (DMEM) yang mengandung FCS 10% (serum), Penicillin dan
Streptomycin. yang dipanen dari kultur fibroblast dalam flask dan dilakukan
penghitungan proliferansi fibroblast. Sampel penelitian adalah biakan fibroblas keloid
dibagi menjadi 7 kelompok perlakuan yaitu 5-FU dosis 10 mg/ml, 20 mg/ml, 40
mg/ml, Triamsinolon Asetonida (TA) dosis 20 M, 40 M, 60 M serta kontrol dan
masing masing dilakukan 3 kali perlakuan. Sampel penelitian tersebut telah
mendapat persetujuan dari dr. Yohanes Widodo Wirohadijojo Sp. KK (K) selaku
dosen pembimbing lapangan.
III.4. Tempat Penelitian
Penelitian dilakukan dilaboratorium Teknologi Kedokteran Ilmu Kesehatan
Kulit dan Kelamin gedung Radioputro lantai III Fakultas Kedokteran Universitas
Gadjah Mada Yogyakarta.
III.5. Alat dan Bahan
a. Bahan Penelitian

b. Alat Penelitian

Jaringan keloid

Masker

DMEM Gibco 10 x 1

Forsep steril

FCS 10%

Scalpel no. 15

Amfoterisin B

Tabung konikal steril Falcon 50 cc

Triamsinolon Acetonida

Tabung konikal steril NUNC 15 cc

5-FU

Gelas Petri Dish steril 9 cm

Gentamicin

Inkubator CO2 steril 5%

Alcohol 70%

Mikropipet steril

Phospat Buffer Saline A

Selotip kuning dan biru

19

(Gibco)

Mikroskop inverted

Povidon Iodine 10%

Geles Beker 100 cc

NaOH (Merck)

Pipet elektrik

Picro Sirius red

Penstrip (Gibco)
III.6. Prosedur Penelitian
a. Donor fibroblast
Fibroblas diisolasi dari material keloid 3 pasien yang didapatkan di bagian
laboratorium Ilmu Penyakit Kulit dan Kelamin RSUP DR Sardjito Yogyakarta.
b. Teknik kultur fibroblas
Material keloid akan dibilas sekali dalam 10% povidone iodine dan 3 kali
pada PBS steril selama masing-masing 10 menit. Material kemudian dipotong pada
potongan 2 mm dan diletakkan pada Petri dishes 35 mm sterile, dibenamkan pada
20% serum sapi yang mengandung medium dan diinkubasi pada 37 C dengan 5%
CO2 semalam. Pada keesokan hari, material di cek untuk ditambahkan dan 2 ml dari
medium komplit (DMEM + 10% serum sapi + 100 unit -100 ug/ml gentamicin) yang
akan ditambahkan secara perlahan dan diinkubasi ke dalam inkubator CO2. Medium
komplit akan diganti tiap 3 hari dan pertumbuhan fibroblastik akan dicapai pada
minggu ke-3. Pasase akan dilakukan dengan sel tertripsinase dengan 0,025% tripsin
dalam PBS, selesai dengan menambahkan medium komplit, dibilas 3 kali dengan
pencampuran dan disentrifugasi 100 G pada medium komplit. Sel bersih dan segar
kemudian di rekultivasi ke dalam flask dishes sampai Pasase III dicapai.
c. Perlakuan Terapi
Fibroblas dipisahkan dengan teknik ezimatik menggunakan tripsinase. 200L
dari suspensi diselubungi pada setiap sumur dalam 7 microplate dengan 3 kali
perlakuan setelah penambahan dari medium komplit sebagai berikut :
a. 5-FU 10 mg/ml

20

b.
c.
d.
e.
f.
g.

5-FU 20 mg/ml
5-FU 40 mg/ml
Triamsinolon Asetonida (TA) 20 M
Triamsinolon Asetonida (TA) 40 M
Triamsinolon Asetonida (TA) 60 M
Kontrol

d. Collagen assay
1. 50 L jika medium dipindahkan

dari tiap sumur dari semua grup dan

dipindahkan untuk dipisah 1,5mL tabung epindrof

2. Pada tiap-tiap tabung, 1000 L dari Sirius Red ditambahkan dan dicampur
3. Semua sampel kemudian disentrifugasi pada 10.000 G tambahkan 5 L bovin
serum selama 5 menit sehingga kolagen terbentuk endapan
4. Supernatan dibuang dengan hati-hati
5. 1000 L dari HCl 0.1 N ditambahkan pada tiap tabung dan dicampur
6. Semua sampel disentrifugasi lagi pada 10.000 G selama 5 menit
7. Supernatant dibuang dengan hati-hati
8. 1000 L NaOH 0.5 N ditambahkan ada tiap tabung dan dicampur
9. Isi dari tiap tabung epindrof dipindahkan ke microplate baru berdasarkan
micoplate sebelumnya (tiap sumur harus mengandung 200 L), plate 96 well
sesuai peta awal
10. Dengan software softMax Pro dan spectraMax, pembacaan direkam pada 570
nm.
e. Analisis statistik data
Data tentang subyek dari hasil penelitian dimasukkan dan diolah dengan
program SPSS untuk menganalisa perbedaan rata- rata antara masing masing
kelompok terapi dengan tingkat signifikan yang digunakan p = 0.05.

III.5. Variabel penelitian

21

a. Variabel Independen
1. Sel kolagen fibroblas keloid yang diberikan perlakuan terapi Triamsinolon
Asetonide.
2. Sel kolagen fibroblas keloid yang diberikan perlakuan terapi 5-FU.
3. Kontrol (tidak dilakukan modalitas terapi).
b. Variabel Dependen
Hasil densitas dari kolagen fibroblas yang diterapi dengan Triamsinolon
Asetonida, 5-FU dan kontrol yang diukur sintesis kolagen baru fibroblas pada keloid.

22