Anda di halaman 1dari 6

Kloning, urutan nukleotida dan ekspresi gen manitol dehidrogenase dari

Pseudomonas fluorescens DSM 50106 di Escherichia coli


Abstrak
Sebuah manitol tergantung NAD dehidrogenase? MTLD. dimurnikan untuk
homogenitas dari P. fluorescens DSM50106 dan urutan asam amino N-terminal
ditentukan. Oligonukleotida disimpulkan dari urutan peptida ini digunakan
sebagai probe untuk mengisolasi gen manitol dehidrogenase? MTLD. dari
pustaka genom P. fluorescens. Analisis urutan nukleotida dari 1,8 kb NruI
fragmen yang mengandung seluruh gen mTLD mengungkapkan open reading
frame dari 1482 bp encoding protein dengan berat molekul dihitung dari 54,49
kDa. Enzim berbagi kesamaan yang tinggi dengan dehidrogenase manitol dari
rhodobacter sphaeroides dan manitol dehidrogenase diduga Saccharomyces
cereisae dengan identitas keseluruhan di urutan asam amino dari 44% dan 42%,
masing-masing, sedangkan kesamaan untuk manitol-1-fosfat dehidrogenase
Escherichia coli atau Enterococcus faecalis hanya sekitar 23% dari asam amino
yang identik. Dengan pembangunan ekspresi diinduksi plasmid aktivitas spesifik
dehidrogenase manitol disintesis di E. coli meningkat dari 0,02 U? Protein.y1 mg
sampai 10 U? Protein.y1 mg. Setelah fusi enam kodon histidin ke 3X akhir gen
mTLD dan ekspresi dalam E. coli manitol aktif dehidrogenase dapat dimurnikan
dalam prosedur dua langkah dengan kromatografi afinitas menggunakan kolom
matriks Ni2q. Enzim murni dipamerkan aktivitas spesifik 46 U? Protein.y1 mg dan
terbukti menjadi dehidrogenase poliol dengan substratespectrum pengoksidasi
luas efisien manitol, sorbitol dan arabitol

Introduction
Enam-karbon manitol gula alkohol asiklik ditemukan dalam organisme beragam
terjadi pada bakteri, jamur, ganggang, lumut dan tanaman yang lebih tinggi di
mana ia digunakan sebagai karbon dan sumber energi, penyimpanan karbon,
pemulung radikal bebas dan osmoregulator
Karena sifat bulking menguntungkan dan lain-lain, seperti bahwa itu adalah gigiramah dan aman bagi penderita diabetes, manitol secara luas digunakan dalam
farmasi dan industri makanan. Untuk tujuan itu terutama dihasilkan oleh reduksi
katalitik fruktosa dengan gas hidrogen dan katalis nikel. Karena selektivitas
rendah katalis, sorbitol isomer adalah besar produk sampingan dari proses
muncul hingga jumlah yang sama dengan mannitol
Sebuah selektivitas yang lebih tinggi dalam mengkonversi fruktosa ke manitol
dicapai dengan proses fermentasi menggunakan Leuconostoc mesenteroides
atau Lactobacillus sp.. Atau, manitol mungkin dihasilkan dari fruktosa dalam
reaktor enzim dengan manitol dehidrogenase dan nikotinamida adenin
dinukleotida-sebagai koenzim bersama-sama dengan sistem koenzim-regenerasi
Beberapa NADq- atau NADPq tergantung manitol dehydrogenases D-manitol:
fruktosa tases 2-oxidoreduc-. telah diisolasi dan dikarakterisasi dari organisme
yang berbeda termasuk bakteri Lactobacillus breis, ragi Saccharomyces
cereisiae dan jamur seperti Agaricus bisporus. Urutan nukleotida yang tersedia
sejauh ini dari gen manitol dehidrogenase mikroba rhodobacter sphaeroides,
yang dikloning dan dinyatakan dalam Escherichia coli dan dari manitol

dehidrogenase diduga, diperoleh dalam proyek sekuensing Saccharomyces


cereisiae? GenBank nomor aksesi U18795. Selanjutnya, cDNA dari
dehidrogenase manitol yang unik, manitol sebuah: mannose 1-oksidoreduktase
dari seledri diisolasi dan sequencing
Dengan skrining strain bakteri, dehidrogenase manitol manitol diinduksi
ditemukan pada Pseudomonas fluorescens DSM 50106 yang mampu mengurangi
fruktosa untuk manitol dan untuk mengoksidasi manitol untuk fruktosa. The
manitol dehidrogenase dari P. fluorescens ditemukan monomer; itu ketat NADHdependent dan menunjukkan afinitas lebih tinggi untuk koenzim ini? 0,042 mM ..
pH-optimal untuk pengurangan fruktosa adalah 7,3 dan 10,0 untuk oksidasi
manitol, masing-masing
Karena ini parameter enzimatik dan struktur monomer, yang dehidrogenase
manitol dari P. fluorescens tampaknya menjadi protein yang cocok untuk
enzimatik produksi mannitol dengan pengurangan fruktosa. Di sini kita
melaporkan kloning dan sekuensing gen dehidrogenase manitol dari P.
fluorescens DSM 50106, overekspresi gen pada E. coli dan pembentukan
prosedur pemurnian sederhana dan cepat untuk dehidrogenase manitol
disintesis dalam E. coli.
Material and methods
1. Strain bakteri, plasmid, media dan kondisi kultur
Strain dan plasmid yang digunakan dalam pekerjaan ini ditunjukkan pada
Tabel 1. E. coli strain yang baik ditumbuhkan dalam medium cair DYT atau
DYT agarplates w13x, baik dilengkapi dengan antibiotik yang tepat
ampisilin: 100 mgrml; kanamisin: 50 mgrml. di 378C. Untuk induksi
promotor tac strain ditumbuhkan di DYT untuk OD s0.3 kemudian 0,1-1
mM IPTG itu 600 ditambahkan dan sel lanjut diinkubasi selama 4 jam pada
378C sebelum ekstrak mentah disiapkan.
Pseudomonas fluorescens ditumbuhkan di 308C pada DYT agar piring,
medium cair DYT atau M9 menengah ditambah dengan glukosa 0,5% atau
manitol.
2. Pemurnian dehidrogenase manitol dan penentuan urutan asam amino Nterminal
A 1-l budaya P. fluorescens, tumbuh selama 15 jam pada 308C di media
M9 mengandung 0,5% mannitol, dipanen dengan sentrifugasi? 10 menit,
5000 rpm., Dicuci dua kali dalam assay enzim penyangga? Dapar fosfat
0,1 M kalium, pH 7,3. dan diresuspensi dalam 20 ml penyangga. Setelah
lisis sel? 3 = french press, 800-1100 psi. puing-puing telah dihapus oleh
sentrifugasi? 45 menit, 15.000 rpm, Sorvall SS34 rotor. dan supernatan
menjadi sasaran presipitasi garam? 30%? NH. SO .. Supernatan yang
mengandung manitol dehidrogenase itu didialisis terhadap serangan
buffer A? 20 mM triethanolaminerHCl, pH 7,0. dan pemurnian lebih lanjut
dilakukan oleh MonoQ kromatografi pertukaran anion kolom HR 5r5?;
Pharmacia .. Kolom diseimbangkan dengan penyangga A dan protein
dielusi dengan gradien linier dari 0,1-0,4 M natrium klorida dalam buffer A
laju alir 0,5 mlrmin .. Fraksi yang mengandung manitol aktif
dehidrogenase dikumpulkan dan lagi dipisahkan pada kolom MonoQ.
Setelah langkah pemurnian akhir menggunakan saringan molekuler
Superdex 200 HR10r30?; Pharmacia, pre-equilibrium dan elusi dengan
penyangga B: 50 mM kalium fosfat, 150 NaCl, pH 7,3; laju alir 0,25 mlrmin.

mannitol dehidrogenase murni diperoleh. 10 mg protein dipisahkan pada


10% SDS-PAGE, dihapuskan ke membran PVDF dan amino N-terminal
ditentukan oleh degradasi Edman otomatis

3. Persiapan ekstrak mentah, tes enzim dan tekad protein


Untuk persiapan ekstrak mentah untuk tes enzim, budaya 20-ml E. coli
yang mengandung mTLD ekspresi plasmid dipanen dengan sentrifugasi 4
jam setelah induksi dengan IPTG, sel-sel dicuci assay enzim penyangga
dan diresuspensi dalam 2 ml buffer. Sel terganggu oleh sonikasi?
Ultrasonics sonikator, microtip, 2 = 30 s, siklus 50% berdenyut. dan puingpuing sel dihapus oleh sentrifugasi? 30 menit, 15 000 rpm, Sorvall SS34 ..
aktivitas dehidrogenase Mannitol ditentukan secara spektrofotometri.
Untuk pengurangan 10-100 ml ekstrak kasar dalam buffer 0,1 M K-fosfat?
Volume akhir 700 ml. dicampur dengan 200 ml 2 M fruktosa dan 100 ml 3
mM NADH. Absorbansi pada 340 nm ditentukan selama waktu 4 menit di
interval 15 s di 258C. Dalam reaksi oksidasi 200 mM mannitol dan 5 mM
NADq digunakan dan enzim penyangga assay adalah 0,1 M glycinerNaOH?
PH 10.1 .. aktivitas manitol dehidrogenase Satu unit didefinisikan sebagai
pembentukan 1 mmol NADq per menit pada 258C. Konsentrasi protein
ditentukan dengan metode Bradford menggunakan albumin serum sapi
sebagai standar protein.
Skrining untuk kegiatan MDH selama prosedur pemurnian dilakukan
dengan uji pelat mikrotiter seperti yang dijelaskan
4. Pemurnian rekombinan manitol dehidrogenase dengan kromatografi
afinitas
Sel dari budaya 400-ml E. coli JM109 pETR241 diinduksi selama 6 jam
dengan 0,1 mM IPTG dipanen, dicuci, segaris dan? NH. SO precipi- 4 2 4
tated seperti yang dijelaskan dalam Bagian 2.2. 5-10 mg protein yang
dimuat ke kolom Ni2q-NTA-resin? 2 ml Qiagen .. Kolom dicuci dengan
volume 10 kali lipat dari cuci penyangga 50 mM potassium phos-Phate
bufferr300 mM NaClr10% gliserol, pH 6.0 dan terikat mannitol
dehidrogenase dielusi dengan mencuci buffer yang mengandung

peningkatan konsentrasi imidazol? 50-400 mM. atau dengan mengurangi


pH cuci penyangga? pH 6,0-4,0 .. aktivitas mTLD dalam pecahan dielusi
ditentukan seperti yang dijelaskan dan protein dianalisis pada 10% SDSPAGE
5. Manipulasi DNA dan transformasi plasmid
Untuk persiapan skala kecil dari plasmid DNA dari E. coli, metode Kieser
digunakan. Berskala untai ganda DNA plasmid diisolasi seperti yang
dijelaskan oleh Clewell dan Helinski. DNA genom dari P. fluorescens
dimurnikan dengan metode yang dijelaskan oleh Sedlmeier dan
Altenbuchner dari budaya 100-ml. DNA fag l diisolasi sesuai dengan
metode yang dijelaskan oleh Sambrook et al. Untuk transformasi E.coli
strain, metode Chung et al. digunakan.
Enzim restriksi, ligase T4 DNA, alkali fosfatase, Klenow polimerase dan T4
polinukleotida kinase diperoleh dari Boehringer, Mannheim dan digunakan
seperti yang direkomendasikan oleh produsen. Polimerase Taq-DNA, dNTP
dan kit sequencing Auto Reade dibeli dari Pharmacia, Freiburg. Teknik DNA
standar dilakukan seperti yang dijelaskan oleh Sambrook et al.
Oligonukleotida untuk sequencing, reaksi PCR dan Southern blot
hybridization disintesis pada synthesizer Milligen Cyclonee Ditambah DNA.
6. Pembangunan perpustakaan genom P. Fluorescens
Untuk pembangunan perpustakaan genom l RESIII, turunan dari fag l RESII
digunakan. DNA kromosom dari P. fluorescens sebagian dicerna dengan
Sau3AI dan dipisahkan pada gel agarosa LMP. Fragmen DNA dengan
ukuran sekitar 10 kb dielusi, dimurnikan dan diikat ke BamHIrSalI dicerna l
DNA. Dalam kemasan vitro DNA dilakukan dengan dua ekstrak kemasan
secara terpisah terisolasi w28x dan infeksi E. coli TAP90 dilakukan seperti
yang dijelaskan w13x. Untuk konversi l DNA ke dalam plasmid membentuk
metode yang dijelaskan oleh Altenbuchner w16x digunakan.
7. Analisis urutan DNA
Nukleotida urutan untai ganda DNA plasmid dilakukan menurut metode
terminasi rantai didesoxy dari Sanger w29x dengan otomatis ALF Laser
neon sequencer? Pharmacia. menggunakan Auto Reade sequencing kit?
Pharmacia .. DNA dianalisis pada gel poliakrilamid 6,6% dijalankan pada
508C. Persiapan template untuk sequencing dari kedua untai dari 1,8 kb
NruI fragmen yang mengandung mTLD dilakukan oleh subcloning fragmen
yang berbeda ke dalam vektor pic atau dengan penghapusan fragmen.
Urutan nukleotida dianalisis pada workstation Sun menggunakan program
dari University of Wisconsin Genetika Komputer Group paket, versi 8.01.
Untuk program 'preferensi kodon', meja penggunaan kodon dari Wada et
al. w30x, dihitung dari 259 gen Pseudomonas, digunakan. Pencarian data
base dijalankan dengan program BLASTP, BLASTN atau BLASTx pada
ledakan surat elektronik server dari Pusat Nasional untuk Biotechnology
Information di Bethesda, MD.
Hasil
1. Pemurnian mTLD dan penentuan urutan asam amino N-terminal
Prosedur pemurnian mTLD dari P. fluorescens DSM 50106 dijelaskan
dalam Bagian 2 dan diringkas dalam Tabel 2. mannitol dehidrogenase
dimurnikan 47 kali lipat untuk homogenitas dengan pemulihan 3% dan
spec. tindakan. dari 31 U? protein.y1 mg. 4 = 2,5 mg enzim murni
dipisahkan pada 10% SDS-PAGE dan dihapuskan ke membran PVDF.

Oleh degradasi Edman otomatis urutan pertama 20 asam amino dari


mTLD ditentukan? Gambar. 1 .. Urutan peptida back-diterjemahkan ke
dalam urutan nukleotida dan oligonukleotida? S432. dari 20 nukleotida
menurut
5X-akhir
mTLD
disintesis?
Gambar.
1
..

2. Kloning mTLD dari P. Fluorescens


Sebuah perpustakaan genom P. fluorescens dibangun menggunakan
fag l RESIII sebagai vektor? Lihat Bagian 2 .. Dengan hibridisasi dengan
oligonukleotida 5X berlabel S432 delapan dari 8000 fag diuji
menunjukkan sinyal hibridisasi jelas, yang menunjukkan bahwa mereka
semua mengandung setidaknya 5X-terminus mTLD. Setelah konversi

dari DNA fag ke otonom mereplikasi plasmid di strain E. coli HB101


F'lac w :: Tn1739 tnpRx, salah satu klon? Mengandung plasmid
pETR127. dipamerkan aktivitas mTLD rendah di ekstrak kasar yang
dibuat dari jenis virus ini, sekitar 20 mU? protein.y1 mg dibandingkan
dengan 400 mU? protein.y1 mg ditemukan di P. fluorescens ekstrak
kasar setelah induksi dengan manitol.
Dalam rangka untuk lebih subclone dan melokalisasi gen mTLD pada
pETR127, plasmid itu dicerna dengan berbagai enzim restriksi dan
fragmen hibridisasi dengan oligonukleotida S432. Sebuah 1,8 kb NruI
fragmen menunjukkan hibridisasi dimasukkan ke situs EcoRV dari
pIC19H vektor hilir promotor lac? PETR135.1 dan pETR135.2 .. E.coli
JM109 ditransformasi dengan pETR135.1 dipamerkan cific spe aktivitas
manitol dehidrogenase 600 mU? protein.y1 mg setelah induksi dengan
1 mM IPTG, sedangkan dengan pETR135.2? dengan fragmen NruI
dalam orientasi berlawanan dengan promotor lac., tidak ada aktivitas
mTLD terdeteksi? Tabel 3 .. ini menunjukkan bahwa seluruh gen mTLD
terletak di NruI fragmen kloning dan ekspresi gen terjadi melalui LACP
di E. coli.
3. Sekuensing mltd