BAB III

METODE PENELITIAN

III.1. Jenis Penelitian

Penelitian ini menggunakan eksperimental laboratorik dengan metode
pendekatan post test-only control group design yang menggunakan kultur sel dalam
sumuran sebagai unit penelitian. Perlakuan pemberian 5FU dan Triamsinolon pada
biakan fibroblas jaringan keloid kulit manusia yang diambil dari 1 keloid donor
dengan keluaran sintesis kolagen dan proliferasi fibroblas.
III.2. Rancangan Penelitian
Fibroblas dari
Keloid pasien

Kultur + isolasi
fibroblas

5-fluorourasil

Triamsinolone
Asetonide

kontrol

Sirius Red

Kolagen TidakTerlarut

Gambar 5. Rancangan Peneltian

18

III.3. Populasi dan Sampel Penelitian

Populasi pada penelitian ini adalah kultur fibroblas keloid manusia yang
diambil dari seorang penderita keloid dan dibiakkan dalam Dulbecos Modified
Eagles Medium (DMEM) yang mengandung FCS 10% (serum), Penicillin dan
Streptomycin. yang dipanen dari kultur fibroblas dalam flask dan dilakukan
penghitungan proliferansi fibroblas. Sampel penelitian adalah biakan fibroblas keloid
dibagi menjadi 7 kelompok perlakuan yaitu 5-FU dosis 10 mg/ml, 20 mg/ml, 40
mg/ml, Triamsinolon Asetonida (TA) dosis 20 M, 40 M, 60 M serta kontrol dan
masing masing dilakukan 3 kali perlakuan. Sampel penelitian tersebut telah
mendapat persetujuan dari dr. Yohanes Widodo Wirohadijojo Sp. KK (K) selaku
dosen pembimbing lapangan
III.4. Tempat Penelitian
Penelitian dilakukan dilaboratorium Teknologi Kedokteran Ilmu Kesehatan
gedung Radioputro lantai III Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada
Yogyakarta.

III.5. Alat dan Bahan

a. Bahan Penelitian

b. Alat Penelitian

Jaringan keloid

Masker

DMEM Gibco 10 x 1

Forsep steril

FCS 10%

Scalpel no. 15

Amfoterisin B

Tabung konikal steril Falcon

Triamsinolon Acetonida

50 cc

5-FU

Tabung konikal steril NUNC

Gentamicin

15 cc

Alcohol 70%

Gelas Petri Dish steril 9 cm

Phospat Buffer Saline A

Inkubator CO2 steril 5%

19

(Gibco)

Mikropipet steril

Povidon Iodine 10%

Selotip kuning dan biru

NaOH (Merck)

Mikroskop inverted

Picro Sirius red

Geles Beker 100 cc

Penstrip (Gibco)

Pipet elektrik

III.6. Prosedur Penelitian

1. Donor fibroblast
Fibroblas diisolasi dari material keloid 3 pasien yang didapatkan di bagian
laboratorium Ilmu Penyakit Kulit dan Kelamin RSUP DR Sardjito Yogyakarta.
2. Teknik kultur fibroblas
Material keloid akan dibilas sekali dalam 10% povidone iodine dan 3 kali
pada PBS steril selama masing-masing 10menit. Material kemudian dipotong pada
potongan 2 mm dan diletakkan pada Petri dishes 35 mm sterile, dibenamkan pada
20% serum sapi yang mengandung medium dan diinkubasi pada 37C dengan 5%
CO2 semalam. Pada keesokan hari, material di cek untuk ditambahkan dan 2 ml dari
medium komplit (DMEM + 10% serum sapi + 100 unit -100 ug/ml gentamicin) yang
akan ditambahkan secara perlahan dan diinkubasi ke dalam inkubator CO2. Medium
komplit akan diganti tiap 3 hari dan pertumbuhan fibroblastik akan dicapai pada
minggu ke3. Pasase akan dilakukan dengan sel tertripsinase dengan 0,025% tripsin
dalam PBS, selesai dengan menambahkan medium komplit, dibilas 3 kali dengan
pencampuran dan disentrifugasi 100G pada medium komplit. Sel bersih dan segar
kemudian di rekultivasi ke dalam flask dishes sampai Pasase III dicapai.
3. Perlakuan Terapi
Fibroblas dipisahkan dengan teknik ezimatik menggunakan tripsinase. 200L
dari suspensi diselubungi pada setiap sumur dalam 7 microplate setelah penambahan
dari medium komplit sebagai berikut :
a. 5FU 10 mg/ml

20

b. 5FU 20 mg/ml
c. 5FU 40 mg/ml
d. Triamsinolon Asetonida (TA) 20 M
e. Triamsinolon Asetonida (TA) 40 M
f. Triamsinolon Asetonida (TA) 60 M
g. Kontrol
4. Collagen assay
1. Sedot medium dari 96 micro well plate
2. Cuci dengan PBS 3x, 200 l per well
3. Fiksasi dengan Bouin solution selama 1 jam
4. Cuci dengan air mengalir sampai warna kuning hilang
5. Keringkan plate over night
6. Tambahkan 200 l Sirius red campuran
7. Inkubasi 1 jam
8. Buang Sirius red, cuci dengan 200 l HCL 0,1 N
9. Buang HCL (ulangi pencucian dengan HCL sampai warna Sirius red bersih
dari dinding dan supernatant).
10. Baca pada panjang gelombang dengan plate reader

5. Analisis statistik data

Data tentang subyek dari hasil penelitian dimasukkan dan diolah dengan
program SPSS untuk menganalisa perbedaan rata- rata antara masing masing
kelompok terapi dengan tingkat signifikan yang digunakan p = 0.05.

III.7. Variabel penelitian

a. Variabel Independen
1. Sel kolagen fibroblas keloid yang diberikan perlakuan terapi Triamsinolon
Asetonide.
2. Sel kolagen fibroblas keloid yang diberikan perlakuan terapi 5-FU.
21

3. Kontrol (tidak dilakukan modalitas terapi).

b. Variabel Dependen
1. Hasil densitas dari kolagen fibroblas yang diterapi dengan Triamsinolon
Asetonida, 5-FU dan kontrol yang diukur timbunan kolagen fibroblas pada
keloid.

22