MEDIOS DE CULTIVOS Y CLASIFICACIN

Uno de los sistemas ms importantes para la identificacin de microorganismos es

observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el
laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio
de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Se han preparado
ms de 10.000 medios de cultivo diferentes.
Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe
reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presin
de oxgeno adecuado, as como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio
de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe
estar exento de todo microorganismo contaminante.
La mayora de las bacterias patgenas requieren nutrientes complejos similares en
composicin a los lquidos orgnicos del cuerpo humano. Por eso, la base de muchos
medios de cultivo es una infusin de extractos de carne y Peptona a la que se
aadirn otros ingredientes.
El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparacin de medios de
cultivo. Se lica completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al
enfriarse a 40 grados. Con mnimas excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento
de las bacterias y no es atacado por aquellas que crecen en l.
En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de
enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los
hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para incrementar el
valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de fermentacin de los
microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la sangre completa se aaden
para promover el crecimiento de los microorganismos menos resistentes.

CLASIFICACIN
Los medios de cultivo pueden clasificarse segn diferentes criterios, pero los
ms importantes son aquellos que se basan en:

Su consistencia
Su utilizacin
Su composicin
Su origen

SEGN SU ESTADO FSICO (CONSISTENCIA).

1) Medios lquidos: Son los que se presentan en este estado, denominndose

por esta razn caldos. El medio lquido ms utilizado es el llamado caldo
nutritivo, compuesto principalmente de extracto de carne, peptona y agua. Se
utiliza fundamentalmente cuando se pretende la obtencin de una suspensin
bacteriana de una determinada concentracin.
2) Medios slidos: Se preparan a partir de los medios lquidos, agregndoles un
agente gelificante. Los ms utilizados son la gelatina y el agar. Gelatina: Es una
protena animal obtenida de los huesos. Tiene el inconveniente de que es
hidrolizada por muchas bacterias, y adems su uso est muy limitado porque
su punto de fusin es bajo (lica a temperatura ambiente) razn por la que no
puede utilizarse para cultivos a 37C, que es la tempera ptima de crecimiento
para muchos microorganismos. Agar-agar:Es un polmero de azcares
obtenido de algas marinas. Aproximadamente la mitad de todo el agar que se
produce, se utiliza en trabajo microbiolgico, por lo que es importante la
ausencia de metales txicos.
3) Medios semislidos: Se preparan a partir de los medios lquidos, agregando
a stos un agente solidificante en una proporcin menor que para preparar
medios slidos. Uno de sus usos es la investigacin de la movilidad de las
bacterias

SEGN SU UTILIZACIN.
1) Medios comunes: Son aquellos que poseen los componentes mnimos para
que pueda producirse el crecimiento de bacterias que no necesiten
requerimientos especiales. El medio ms conocido de este grupo es el agar
nutritivo o agar comn, que resulta de la adicin de agar al caldo nutritivo.
Otros representantes de este grupo son el agar triplicase de soja, el agar
Columbia, etc.
2) Medios de enriquecimiento: Son aquellos que, adems de las sustancias
nutritivas normales, incorporan una serie de factores indispensables para el
crecimiento de microorganismos exigentes. Este enriquecimiento se hace por
adicin de sangre u otros productos biolgicos (sangre, suero, leche, huevo,
bilis, etc.) que aportan dichos factores. En ocasiones es posible aadir
suplementos artificiales a los medios para producir un enriquecimiento del
mismo. El gonococo, por ejemplo, necesita cistina y cistena para su
crecimiento. Estas sustancias son aportadas por la sangre calentada
adicionada al medio de cultivo (agar chocolate).
3) Medios selectivos: Son medios utilizados para favorecer el crecimiento de
ciertas bacterias contenidas en una poblacin poli microbiana. El fundamento
de estos medios consiste en facilitar nutricionalmente el crecimiento de una

poblacin microbiana especfica. Un ejemplo de medio selectivo es el caldo

selenito, que se utiliza para favorecer el crecimiento de salmonellas y frenar el
del resto de enterobacterias.
4) Medios inhibidores: Cuando las sustancias aadidas a un medio selectivo
impiden totalmente el crecimiento de una poblacin microbiana, se denomina
inhibidor. Los medios inhibidores podran considerarse como una variante ms
restrictiva de los medios selectivos. Los medios inhibidores se consiguen
habitualmente por adicin de sustancias antimicrobianas o de cualquier otra
que inhiba completamente el desarrollo de una poblacin determinada.
5) Medios diferenciales: Se utilizan para poner en evidencia caractersticas
bioqumicas que ayuden a diferenciar gneros o especies. La adicin de un
azcar fermentable o un sustrato metabolizable se utilizan para este fin. El
medio MacConkey es un medio diferencial porque permite distinguir los
grmenes que fermentan la lactosa de aquellos que no lo hacen. Tambin lo
son el C.L.E.D. (lactosa +/lactosa -), el agar sangre (tipo de hemlisis), el SS
(que es doblemente diferencial), etc.
6) Medios de identificacin: Son los destinados a comprobar alguna cualidad
especfica que puede servirnos para reconocer la identidad de un
microorganismo. Estos medios han de poseer los elementos necesarios para
asegurar el crecimiento de los microorganismos, el sustrato especfico que
vaya a ser metabolizado y el indicador que nos muestre el resultado. El agar
Kligler, el medio de Simmons y en general, cualquier medio al que se le haya
aadido un elemento diferencial de un microorganismo, son medios utilizados
en identificacin.
7) Medios de multiplicacin: Sirven para obtener una gran cantidad de clulas a
partir de un microorganismo ya aislado. Se emplean en la obtencin de
vacunas, en la investigacin y en la industria. Los medios ms adecuados para
la multiplicacin suelen ser lquidos. El caldo-infusin cerebro-corazn (BHI), es
un ejemplo tpico de estos medios.
8) Medios de conservacin: Se utilizan para conservar una cepa que, por
diversas razones nos interese mantener. Fundamentalmente se utilizan como
controles de calidad de las pruebas y reactivos utilizados en el laboratorio de
Microbiologa. En el laboratorio se pueden conservar las cepas de tres formas:
a) haciendo pases peridicos de placa a placa,
b) mediante liofilizacin de una suspensin bacteriana, y
c) congelando las cepas en leche descremada estril al 0,1%.
9) Medios de transporte: Se usan para el transporte de muestras clnicas que
no pueden sembrarse inmediatamente. Su utilizacin debe hacerse

introduciendo la torunda con la que se obtuvo la muestra en el interior delmedio

(generalmente en un tubo).
ATENDIENDO A SU COMPOSICIN.
Segn las sustancias que entren a formar parte en su composicin, los medios
de cultivo pueden ser clasificados en:
1) Medios complejos: Fueron los primeros utilizados, y los ms empleados se
preparan a partir de tejidos animales, y ms raramente de vegetales. Su
composicin no es exactamente definida, y por consiguiente no es
rigurosamente constante. Esto puede tener ciertos inconvenientes en
condiciones experimentales, donde la reproductibilidad no podr ser exacta. En
la prctica corriente estos medios dan excelentes resultados y son los ms
empleados.
2) Medios sintticos: Son aquellos que contienen en su composicin
exclusivamente sustancias qumicas conocidas y disueltas en agua destilada
en proporciones determinadas, resultando un medio de composicin
perfectamente definida.
3) Medios semisintticos: El gran nmero de factores de crecimiento exigidos
para ciertos grmenes hace que la fabricacin de un medio sinttico para estos
grmenes sea imposible o demasiado cara. En este caso se aportan los
factores de crecimiento bajo la forma de un extracto orgnico complejo
(extracto de levadura, extracto de tejidos, etc.).Ciertos grmenes no crecen en
ningn medio por muy enriquecido que est ste, hacindolo exclusivamente
en clulas vivas con unas caractersticas determinadas. Ejemplos de este tipo
son, aparte de los virus, las Chlamydias, Rickettsias, etc.

SEGN SU ORIGEN:
a) NATURALES: son los preparados a partir de sustancias naturales de origen
animal o vegetal como ser
extractos de tejidos o infusiones y cuya
composicin
qumica
no
se
conoce
exactamente.
b) SINTTICOS: son los medios que contienen una composicin qumica
definida cualitativamente y cuantitativamente. Se utilizan para obtener
resultados reproducibles
.
c) SEMISINTTICOS son los sintticos a los que se les aaden factores de
crecimiento bajo una forma de un extracto orgnico complejo, como por
ejemplo extracto de levadura.

MTODOS DE ESTERILIZACION
Se denomina esterilizacin al proceso por el cual se obtiene un producto libre
de microorganismos viables. El proceso de esterilizacin debe ser diseado,
validado y llevado a cabo para asegurar que es capaz de eliminar la carga
microbiana del producto o un desafo ms resistente.
Dado que la esterilidad no puede demostrarse de manera absoluta sin causar
la destruccin completa de todas las unidades del lote de producto terminado,
se define la esterilidad en trminos probabilsticos, en donde la probabilidad de
que una unidad de producto est contaminada es aceptablemente remota. Se
considera que un producto crtico es estril cuando la probabilidad de que un
microorganismo est presente en forma activa o latente es igual o menor de 1
en 1.000.000 (coeficiente de seguridad de esterilidad 10^-6).
Los mtodos trmicos de esterilizacin son comnmente los ms utilizados
para eliminar los microorganismos, incluyendo las formas ms resistentes
como lo son las endoesporas.

Mtodos Qumicos
Estos mtodos provocan la perdida de viabilidad de los microorganismos.
Con oxido denetileno: Es un agente alquilante que se une a compuestos con
hidrgenos lbiles como los que tienen grupos carboxilos, amino, sulfhidrilos,
hidroxilos, etc. Es utilizado en la esterilizacin gaseosa, generalmente en
la industria farmacutica. Destruye todos los microorganismos incluso virus.
Sirve para esterilizar material termosensibles como el descartable
(goma, plastico, papel, etc.), equipos electrnicos, bombas cardiorrespiratorias,
metal, etc. Es muy peligroso por ser altamente inflamable y explosivo, y
adems cancerigeno.
Con aldehdos:
Son agentes alquilantes que actan sobre las protenas, provocando una
modificacin irreversible en enzimas e inhiben la actividad enzimtica. Estos
compuestos destruyen las esporas.
Glutaraldehdo:
Consiste en preparar una solucin alcalina al 2% y sumergir el material a
esterilizar de 20 a 30 minutos, y luego un enjuague de 10 minutos.
Este mtodo tiene la ventaja de ser rpido y ser el nico esterilizante efectivo
fro. Puede esterilizar plstico, goma, vidrio, metal, etc.

Formaldehdo:
Se utilizan las pastillas de paraformaldehido, las cuales pueden disponerse en
el fondo de una caja envueltas en gasa o algodn, que despus pueden ser
expuesta al calor para un rpida esterilizacin (accin del gas formaldehdo).
Tambin pueden ser usadas en Estufas de Formol, que son cajas de doble
fondo, en donde se colocan las pastillas y se calienta hasta los 60 C y pueden
esterilizar
materiales
de
ltex,
goma,plsticos,
etc.
Las pastillas de formalina a temperatura ambiente esterilizan en 36 hs.
Esterilizacin
por
gas-plasma
de
Perxido
de
Hidrgeno
Es proceso de esterilizacin a baja temperatura la cual consta en la transmisin
de perxido de hidrgeno en fase plasma (estado entre lquido y gas), que
ejerce la accin biocida.
Posee como ventajas:
No deja ningn residuo txico.
Se convierte en agua y oxgeno al final del proceso.
El material no precisa aireacin.
El ciclo de esterilizacin dura entre 54 y 75 minutos.
Desventajas:
No se pueden esterilizar objetos que contengan celulosa, algodn, lquidos,
humedad, madera o instrumental con lmenes largos y estrechos.
Es el mtodo de esterilizacin ms caro de entre los descritos.

Mtodos fsicos
Calor
La utilizacin de este mtodo y su eficacia depende de dos factores:
el tiempo de exposicin y
la
temperatura.
Todos los microorganismos son susceptibles, en distinto grado, a la accin del
calor. El calor provoca desnaturalizacin de protenas, fusin y desorganizacin
de
las
membranas
y/o procesos oxidantes
irreversibles
en
los
microorganismos.
Calor
Hmedo:
El calor hmedo produce desnaturalizacin y coagulacin de protenas. Estos
efectos
se
debe
principalmente
a
dos
razones:
*El agua es una especie qumica muy reactiva y muchas estructuras biolgicas
son
producidas
por
reacciones
que
eliminan
agua.
*El vapor de agua posee un coeficiente de transferencia de calor mucho ms
elevado que el aire.
Autoclave
Se realiza la esterilizacin por el vapor de agua a presin. El modelo ms
usado
es
el
de
Chamberland.
Esteriliza a 120 a una atmsfera de presin (estas condiciones pueden
variar)y
se
deja
el
material
durante
20
a
30
minutos.
Equipo:

Tyndalizacin
Esterilizacin por accin discontinua del vapor de agua, se basa en el principio
de Tyndal Las bacterias que resisten una sesin de calefaccin, hecha en
determinadas condiciones, pueden ser destruidas cuando la misma operacin
se
repite
con
intervalos
separados
y
en
varias
sesiones.
Se efecta por medio del autoclave de Chamberland, dejando abierta la vlvula
de escape, o sea funcionando a la presin normal. Puede tambin realizarse a
temperaturas ms bajas, 56 u 80 ocpara evitar la descomposicin de las
sustancias a esterilizar, por las temperaturas elevadas.
Ventajas del calor hmedo:
Rpido calentamiento y penetracin
Destruccin de bacterias y esporas en corto tiempo
No deja residuos txicos
Hay un bajo deterioro del material expuesto
Econmico
Desventajas:
No permite esterilizar soluciones que formen emulsiones con el agua
Es corrosivo sobre ciertos instrumentos metlicos
Calor seco:
El calor seco produce desecacin de la clula, es esto txicos por niveles
elevados de electrolitos, fusin de membranas. Estos efectos se deben a la
transferencia de calor desde los materiales a los microorganismos que estn en
contacto
con
stos.
La accin destructiva del calor sobre protenas y lipidos requiere mayor
temperatura cuando el material est seco o la actividad de agua del medio es
baja.
Estufas
Doble cmara, el aire caliente generado por una resistencia, circula por la
cavidad principal y por el espacio entre ambas cmaras, a temperatura de 170
C para el instrumental metlico y a 140 C para el contenido de los tambores.
Se mantiene una temperatura estable mediante termostatos de metal, que al
dilatarse por el calor, cortan el circuito elctrico.
Ventajas del calor seco:
No es corrosivo para metales e instrumentos.
Permite la esterilizacin de sustancias en polvo y no acuosas, y de sustancias
viscosas no voltiles.
Desventajas:
Requiere mayor tiempo de esterilizacin, respecto al calor hmedo, debido a la
baja penetracin del calor.
Radiaciones
Su accin depende de:
El tipo de radiacin

El tiempo de exposicin
La dosis
Ionizantes:
Producen iones y radicales libres que alteran las bases de los cidos nucleicos,
estructuras proteicas y lipdicas, y componentes esenciales para la viabilidad
de los microorganismos.Tienen gran penetrabilidad y se las utiliza para
esterilizar materiales termolbiles (termosensibles) como jeringas descartables,
sondas, etc. Se utilizan a escala industrial por sus costos.
Rayos Ultravioletas:
Afectan a las molculas de DNA de los microorganismos. Son escasamente
penetrantes y se utilizan para superficies, se utilizan para la esterilizacin en
quirfanos.
Rayos Gamma:
Su empleo esta basado en los conocimientos sobre la energia atomica. Este
tipo de esterilizacin se aplica a productos o materiales termolbiles y de gran
importancia
en
el
campo
industrial.
Puede
esterilizar
antibiticos, vacunas, alimentos, etc.

Filtracin
Se usan membranas filtrantes con poros de un tamao determinado. El tamao
del poro depender del uso al que se va a someter la muestra. Los filtros que
se utilizan no retienen virus ni micoplasmas, estos ltimos estn en el lmite de
separacin
segn
el
dimetro
de
poro
que
se
utilice.
La filtracin se utiliza para emulsiones oleosas o soluciones termolbiles. Su
usa para esterilizar aceites, algunos tipos de pomadas, soluciones oftlmicas,
soluciones intravenosas, drogas diagnsticas, radiofrmacos, medios para
cultivos celulares, y soluciones de antibiticos y vitaminas.
Existen tres tipos bsicos de filtros: Filtros profundos o Filtros de
profundidad:
Consisten de un material fibroso o granular prensado, plegado, activado, o
pegado dentro de los canales de flujo. En este tipo de filtros la retencin de las
partculas se produce por una combinacin de absorcin y de
retencin mecnica en la matriz.
Membranas filtrantes:Tienen una estructura continua, y la retencin se debe
principalmente al tamao de la partcula. Partculas ms pequeas al tamao
del poro quedan retenidas en la matriza del filtro debido a efectos
electrostticos.