Anda di halaman 1dari 12

Laporan Praktikum KI2221

Cara Pemisahan dan Elektrometri


Percobaan 02
KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

Nama

: Aviv Sigit Cahyono

Nim

: 10513035

Kelompok

: Kelompok V

Tanggal Percobaan

: 06 Maret 2015

Tanggal Pengumpulan : 13 Maret 2015


Asisten

: Rista Juni Utami

LABORATORIUM KIMIA ANALITIK


PROGRAM STUDI KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG
2015

I.

Tujuan
1. Penentuan persamaan garis dari data HPLC larutan standar
2. Menentukan kadar kafein dalam teh dan kopi dengan teknik kromatografi cair kinerja
tinggi.

II.

Teori Dasar
Kromatografi merupakan suatu teknik pemisahan yang berdasarkan atas terpartisinya
senyawa-senyawa antara fasa diam dengan fasa gerak. Saat ini, teknik HPLC yang
banyak digunakan secara luas adalah teknik kromatografi fasa terbalik. Dalam HPLC fasa
terbalik, suatu kolom diisi dengan suatu butiran padatan yang merupakan fasa diam
sedangkan pelarut atau fasa geraknya dialirkan melewati partikel padat.
Pada fasa diam dalam teknik kromatografi ini, telah menunjukkan bahwa jika fasa
diam tersebut tersusun atas butiran-butiran yang sangat kecil, berbentuk bola dan
mempunyai ukuran yang sama, memungkinkan untuk memperoleh hasil pemisahan yang
sangat sempurna dari campuran dengan menggunakan jumlah pelarut yang sedikit dalam
beberapa menit. Kromatografi dengan menggunakan fasa diam,, dikenal dengan nama
kromatografi cair kinerja tinggi. Dengan menggunakan fasa diam, diubutuhkan suatu
pompa tekanan tinggi untuk mendorong fasa geraknya, yang menyebabkan meningkatnya
harga peralatan sampai 10 kali lipat.
Fasa diam yang umum digunakan dalam kromatografi adalah bahan yang bersifat
polar, seperti silica, sementara fasa geraknya adalah pelarut organic yang kepolarannya
kurang bila dibandingkan dengan fasa diamnya. Teknik kromatografi seperti ini dikenal
dengan kromatografi fasa normal. Sedangkan jika fasa diamnya berupa fasa terikat
dimana partikel silica ditutupi dengan melapisinya dengan senyawa silena. Maka dapat
digunakan fasa gerak terbalik karena kepolaran antara fasa-fasa tersebut dibalik. Dalam
kromatografi fasa terbalik, waktu retensi akan meningkat dengan meningkatnya karakter
nonpolar dari suatu senyawa.
Pelarut-pelarut polar seperti air dan metanol merupakan eluen yang banyak digunakan
karena lebih murah dibanding kebanyakan pelarut-pelarut organic lain dan kurang
berbahaya jika dibuang ke lingkungan. Bahwa beberapa biomolekul yang ditemukan
dalam larutan hanya larut dalam pelarut polar. Senyawa-senyawa tersebut tidakn dapat
dikromatografi dalam pelarut nonpolar kalaupun bisa, maka diperlukan penyiapan yang
ekstensif dan membuat turunannya terlebih dahulu.

Dalam percobaan ini, penggunaan HPLC fasa terbalik tidak membutuhkan pekerjaan
mengekstraksi kafein ke dalam pelarut lain. Dengan menyuntikan suatu sampel yang
terlarut atau jika terdapat bahan yang tidak larut, sampel disaring terlebih dahulu sebelum
disuntikan. Eluen dari kolom dimonitor dalam bentuk adsorban. Karena adsorban
sebanding dengan konsentrasi, bentuk kromatogramnya akan sebanding dengan jumlah
kafein total yang terdapat dalam sampel.
III.

Cara Kerja
Pembuatan fasa gerak (eluen)
Dibuat fasa mobil dengan komposisi 140 mL aquabidest : 1.4 mL H 3PO4 5 % dan

60 mL metanol.
Dihilangkan gas terlarut dalam larutan ini dengan menggunakan ultrasonic bath.

Penyiapan larutan standar

Dengan menggunakan larutan standar 500 ppm kafein, dibuat sederet larutan
standar dengan konsentrasi masing-masing 20, 40, 60, 80, dan 100 ppm sebanyak 5
mL. Dilakukan pengenceran dengan menggunakan eluen yang telah dibuat di atas.

Penyiapan larutan sampel

Khusus untuk minuman jenis cola, dihilangkan terlebih dahulu gas terlarut dengan

menggunakan ultrasonic bath.


Dilakukan pengenceran sebesar 5 (lima) kali dalam sebuah labu takar 10 mL
dengan menggunakan eluen.

Analisis

Direkam kromatogram masing-masing larutan standard dan sampel yang telah

dipersiapkan.
Dicatat parameter peralatan kromatografi yang digunakan seperti : laju alir eluen,
tekanan, jenis kolom yang digunakan, panjang gelombang detector, kecepatan
kertas perekam.

IV.

Data Hasil Pengamatan


Tekanan pada HPLC
Panjang gelombang detector
Komposisi eluen methanol : air
Laju alir eluen

= 0 400 bar
= 280 nm.
= 80 : 20
= 1 mL/menit.

Volume suntikan
Ukuran kolom
Jenis kolom

= 50 microliter.
= 12.5 mm x 0.4 mm
= C-18

Tabel 1 (Data hasil HPLC untuk larutan standar kafein)


No
1
2
3
4
5

Konsentrasi (ppm)
20
40
60
80
100

Area (mAU*s)
Tinggi (mAU)
737.09332
137.52766
1715.57813
326.4985
2244.7915
444.24435
3447.25806
696.47406
3800.82715
697.6264

Tabel 2 (Data hasil HPLC untuk larutan sampel)


No
Sampel
Area (mAU*s)
Tinggi (mAU)
1
Teh
3386.18018
307.25586
2
Kopi
1771.20764
294.77737
Untuk gambar hasil kromatografi HPLC dilampirkan.
V.

Perhitungan dan Pengolahan Data


1 Pembuatan deret larutan standar
M1x V1 = M2x V2

Untuk 20 ppm
500 x V1 = 20 x 25
V1 = 1 ml

Untuk 40 ppm
500 x V1 = 40 x 25
V1 = 2 ml

Untuk 60 ppm
500 x V1 = 60 x 25
V1 = 3 ml

Untuk 80 ppm
500 x V1 = 80 x 25
V1 = 4 ml

Untuk 100 ppm


500 x V1 = 100 x 25
V1 = 5ml

Penentuan persamaan garis dari data HPLC larutan standar

No
Konsentrasi (ppm)
Area (mAU*s)
Tinggi (mAU)
1
20
737.09332
137.52766
2
40
1715.57813
326.4985
3
60
2244.7915
444.24435
4
80
3447.25806
696.47406
5
100
3800.82715
697.6264
Gambar Kurva kalibrasi HPLC nilai tinggi terhadap konsentrasi

Kurva Kalibrasi HPLC


800
f(x) = 7.45x + 13.42
R = 0.95

600
Tinggi (mAU)

400

Linear ()

200
0
0

20

40

60

80 100 120

Konsentrasi

Dari kurva tersebut bisa ditentukan persamaan garisnya melalui regresi, didapat
persamaan garis:
y = 7.4509x + 13.422

Gambar Kurva kalibrasi HPLC nilai luas area terhadap konsentrasi

Kurva Kalibrasi HPLC


4000

f(x) = 39.3x + 31.37


R = 0.98

3000
Area (mAU*s)

2000

Linear ()

1000
0
0

20

40

60

80 100 120

Konsentrasi

Dari kurva tersebut bisa ditentukan persamaan garisnya melalui regresi, didapat
persamaan garis:
y = 39.296x + 31.365
3

Penentuan konsentrasi dari sampel teh


No
1
2

Sampel
Teh
Kopi

Area (mAU*s)
Tinggi (mAU)
3386.18018
307.25586
1771.20764
294.77737

Dari data table tersebut maka bisa ditentukan konsentrasi sampel teh melalui persamaan
garis luas area terhadap konsentrasi dan persamaan garis dari tinggi terhadap konsentrasi

Konsentrasi sampel teh melalui persamaan garis luas area puncak


y = 39.296x + 31.365
3386.18018 = 39.296x + 31.365
x = 85.372 ppm.
Nilai x tidak dikali faktor pengenceran karena tidak diencerkan
Konsentrasi sampel teh melalui persamaan garis tinggi puncak
y = 7.4509x + 13.422
307.25586 = 7.4509x + 13.422
x = 39.436 ppm.
Nilai x tidak dikali faktor pengenceran karena tidak diencerkan
4 Penentuan konsentrasi dari sampel kopi
No
1
2

Sampel
Teh
Kopi

Area (mAU*s)
Tinggi (mAU)
3386.18018
307.25586
1771.20764
294.77737

Dari data table tersebut maka bisa ditentukan konsentrasi sampel kopi melalui persamaan
garis luas area terhadap konsentrasi dan persamaan garis dari tinggi terhadap konsentrasi
Konsentrasi sampel kopi melalui persamaan garis luas area puncak
y = 39.296x + 31.365
1771.20764 = 39.296x + 31.365
x = 44.275 ppm.
Konsentrasi sampel kopi awal sebelum diencerkan:
44.275 ppm x faktor pengenceran
25 mL
25 mL
44.275 ppm x 5 mL x 5 mL = 1106.875 ppm.

Konsentrasi sampel kopi melalui persamaan garis tinggi puncak


y = 7.4509x + 13.422
294.77737 = 7.4509x + 13.422
x = 37.761 ppm
Konsentrasi sampel kopi awal sebelum diencerkan:
37.761 ppm x faktor pengenceran
25 mL
25 mL
37.761 ppm x 5 mL x 5 mL = 944.025 ppm.

VI. Pembahasan
Pada percobaan ini, dilakukan penentuan kandungan kafein di dalam larutan sampel teh
dan sampel kopi dengan metode pemisahan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) atau
High Performance Liquid Chromatography (HPLC). Kromatografi adalah suatu teknik

pemisahan yang didasarkan atas terpartisinya senyawa-senyawa antara fasa gerak cairan dan
fasa diam cairan atau padatan. Metode kromatografi ini, mampu memisahkan molekulmolekul dari suatu campuran, memiliki kecepatan analisis yang tinggi dan dapat
menganalisis secara kualitatif dan kuantitatif dengan variable kualitatifnya adalah waktu
retensi dari sampel.
Prinsip kerja dari HPLC adalah menggunakan suatu pompa bertekanan tinggi untuk
mendorong fasa geraknya yang berupa pelarut agar dapat melewati fasa diam yang berupa
kolom berisikan partikel pengemas. Sehingga campuran analit akan terpisah berdasarkan
kepolarannya dan kecepatan untuk sampai kedetektor (waktu retensi) akan berbeda, hal ini
akan teramati pada spectrum yang puncak-puncaknya terpisah. Pada percobaan ini, fasa
diamnya adalah fasa terikat dimana partikel silica ditutupi dengan melapisinya dengan
senyawa silena. Maka dapat digunakan fasa gerak terbalik karena kepolaran antara fasa-fasa
tersebut dibalik. Dalam kromatografi fasa terbalik, waktu retensi akan meningkat dengan
meningkatnya karakter nonpolar dari suatu senyawa.
Suatu system peralatan HPLC memiliki instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas :
wadah fase gerak, pompa, alat untuk memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor,
wadah penampung buangan fase gerak, dan suatu komputer atau integrator atau perekam.
Diagram skematik sistem kromatografi cair seperti ini :

1. Wadah fasa gerak dan fasa gerak


Wadah fasa gerak harus bersih dan dapat menampung fasa gerak antara 1 sampai 2 liter
pelaut. Fasa gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur
secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Dan fasa gerak sebelum
digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk menghindari partikel-partikel kecil. Selain
itu, adanya gas dalam fase gerak juga harus dihilangkan. Sebab adanya gas akan
berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan detector sehingga akan
mengacaukan analisis.
2. Pompa
Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang mempunyai syarat wadah
pelarut yakni : pompa harus inert terhadap fase gerak. Laju alir eluen adalah 1 mL/menit

3.

4.

5.

6.

dan penggunaan pompa bertujuan agar system penghantaran fase gerak adalah untuk
menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, konstan dan bebas
dari gangguan,
Tempat penyuntikan sampel
Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam fasa gerak yang
mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari
tembaga tahan karat.
Fase diam
Fasa diam yang digunakan dalam kromatografi adalah bahan yang besifat polar seperti
silica, sementara fasa geraknya adalah pelarut organic yang kepolarannya kurang bila
dibandingkan dengan fase diamnya. Fasa diamnya adalah silica yang dilapisi oleh silena,
maka dapat digunakan fasa gerak terbalik karena kepolaran antara fasa-fasa tersebut
terbalik.
Detector dan system injeksi
Detector HPLC berfungsi untuk mendeteksi komponen-komponen yang telah dipisahkan
di dalam kolom. Sedangkan system injeksi adalah ketika suatu sampel dimasukkan ke
dalam kolom dengan menggunakan alat penyuntik melalui gerbang injeksi dan volume
suntikan pada HPLC 1260 agilent adalah 50 microliter.
Kolom adalah bagian dari instrumentasi HPLC yang berfungsi untuk melakukan proses
pemisahan komponen-komponen sampel yang akan berlangsung. Pemisahan terjadi akibat
perbedaan distribusi/partisi dari masing-masing komponen tersebut. Ukuran kolom
sebesar 12.5 mm x 0.4 mm dan kolom yang biasa digunakan untuk analisa adalah bentuk
kolom terbalik.

Pada percobaan ini, digunakan HPLC dengan jenis fasa terbalik, yaitu fasa diamnya
besifat non-polar (C-18) dan fasa geraknya besifat polar (metanol : air = 80 : 20). Pada
instrument HPLC, pelarut-pelarut harus dihilangkan komponen gasnya untuk menghalangi
terbentuknya gelembung-gelembung dan penghilangan ini dapat dilakukan dengan
menggunakan ultrasonic bath. C-18 merupakan senyawa silika yang pada permukaannya
diberikan lapisan Xilena, sehingga fasa diam ini bersifat non-polar. Komposisi metanol-air
yang digunakan sebagai eluen dipilih 80 : 20 dikarenakan komposisi tersebut yang
memberikan hasil pemisahan kromatogram yang baik dengan waktu analisis yang sebentar
dengan pembanding hasil percobaan pada komposisi lain. Metoda pengelusian analit yang
dilakukan adalah elusi isokratik, yaitu komposisi eluen yang dipakai selama proses elusi
adalah tetap 80 : 20 tidak berubah, sedangkan metoda elusi lainnya adalah elusi gradien,
komposisi eluen berubah selama proses elusi. Air merupakan fasa gerak yang lemah dan
memiliki retensi yang besar, sedangkan metanol memiliki kekuatan elusi yang lebih besar
dibandingkan dengan air. Pelarut-pelarut ini sering digunakan karena harga yang lebih murah
dibandingkan pelarut organic lain dan tidak berbahaya ketika dibuang ke lingkungan.
Pada HPLC ini, digunakan metode elusi isokrati karena sudah diketahui bahwa
komponen penyusun sampel tidaklah terlalu banyak sehingga tidak digunakan pemisahan

dengan jumlah yang banyak, yakni : metode elusi gradien. Suatu komponen dapat terpisah
dari komponen penyusun senyawa lainnya dalam kromatografi dikarenakan perbedaan
interaksi antara komponen tersebut dengan fasa gerak dan fasa diam. Interaksi yang
dimaksudkan dalam HPLC ini adalah interaksi kemiripan sifat kepolaran, komponen suatu
senyawa memiliki sifat kepolaran yang berbeda-beda, sifat tersebut dapat dimanfaatkan
untuk dilakukan pemisahan. Kemiripan sifat kepolaran akan menyebabkan suatu komponen
akan lebih terlarut dalam satu fasa yang kepolarannya lebih mendekati dibandingkan fasa
yanglainnya.
Kafein merupakan komponen yang ingin dipisahkan, komponen ini memiliki sifat yang
polar, maka dari itu digunakan HPLC fasa terbalik yang tujuannya mempercepat waktu
analisis. Kafein yang bersifat polar akan lebih terlarut dalam fasa diam dan akan memiliki
waktu retensi yang lebih rendah dibandingkan komponen lainnya yang lebih bersifat nonpolar namun akan memiliki waktu retensi yang lebih besar dibandingkan komponen lainnya
yang bersifat lebih polar dibandingkan kafein. Waktu retensi akan bervariasi tergantung pada
tekanan yang digunakan (mempengaruhi laju alir pelarut), sifat fasa diam (komponen dan
ukuran partikel), komposisi pelarut, dan suhu kolom. Detektor yang digunakan pada
instrumen HPLC kali ini adalah spektrofotometer UV-VIS, sebuah metoda umum yang
mudah untuk menjelaskan menggunakan penyerapan ultra-violet. Banyak senyawa organik
menyerap sinar UV dari beberapa panjang gelombang. Jika seberkas sinar UV dilewatkan
pada aliran cairan yang keluar dari kolom, dan detektor UV berada pada bagian berlawanan
dari berkas cahaya, maka pembacaan langsung berapa banyak cahaya yang diserap. Jumlah
cahaya yang diserap bergantung kepada jumlah senyawa tertentu yang melewati sinar pada
saat itu. Pelarut yang digunakan juga menyerap sinar UV, tetapi senyawa yang berbeda akan
menyerap sinar terkuat dalam bagian berbeda pada spektrum UV.
Metanol menyerap pada panjang gelombang dibawah 205 nm dan air dibawah 190 nm.
Sehingga jika digunakan campuran metanol-air sebagai pelarut harus digunakan panjang
gelombang yang lebih besar dari 205 nmuntuk mencegah pembacaan pelarut dalam analit.
Output akan direkam sebagairangkaian puncak, masing-masing puncak mewakili satu
senyawa dalam campuran yang melewati detektor dan menyerap sinar UV. Tinggi dan luas
puncak dapat digunakan untuk mengukur jumlah dari senyawa ini. Konsentrasi kafein dalam
percobaan ini ditentukan dengan cara metoda kurva kalibrasi (penggunaan serangkaian
larutan standar sebagai pembanding). Perbedaan nilai konsentrasi dari kafein yang diperoleh
berdasarkan perhitungan dengan menggunakan luas kromatogram maupun tinggi
kromatogram dapat disebabkan oleh adanya udara yang masuk ke dalam kolom sehingga
mempengaruhi tekanan dalam kolom. Faktor-faktor yang dapat menjadi penyebab kesalahan
antara lain : sampel masih terdapat pengotor sehingga pemisahan tidak baik, pada sampel
terdapat juga zat-zat lain yang mempunyai waktu tambat yang berdekatan, dan sampel yang
diinjeksikan tidak boleh ada gelembung karena gelembung dapat menganggu proses

pemisahan. Oleh karena itu, perlu dilakukan identifikasi puncak yang dihasilkan oleh sampel
untuk memastikan bahwa puncak itu adalah puncak sampel yang dimaksud.
Keselerasan model regresi dapat diterangkan dengan menggunakan nilai R 2 semakin
besar nilai tersebut maka model semakin baik. Pada kurva kalibrasi luas area dan tinggi
puncak tersebut diperoleh persamaan garisnya melalui regresi, didapat nilai R 2 sebesar 0.9472
pada tinggi puncak dan 0.9779 pada luas area. Sehingga nilai R 2 mendekati 1 maka model
regresi semakin baik. Oleh karena itu, nilai luas area pada kafein lebih baik dari pada nilai
tinggi puncak pada kafein. Dari percobaan HPLC ini, diperoleh kandungan kafein,
berdasarkan luas area untuk sampel kopi sebesar 1106.875 ppm, dan sampel teh sebesar
85.372 ppm. Berdasarkan tinggi puncak untuk sampel kopi sebesar 944.025 ppm dan sampel
teh sebesar 39.436 ppm.
Aplikasi HPLC banyak dimanfaatkan dalam kehidupan pada bidang industri, farmasi,
kimia, klinik, forensik, makanan, dan lain-lain. Dalam bidang bioteknologi, kromatografi
mempunyai peranan yang sangat besar. Misalnya dalam penentuan, baik kualitatif maupun
kuantitatif, senyawa dalam protein. Protein sering dipilih karena ia sering menjadi obyek
molekul yang harus dimurnikan terutama untuk keperluan dalam bio-farmasi. Kromatografi
juga bisa diaplikasikan dalam pemisahan molekul-molekul penting seperti asam nukleat,
karbohidrat, lemak, dan vitamin. Dalam bidang klinik, teknik ini sangat bermanfaat terutama
dalam menginvestigasi fluida badan seperti air liur. Dari air liur seorang pasien, dokter dapat
mengetahui jenis penyakit yang sedang diderita pasien tersebut. Seorang perokok dapat
diketahui apakah dia termasuk perokok berat atau ringan hanya dengan mengetahui
konsentrasi CN- (sianida) dari sampel air liurnya. Dalam masalah lingkungan, sebagai
konsekuensi majunya peradaban manusia, berarti permasalahan pun semakin maju. Salah
satu permasalahan serius yang dihadapi oleh negara-negara berkembang dan utamanya
negara maju adalah persoalan pemanasan global. Seiring dengan hal itu, permasalahan
lingkungan pun semakin meningkat. Disinilah, teknik kromatografi mengambil peran paling
penting dalam analisis lingkungan ini. Sebagai contoh, kualitas air misalnya pada air ledeng,
air sungai, air danau, air permukaan dapat mengetahui jenis anion dan kation yang
terkandung dalam sampel tersebut sekaligus jumlahnya. Apakah logam-logam berbahaya
atau tidak. Oleh karena itu, aplikasi kromatografi sangat penting dimanfaatkan dalam
kehidupan sehingga harus digunakan dengan sebaik-baiknya.
VI.

Kesimpulan
Dari percobaan kromatografi cair kinerja tinggi, diperoleh kurva kalibrasi tinggi puncak
persamaan garisnya adalah y = 7.4509x + 13.422 dan R = 0.9472. Sedangkan untuk kurva
kalibrasi luas area persamaan garisnya adalah y = 39.296x + 31.365 dan R = 0.9779.
Kandungan kafein, berdasarkan luas area untuk sampel kopi sebesar 1106.875 ppm, dan

sampel teh sebesar 85.372 ppm. Berdasarkan tinggi puncak untuk sampel kopi sebesar
944.025 ppm dan sampel teh sebesar 39.436 ppm.
VII. Daftar Pustaka
Day. R. A., Underwood A. L. 2002. Analisis Kimia Kuantitatif. 6th Ed. Jakarta: PT.
Penerbit Erlangga.
David Havey. 2000. Modern Analytical Chemistry. 1st Ed. Mc Graw-Hill, New York.
Halaman 578 588.
D. A. Skoog, D. M. West: F. J. Holler Fundamental of Analytical Chemistry. 9th Ed. United
States: Global. 2014.
Kennedy, J. H. Analytical Chemistry: Principles. 2nd Ed. Saunders College Publishing,
New York, 1990.
LAMPIRAN