Sel-sel warna dapat dibagi menjadi dua golongan yaitu asam dan basa.

Jika warna
terletak pada muatan positif dari zat warna, maka disebut zat warna basa. Jika w
arna terdapat pada ion negatif, maka disebut zat warna asam. Contoh zat warna ba
sa adalah methylen blue, safranin, netral red, dan lain-lain. Sedangkan anionnya
pada umumnya adalah Cl-, SO4-, CH3COO-, COOHCOO. Zat warna asam umumnya mempuny
ai sifat dapat bersenyawa lebih cepat dengan bagian sitoplasma sel sedangkan zat
warna basa mudah bereaksi dengan bagian-bagian inti sel. Pewarnaan bakteri dipe
ngaruhi oleh faktor-faktor seperti : fiksasi, peluntur warna, substrat, intensif
ikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup (Sutedjo, 1991).
Perbedaan ketebalan antara kedua golongan itu dapat merupakan hal yang penting;
dinding sel bakteri Gram negatif pada umumnnya lebih tipis dari yang dimiliki b
akteri Gram positif. Presentasi kandungan lipid bakteri Gram negatif lebih tingg
i daripada Gram positif. Kenyataannya dalam eksperimen pengecatan mennjukkan bah
wa perlakuan dengan alkohol mengeskstrak lipid, yang menyebabkan poisitas atau p
ermeabilitas didding sel meningkat. Denagn demikian, kompleks karbol gentian vio
let dan lugol dapat disari keluar dan bakteri Gram negatif terwarnakan. Keterang
an lain yang hampir sama juga mendasarkan pada perbedaan permeabilitas antara ke
dua golongan bakteri itu, yaitu pada bakteri Gram negatif kandungan peptidoglika
n jauh lebih sedikit sehingga kerapatan jalinannya jauh lebih sedikit daripada b
aktri gram posiif. Pori-pori dalam peptidoglikan bakteri Gram negatif tetap masi
h cukup besar untuk dapat disari keluar kompleks karbol gentian violet dan lugol
. Selautnya, bila sel-sel Gram psitif diperlakukan dngan lisozim untuk menyingki
rkan dinding selnya, sisa strukturnya yang disebut protoplas atau sel tanpa dind
ing akan tercatat juga oleh kompleks karbol gentian violet dan lugol. Tetapi, se
l ini mudah dihapuskan oleh alkohol. Kenyataan ini menunjukkan bahwa struktur di
nding sel bakteri Gram positif itu yag menjadi tempat tertahannya zat pewarna pe
rtama yaitu karbol gentian violet. (Razali, 1987).
Pada pewarnaan gram, bakteri yang telah difiksasi dengan panas sehingga membentu
k noda pada kaca objek diwarnai dengan pewarna basa yaitu crystal violet. Karena
warna ungu mewarnai seluruh sel, maka pewarna ini disebut pewarna primer. Selan
jutnya noda dicuci dan pada noda spesimen ditetesi iodin yang merupakan mordant.
Setelah iodin dicuci, baik bakteri Gram Positif maupun Gram Negatif tampak berw
arna ungu. Selanjutnya noda spesimen dicuci dengan alkohol yang merupakan decolo
rizing agent (senyawa peluntur warna) yang pada spesies bakteri tertentu dapat m
enghilangkan warna ungu dari sel. Setelah alkohol dicuci, noda spesimen diwarnai
kembali dengan safranin yang merupakan pewarna basa berwarna merah. Bakteri yan
g tetap berwarna ungu digolongkan ke dalam Gram Positif, sedangkan bakteri yang
berwarna merahdigoongkan ke dalam Gram Negatif (Suriawiria, 1999).
Proses sterilisasi sangat penting dibutuhkan sebelum memulai maupun mengakhiri
sebuah pekerjaan di laboratorium dengan menggunakan teknik aseptik. Alkohol 70%
yang disemprotkan pada tangan, kaca preparat dan meja, bahkan tangan pun sebelum
nya harus dicuci dengan sabun terlebih dahulu. Hal tersebut berfungsi untuk memb
unuh mikroorganisme yang tak diinginkan agar mendapatkan pengukuran yang akurat.
Pada proses pewarnaan gram, harus gelas obyek yang bersih. Pembersihan ini dilak
ukan supaya gelas obyek bebas lemak dan debu. Pembersihan biasanya menggunakan
alkohol. Setelah di cuci kemudian di beri satu tetes aquades pada permukaan gela
s obyek. Kultur bakteri murni diambil dan diratakan diatas kaca obyek. Pengambil
an kultur bakteri tidak diambil terlalu banyak, karena jika terlalu banyak akan
sulit diratakan dan apabila kultur bakteri tidak dapat diratakan tipis-tipis mak
a bakteri akan tertimbun hal ini akan mengakibatkan pemeriksaan bentuknya satu p
er satu menjadi tidak jelas.
Apabila sudah kering, dilakukan fiksasi dengan cara melewatkan diatas nyala api.
Proses fiksasi dilakukan supaya bakteri benar-benar melekat pada kaca obyek seh
ingga olesan bakteri tidak akan terhapus apabila dilakukan pencucian. Yang perlu
diperhatikan dalam proses fiksasi adalah bidang yang mengandung bakteri dijaga
agar tidak terkena nyala api.
Setelah dilakukan fiksasi kemudian ditetesi dengan larutan gram A (methylene blu

e) sebanyak 1-2 tetes dan dibiarkan selama 1 menit. Kemudian dicuci dengan air m
engalir dan dibiarkan sampai kering dengan cara dianginkan dan menggunakan tissu
e untuk mengeringkan bagian bawah ojek gelas. Pencucian dengan air bertujuan unt
uk mengurangi kelebihan zat warna dari methylen blue.
Kemudian ditambahkan larutan gram B yang merupakan iodium. Gram B merupakan lar
utan yang berfungsi untuk meningkatkan afinitas pengikatan zat warna oleh bakter
i sehingga pengikatan zat warna oleh bakteri lebih kuat, memperjelas warna dari
zat warna tersebut, mempersulit pelarutan zat warna. Pada pewarnaan gram, penamb
ahan larutan mordan menyebabkan terbentuknya persenyawaan kompleks. Tanpa penamb
ahan larutan mordan, zat warna methylene blueakan larut saat penambahan larutan
alkohol. Lalu dibiarkan selama 1 menit untuk dibilas kembali dengan aquades. Aki
bat pemberian cat Gram B, maka pengikatan warna oleh bakteri akan lebih baik (le
bih kuat).
Alkohol 95% ditambahkan atau diteteskan pada biakan bakteri untuk melakukan pene
trasi ke dalam dinding sel dan melunturkan pewarnaan biru dari komplek methylen
blue dan KI pada gram negatif, karena mengandung lipid sedangkan pada gram posit
if akan tetap mempertahankan warna biru karena mengandung peptidoglikan. Larutan
ini juga berfungsiuntuk melarutkan lipida pada membrane bakteri gram negatif ya
ng akan menyebabkan pori-pori sel membesar sehingga meningkatkan daya larut pers
enyawaan methylene blue.Perlakuan ini dilakukan tidak membutuhkan waktu yang lam
a atau secepat mungkin untuk melakukan pembilasan dengan aquades. Kemudian dilak
ukan pengeringan.
Pewarnaan selanjutnya dengan menggunakan safranin (gram D) sebanyak 2 tetes dan
diamkan selama 30 detik. Safranin pada gram D tidak akan menyebabkan perubahan w
arna pada bakteri positif karena persenyawaan kompleksmethylene blue tetap terik
at pada dinding sel. Pada bakteri gram negatif penambahan safranin akan menyebab
kan warna bakteri berubah menjadi merah karena warna biru yang dihasilkan oleh m
ethylene blue telah luntur dengan lisisnya membran sel sehingga safranin dapat t
erikat. Oleh sebab itu, gram D atau zat pewarna kedua berfungsi sebagai pembeda
terhadap zat warna kristal violet (Lay, 1994). Kemudian cuci dengan air mengali
r dan kering dianginkan, Cat ini berwarna merah. Cat ini merupakan cat sekunder
atau kontras. Cat ini berfungsi untuk memberikan warna mikroorganisme non targ
et. Cat sekunder mempunyai spektrum warna yang berbeda dari cat primer. Kemudia
n preparat dikeringkan dengan cara diangin-anginkan lalu dilakukan pengamatan di
bawah mikroskop.
Pemberian methylen blue pada bakteri gram positif akan meninggalkan warna biru.
Perbedaan respon terhadap mekanis pewarnaan gram pada bakteri adalah didasarkan
pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram positif mengandung
protein dan gram negative mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan di
nding selnya tipis. Pemberian alkohol (etanol) pada praktikum pewarnaan bakteri,
menyebabkan terekstraksi lipid sehingga memperbesar permeabilitas dinding sel.
Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna merah
pada bakteri gram negatif sedangkan pada bakteri gram positif dinding selnya te
rdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori
pori mengkerut, daya rembes dinding se
l dan membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk sehingga sel b
erwarna biru.

Gozali, Amir, 2009, Pewarnaan Gram, http://www.gozali.blogspot.com/ gram/pewarn

aan
gram-prinsip.html . Diakses pada tanggal 14 April 2012.
Lay, B.W, 1994, Analisis Mikroba di Laboratorium, PT Raja Grafindo Persada : Jak
arta.
Madigan, M.T, 2003, Brock Biology of Microorganism, Pearson Education : inc. Uni
ted
State of America.
Pelczar, M. J., Chan, E.C.S, 2007, Elements of Microbiology. Mc Graw Hill Book
Company: New York.

Razali, U., 1987, Mikrobiologi Dasar, Jatinangor: FMIPA UNPAD.

Suriawiria, U. 1999. Mikrobiologi. Jakarta : Universitas Terbuka.
Sutedjo, M., 1991, Mikrobiologi Tanah, Rineka Cipta. Jakarta.
Tracy,2005, GramStaining, www.tracy.k12.ca.us/ thsadvbio/ pdfs/ gram%20stain.pdf
,
Diakses pada tanggal 18 April 2014.
Umsl, 2008, StainingBacteria, www.umsl.edu /~microbes/pdf/ stainingbacteria.pdf,
Diakses pada tanggal 18 April 2014.
Volk & Wheeler, 1993, Mikrobiologi Dasar. Penerbit Erlangga : Jakarta
Waluyo. 2004. Mikrobiologi Tanah. Jakarta : CV Rajawali.
Waluyo, L. 2007. Mikrobiologi Umum. Malang : UMM Press.
Hadioetomo, Ratna Siri. 1985. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek, Teknik dan Prose
dur Dasar Laboratorium. PT Gramedia : Jakarta.