Anda di halaman 1dari 47

Bab 7 Prinsip-prinsip Biologi Molekular dan Genetika Kardiovaskular

Elizabeth G. Nabel
Biologi molekular dan genetika saat ini membentuk dasar yang solid untuk ilmu
kardiovaskular dan kedokteran. Dalam dua dekade terakhir, konsep biologi
molekular dan genetika merembet semua aspek kedokteran. Prinsip-prinsip disiplin
ini merupakan ujung tombak dari kurikulum sekolah kedokteran. Lab-lab ilmuwandokter secara rutin menggunakan pendekatan-pendekatan genetika molekular untuk
menguji hipotesis tentang penyakit kardiovaskular. Dokter punya akses ke susunan
pernagkat genetik dan molekular untuk memandu diganosis dan treatment pasien.
Produksi banyak agen terapeutik saat ini menggunakan teknologi asam
deoksiribonukelik rekombinan (DNA).
Terobosan-terobosan dalam pemahaman kami tentang dasar genetika penyakit
kardiovaskular telah sangat menakjubkan. Apresiasi kami terhadap mekanisme di
mana gen-gen tunggal menyebabkan penyakit, bahkan ketika penyakit ini tidak
lazim mendorong padapemahaman patogenesis penyakit-penyakit kardiovaskular
yang lebihumum. Dengan selesainya perangkaian genom manusia, penemuanpenemuan genomik pada penyakit kardiovaskular saat ini terjadi dengan cepat.
Bagaimana penemuan-penemuan ini akan diterjemahkan ke perawatan pasien
penyakit kardiovaskular saat ini masih sulit diprediksikan.
Bab ini menjelaskan prinsip-prinsip dasar biologi molekular dan genetika. Ini
dirancang sebagai tinjauan singkat dan sumber referensi, yang dimaksudkan untuk
mempersiapkan pembaca bagi diskusi-diskusi aplikasi kardiovaskular spesifik
dalam bab-bab lain dalam teks ini dan dalam literatur kontemporer. Referensi

diberikan untuk ulasan umum tentang sebuah topik dan juga sebagai ulasan
mendalam terhadap setiap subyek.
Prinsip-prinsip biologi sel dan siklus biologi
Semua organisme hidup terdiri atas sel dan semua sel berasal dari sel-sel yang ada
sebelumnya. Sel-sel disusun dalam beberapa kompartemen. Prokariot seperti
bakteri mengandung sebuah kompartemen sel tunggal yang dibatasi oleh sebuah
membran atau beberapa membran. Eukariot seperti mamalia ditentukan oleh
pembelahans etiap sel ke dalam sebuah nukleus yang berisi bahan genetik, yang
dikelilingi oleh sitoplasma, dibatasi oleh membran plasma yang menandai tepi sel.
Sitoplasma juga berisi kompartemen-kompartemen khusus, juga dibatasi oleh
membran. Untuk menentukan pelaksanaan isntruki-instruksi genetikdalam sebuah
sel kita harus mempertimbangkan sifat dari bebragai kompartemendan bagaimana
ini berfungsi menciptakan daerah-daerah dengan ciri-ciri yang berbeda.
Sel mamalia merupakan struktur yang sangat terkompartementalisasi (gb 7.1).
membran luar yang disebut membran plasma adalah dua lapis lemak yang
dimaksudkan untuk mengeluarkan lingkungan akueous seperti fluida ekstraselular
membran plasma diisi dengan protein transmembran yang disebut reseptor. Sebuah
reseptor memiliki tempat pengikatan yang mengenali suatu ligan pada sisi eksterior
membran. Pengikatan ligan biasanya memicu perubahan pada protein yang
ditransmisikan dalam muka sitoplasmik oleh perubahan konformasional dalam
protein reseptor atau sebagai pergerakan seluruh protein ke dalam interior.
Perubahan ini memicu perubahan-perubahan lain dalam sel dan memberi jalan
untuk merespon lingkungan. Tipe hubungan ini disebut transduksi sinyal.

Sitoplasma berisi jejaring membran. Lembaran-lembaran membran menyusun


retikulum endoplasmik (ER) dan aparatus golgi. ER terdiri ats lembaran kontinyu
membran-membran yang sangat berlipat yang meluas dari membran inti terluar. ER
bisa dibagi menjadi dua tipe, yang merupakan bagian dari lembaran membran yang
sama. ER kasar memiliki ribosom, partikl-partikel kecil yang berhubungandengan
sintesis protein pada permukaannya sementara ER halus tidak. Aparatus golgi
terdiri atas tumpukan-tumpukan sisterna terpisah. Protein yang telah dimodifikasi
dalam ER memasuki aparatus golgi, mengalami modifikasi selanjutnya dan
kemudian keluar. Fungsi utama ER dan aparatus golgi adalah menyortir protein
menurut tujuan, menggunakan sinyal-sinyal inheren dalam rangkaian protein.
Proses mengarahkan protein ke tujuan akhirnya ini disebut protein sorting atau
trafficking. Mitokodria merupakn organel-organel khusus dalam sitoplasma yang
menghasilkan energi yang disimpan dalam bentuk adenosin triphosphate dari
oksidasi senyawa-senyawa yang mengandung karbon seperti gula atau lemak.
Lisosom merupakan badan-badan berlapis membran yang berisi enzim-enzim
hidrolitik yang kemudian memproses protein dan makromolekul lain di dalam sel.
Bentuk sel ditentukan oleh sitoskeleton yang berisi jaringan serat-serat protein yang
meluas melintasi dan di sekitar sel. Tiga kelas serat adalah filamen aktin,
mikrotubula, dan filamen-filamen perantara.
Fitur terpenting dari nukleus adalah materi genetik. Nukleus memiliki penampilan
granular karena kromatin yang mudah dikenalidengan stain-stain tertentu. Antara
pembelahan sel, kromatin membentuk masa tunggal dan padat. Ketika sebuah
selmembelah, kromatinnya bisa terlihat terdiri atas sejumlah struktur seperti benang
khusus yang disebut kromosom. Ciri utama sel kecuali yang mencapai kondisi
3

perkembangan final dan khusus (diferensiasi terminal) adalah kemampuan untuk


membelah. Banyak perubahan struktural terjadi di dalam sebuah sel selama
pembelahan. Membran dan sitoskleton mengalami reorganisasi ekstensif. Sel diatur
oleh sebuah struktur baru yang disebut spindel yang berfungsi memungkinkan
distirbusi kromosom ke sel-sel kembar perubahan-perubahan ini menghentikan
banyak aktivitas sel sebelumnya ekspresi gen, sintesis dan sekresi protein dan
motilitas sel.
Siklus sel, periode antara pelepasan sel yang baru dibentuk sebagai progeni
pembelahan dan pembelahan selanjutnya menjadi dua sel kembar, terdiri atas dua
bagian. Interfase, sebuah periode yang relatif panjang, mereprsentasikan waktu di
mana sel terlibat dalam aktivitas sintetisnya dan mereproduksi komponenkomponen subselularnya. Selama interfase, sel memiliki kompartemen inti khusus,
mengandung sebuah masa kromatin padat. Selama mitosis, periode waktu yang
relatif singkat, pembelahan aktual menjadi dua sel kembar terjadi. Dalam sel-sel
dalam mitosis, spindel mengantikan organisasi internal sel dan kromosom individu
muncul. produk-produk seri pembelahan mitotik yang menghasilkan organisme
disebut sel-sel somatik. Selama perkembangan embrionik, banyak atau sebagian
besar sel somatik berlangsung melalui siklus sel. Dalam organisme dewasa banyak
sel berdiferensiasi akhir dan tidak lagi membelah. Sel-sel ini tetap pada fase
stasioner di mana tidak terdapat sintesis DNA, sama dengan interfase perpetual.
Mitosis merekapitulasi konstitusi kromosm sel. Setiap sel kembar memulai
kehidupannya dengan dua kopi

dari setiap kromosom. Kopi-kopi ini disebut

homolog. Jumlah total kromoso disebut set diploid dan memiliki 2n anggota.
Selama interfase, sel yang tumbuh menduplikasi materi kromosomalnya. Pada awal
4

mitosis, setiap kromosom nampak mebelah secara longitudinal untuk menghasilkan


dua kopi disebut sister kromatid. Sel ini sekarng berisi 4n kromosom, diatur sebagai
2n pasang sister kromatid. Proses mitosis terdiria tas empat fase: profase, metafase,
anafase dan telofase, berakhir dalam sitokinesis di mana sel membelah dan setiap
sel kembar memiliki set kromosom komlit yang sama, satu anggota dari setiap
pasang berasal dari setiap induk (gb 7-2). Setiap fase terdiri atas gerakan-gerakan
sentromer berbeda, daerah sentral dan konstriksidari kromosom. Gerakan-gerakan
ini penting bagi pemisahan pasangan-pasangan kromosom menajdi setiap sel
kembar dan perampungan pembelahan sel.
Sebelum mitosis, kromosom helai ganda pecah atau kerusakan DNA lain diperbaiki
oleh seri checkpoin siklus sel. Di bawah kondisi normal, DNA selular diperbaiki
dan sel menyelesaikan mitosis. Sel-sel yang DNAnya tidak diperbaiki akan
mengalami apoptoisis atau kematian sel terprogram. Mekanisme ini memungkinkan
percepatan pembelahan sel di mana DNA kromosal tetap utuh. Karsinogenesis bisa
timbul jika pembelahan sel lepas dari kontrol checkpoin dan sel dengan DNA helai
ganda pecah atau bentuk-bentuk DNA rusak lainnya membelah secara tak
terkontrol.
Protein-protein esensial dalam kontrol checkpoin siklus sel adalah cyclin dan
cyclin-dependent kinase (CDK) (Gb 7.3). CDK merupakan kompleks-kompleks
holoenzim yang berisi berisi subunit regulatoris siklin dan sub unit katalitik
CDK. Empat fase khusus dari siklus sel diatur oleh kompleks siklin-CDK: fase
Gap 1 atau G1. Replikasi DNA atau fase S, fase Gap 2 atau G2, dan mitosis atau
fase M. Kontrol poin pembatasan dalam fase G1 dimediasi oleh dua CDK, cyclin

D- dan cyclin-E-dependent kinase. Siklin tipe-D (D1, D2, dan D3) berinteraksi
secara kombinas idengan dua partner katlitik, CDK4 dan CDK5, awal pada G1
menghasilkan setidaknya enam holoenzim yang diekspresikan dalapola spesifik
jaringan. Cyclin E memasuki sebuah kompleks dengan partner katalitiknya
CDK2

dan

berkolaborasi

dengan

cyclin

D-dependent

kianse

untuk

menyelesaikan fosforilasi rtinoblastoma tumor-supressor protein (rb) akhir pada


G1 yang menghasilkan transit melalui checkpoin G1-S ke dalam fase S.
Inhibitor endogen dari cyclin-CDK, yang disebut inhibitor kinase bergantungcyclin atau CKI, diekspresikan di seluruh G1 untuk menghambat fosforilasi dan
aktivasi kompleks cyclin-CDK, yang menyebabkan penahanan GI. CKI
berfungsi mencegah transisi melalui checkpoin G1 dan menghambat mitosis,
menyebabkan penahanan pertumbuhan sel. CKI digolongkan menjadi dua
keluarga berdasarkan pada struktur-struktur mereka dan target-target CDK.
Protein-protein CIP/KIP merupakan inhibitor yang bekerja luas yang mengubah
aktivitas-aktivitas cyclin-D, cyclin-E dan cyclin A-dependent kianse. Keluarga
ini meliputi p21 (Cip1), p27 (Kip1), dan p57 (Kip2). Ketiganya berisi motifmotif karakteristik dalam daerah amino-terminal yang mengikat siklind an
substrat CDK p21 (Cip1) berfungsi sebagai sebagai efektor downstream dari
faktor transkripsi dan gen supresor tumor, p53, menyebabkan reparasi kerusakan
DNA dan/atau mendukung apoptosis. P27 (Kip1) adalah inhibitor kuat dari
proliferasi sel dalam jaringan normal dan sakit dan normal dan merupakan
mediator kritis dalam cidera jaringan, inflamasi dan perbaikan luka. Keluarga
INK4 (inhibitor CDK4) dari protein terdiri atas INK4A, INK4B (p15),

INK4C(p18) dan INK4D (p19). CKI ini mengandung pengulangan ankyrin


ganda, mengikat hanya ke CDK4 dan CDK6 dan bukan CDK yang lain dan
secara khusus menghamabt sub unit katalitik CDK4 dan CDK6. Protein-protein
INK merupakn regulator penting pertumbuhan tumor dan dalam biologi
perkembangan,

tapi

berperan

lebih

kecil

dalam

penyakit-penyakit

kardiovaskular.

Cidera pada pembuluh darah atau jantung menyebabkan proses remodeling yang
bersifat adaptif di bawah kondisi normal atau maladaptif dalam kondisi
patofisiologi penyakit (lihat bab 22 dan 38). Sebagai respon terhadap stimuli
fisiologis, sel-sel otot halus vaskular (VSMC) di dalam media berproliferasi dan
bermigarsi ke intima membentuk luka vaskular multi lapis atau neointima. Secara
normal ini merupakan proses yang membatasi diri yang menyebabkan lual vaskular
yang sembuh dengan baik dan pemeliharaan aliran darah luminal. Dalam penyakitpenyakit vaskular tertentu proliferasi VSMC menjadi berlebihan menyebabkan lesi
patologis dalam pembuluh darah yang pada akhirnya menyebabkan gejala-gejala
klinis. Penyakit-penyakit ini sering ditandai oleh inflamasi sistemik atau lokal yang
memperburuk repson prliferatif VSMC. CIP/KIP CKIs merupakan regulator
penting dari remodeling jaringan dalam vasklatur. p27 (Kip1) secara secara
konstitutif

diekspresikan

dalam

VSMC

dan

sel-sel

endotel

arteri

dan

didownregulasi setelah cidera vaskular atau pemaparan VSMC dan sel-sel endotel
ke mitogen. Setelah ledakan proliferatif, VSMC mensintesa dan mensekresi
molekul matriks ekstraselular yang menandai VSMC dan sel-sel endotel
menyebabkan induksi p27 (Kip1) dan p21 (Cip1) dan supresi siklin E-CDK2.

Ekspresi CIP/KIP CKI menyebabkan penahanan siklus sel dan inhibisi pembelahan
sel. P27 (Kip1) juga meruapakn regualtor penting inflamasi jaringan melalui efekefeknya terhadap proliferasi T-limposit dalam vaskulatur, p27 (Kip1) memedaisi
reparasi vaskular melalui regulasinya terhadap proliferasi, inflamasi dan sel-sel
progenitor sungsum tulang. Delesi genetik p27 (Kip1) pada tikus menyebabkan
hiperplasia jinak pada sel epitelial dan mesodermal dalam organ-organ ganda yang
meliputi jantung dan vaskulatur. P21 (Cip1) diperlukan untuk pertumbuhan dan
diferensiasi pada jantung, tulang, kulit dan ginjal dan mencakup kerentanan
terhadap apoptosis. CKI ini berfungsi dengan cara yang bergantung dan tidak
bergantung p53. Pada jantung P21 (Cip1) diekspresikans ecara independen dari p53
pada miosit kardiak; overekspresi p21 (Cip1) di dalam miosit menyebabkan
hipertropi.
Sebagian besar sel kanker manusia mempertahankan mutasi yang mengubah fungsi
p53 atau Rb dengan mtuasi langsung rangkaian-rangkaian gen atau dengan
menargetkan sel-sel yang bekerja secara epistatik untuk mencegah fungsi normal
normalnya. Rb membatasi proliferasi sel dengan mencegah entri ke fase S.
mekanisme

ini

adalah

penghambatan

faktor-faktor

transkripsi

E2F

dari

mengaktifkan gen-gen yang diperlukan untuk replikasi DNA dan metabolise


nukleotida. P53 dimutasi dalam lebih dari 50 persen kanker manusia. Protein
berakumulasi sebagai respon terhadap stres selular dari kerusakan DNA, hipoksia,
dan aktivasi onkogen. p53 memulai sebuah program transkripsional yang memicu
penahanan siklkus sel atau apoptopsis. Ketika diaktivasi oleh p53, p21 (CipI)
mengindukasi apoptosis dalam sel-sel tumor dan sel-sel lain.

Siklus sel berfungsi sebagai regulator utama pembelahan sel. Replikasi DNA dan
sitokinresis bergantung pada fungsi normal siklus sel. Cyclin, CDK dan CKI
merupakan mediator karsinogenesis penting, inflamasi jaringan dan perbaikan luka.

Kode Genetik; DNA, RNA dan PROtein


DNA
DNA adalah blok pembentuk kehidupan manusia (gb 7-4). Struktur heliks
gandanya cukup sederhana, namun aturan-aturan yang dikodekan di dalam struktur
ini menentukan bentuk dan fungsi dari semua sel di dalam sebuah organisme. DNA
terdiri atas dua helai polideoksiribonukleotida yang memelintir satu sama lain
searah jarum jam membentuk helik sganda yang tak retak. Kelompok-kelompok
deoksiribose-fosfat yang bergantian mebentuk tulang punggung heliks, dengan
kelompok fosfat menyusun ikatan 5-3fosfodiester di antarakarbon kelima dari
satu cincin pentosa dan karbon ketiga dari cincin pentosa berikutnya (gb 7-5). Basa
asam nukleik yang menempel ke kelompok gula dari setiap helai saling berhadapan
di dalam helisk, perpendikular terhadap sumbu helai. Urutan asam nukleik
menetapkanr angkaian produk protein gen ini. Hanya ada empat basa: purin adenin
dan giuanin (A dan G) dan pyrimidine cytosine danthymine (C dan T). selama
perakitan doubel heliks, purin hanya bisa berpasangan dengan pirimidin dan
pirimidin dengan purin.s etiap pasang basa (bp) membentuk salah satu dari cincin
dalam tangga terpelintir dari molekul DNA, yang ditahan bersama-sama oleh ikatan
hidrogen di antara pasangan-pasangan basa komplementer, memiliki polaritaspolaritas kimia yang berlawanan. Satu helai diarahkan pada arah 5 hingga 3,

sementara yang lain diarahkan pada 3 ke 5. Enzim yang mengenali rangkaian


DNA spesifik juga mengakui polaritas helai. Enzim membaca rangkaian
nukleotida pada dua helai dalam arah yang berlawanan. Karenaa struktur tulang
punggung heliks bersifat invarian, enzim yang bertanggungjawab untuk
pengkopian, pembelahan dan perbaikan DNA , pecahan-pecahan helai bisa bekerja
di manapun di sepanjang helai helai DNA.
Dampak penting dari pemasangan A-T dan G-C adalah rangkaian nuklotida pada
stau helai doubel heliks menentukan rangkaian pada helai komplementer. Aturan
pemasangan basa ini penting bagi penyimpanan, pemerolehan dan transfer materi
genetik, apakah untuk duplikasi DNA ke dalam sebuah sel kembar, perbaikan helai
DNA yang rusak atau membaca sbagai template bagi transkripsi RNA>
Kromosom merupakan helai heliks ganda panjang dari DNA yang dipasangkan ke
dalam panjang padang, khusus oleh protein-protein inti. Setiap kromosom
panjangnya berbeda-beda dan komposisi pasangan basanya juga berbeda-beda.
Pada sel-sel manusia nukleus berisi 23 pasang kromosom yang berbeda, masingmasing dengan rangkaian pasang basa dan panjang spesifik. Rangkaian DNA
gabungan (sekitar 3 x 109) pada semua kromosom di dalam sebuah sel menyusung
enom. Ifnormasi yang dibawa di dalam genom identik pada semua sel organisme
dan sedikit berbeda di antara anggota spesies. Genom manusia, Homo Sapiens kirakira 99 persen identik di antara individu.
Selama pembelahan sel, enzim-enzim yang disebut polimerase mengurai heliks
DNA dalam setiap kromosom dan mengkopi masing-masing dari dua helai secara
terpisah diseluruh panjangya. Setiap sel kembar mewarisi molekul DNA berhelai
ganda yang berisi satu helai baru dan helai baru. Masing-masing helai bisa
10

menghasilkan helai baru yang mereproduksi template asli. Kecermatan replikasi


DNA ini penting bagi transfer akurat informasi genetik. Eror-eror pada proses ini
merupakan sumber umum mutasi gen yang diwarisi dalam putaran pembelahan sel
suksesif.
Sebuah gen merupakan bagian dari rangkaian basa yang digunakan sebagai
template untuk proses pengkopian transkripsi dan oleh karena itu merupakan fraksi
kecil dari semua DNA yang dibawa pada sebuah kromosom. Hanya 1 hingga 2
persen dari basanya mengkodekan protein, dan komplemen penuh rangkaian
protein-koding tetap perlu ditegakkan. Genom manusia berisi sekitar 30.000 gen
khusus. Informasi koding protein yang terkandung di dalam sebuah gen tunggal
bukan kontinyu tapi dikodekan dalam paket-paket diskontinyu ganda yang disebut
ekson. Antara ekson-ekson tersebut terhadap regangan-regangan DNA yang disebut
intron. Fungsi dari intron-intron tersebut tidak diketahui. Intron ini mungkin berisi
banyak informasi regulatoris yang mengontrol ekspresi sekitar 30.000 gen yang
mengkodekan protein, dan banyak lagi elemen-elemen fungsional seperti gen-gen
koding non protein dan detemrinan rangkaian dinamika kromosom. Bahkan lebih
sedikit yang dikethaui tentang fungsi sekitar setengah genom yang terdiri atas
rangkaian-rangkaian repetitif tinggi atau DNA non koding dan non repetitif sisanya.

RNA
Langkah pertama dalam eskspresi informasi genetik adalah transkripsi, yang
berfungsi membawa informasi genetik adalah transkripsi yang berfungsi membawa
informasi genetik dari nukleus ke sitoplasma dimana tejradi sintesis protein. Dalam
proses ini transkripsi DNA ke RNA memerlukan ekspresi template gen yang
11

disebut RNA messenger (mRNA) dalam nukleus (gb 7.6). enzim khusus, RNA
polimerase, mengkopi satu dari du ahelai DNA (helai antisense) menciptakan
regangan kompelmenter yang merupakan salinan tepat dari helai sense. Struktur
RNA sedikti berbeda dari DNA. Salah satu basa RNA, urasil, mengganti timin basa
DNA, dan ribosa komponen fosfat gula RNA menggantikan deoksiribosa DNA.
Ribosa membuat molekul RNA lebih rentan terhadap degradasi daripada
deoksiribosa yang lebih stabil. Ini memungkinkan RNA merespon lebih cepat ke
pergeseran-pergeseran dalam signaling selular dan bergerak cepat ke sitoplasma
untuk produksi protein.

Dari gen-gen ke protein


Proses yang mengonversi sebuah gen ke sebuah protein melibatkan dua langkah
utama; transkripsi DNA oleh RNA dalam nukleus dan translasi RNA ke dalam
protein dalam sitoplasma. Ini merupakan proses yang sangat kompleks dan
teregulasi. Transkripsi bermula dalam nukleus dengan mengkopi rangkaian DNA
gen ke dalam mRNA (lihat Gb 7-6). RNA helai tunggal dimodifikasi pada kedua
ujungnya. Pada ujung 5, struktur nukleotida yang disebut cap ditambahkan untuk
meningkatkan efisiensi translasi dengan memungkinkan ribosom mengikat ke
RNA. Pada ujung 3, nukleotida mengenali rangkaian kaya A/T pada daerah non
koding dan merampingkan downstream tarnskrip pada sekitar 20bp. Sebuah enzim
yang menambahkan regangan adenosit untuk membentuk ekor polyA, yang
menyetabilkan transkrip, memodifikasi ujung 3 yang baru membelah. Transkrip
kemudian menjalani pembelahan untuk menghilangkan rangkaian-rangkaian
intronik. Ini merupakan proses yang sangat teregulasi karena transkrip yang tidak
12

dipecah sangat tidak stabil dan dibersihkan dengan cepat dari sel. Splicing
merupakan titik kontrol penting dalam ekspresi gen. ini harus benar-benar presisi
karena delesi atau penambahan nukleotida tunggal pada jungsi splice akan
melempar frame dari translasi kodon tiga-basa RNA selanjutnya. Signifikansi RNA
splicing penuh tidak sepenuhnya diphamai tapi harus merepresetnasikantitik kritis
dalma regulasi ekspresi gen karena ekspansi besar rangkaian-rangkaian itnrondan
ketidakmampuan transkrip meninggalkan nukleus hingga intron-intronnya dilepas.
Sekali dalam sitoplasma, mRNA membrikan template untuk translasi atau sintesis
protein. Translasi terjadi pada kompleks makromolekular, seperti lini assembly,
terdiri atas ribosom. Ribosom membca dan mentranslasikan rangkaian nukleoitida
dalam mRNA ke dalam rangkaian asam amino; yaitu empat kode mRNA basa
ditranslasi ke dalam 20 alfabet asam amino protein. Kode genetik ini sangat
sederhana dan telah dikonversi di sebagian besar organisme. Setiap tiga nukleotida
RNA mengokdoekan satu asam amino; oleh karena itu kodon merupakan sebuah
triplet basa (gb 7.7). permutasi empat nuklotida RNA menghasilkan 64 triplet
berbeda (4x4x4) berbeda sehingga setiap 20 asam amino bisa ditetapkan oleh lebih
dari satu kodon. Salah satu triplet, AUG, menetapkan metionine yang merupakan
asma amino yang memulai setiap protein. Tiga triplet lain, UAA, UGA, dan UAG
memprogram ribosom pada translasi akhir dan oleh karena itu disebut stop codon.
Konversi sebuah kodon ke dalam sebuah asam amino memerlukan molekul adapter,
disebut transfer RNA (tRNA) untuk mendekodekan mRNA. Setiap tRNA
menggunakan rangkaian tiga-basa unik atau antikodon untuk menyesuaikan dengan
kodon komplementer dalam mRNA (lihat gb 7- 6). Enzim-enzim ribosomal
berhubungan menggabungkan asam amino, yang membebaskannya dari tRNA
13

adapter dan menambahkannya ke rantai asam amino yang tumbuh. Urutan asam
amino ditetapkan oleh urutan kodon pada template mRNA yang berhubungan.
Translasi kemudian menyelesaikan transfer informasi dari DNA dalam nukleus ke
struktur protein unik.
Karena kode genetik dipertahankan di antara spesies, rangkaian genetik manusia
bisa ditransfer ke dalam bakteri, ragi, atau sel-sel insektisida di mana rangkaian
akan direplikasi dan didekodekan ke dalam RNA dan protein. Prinsip ini
merupakan dasar teknologi DNA rekombinan yang digunakan untuk menghasilkan
protein-protein rekombinan untuk tujuant erapeutik dan riset (misalnya aktivator
plasminogen jaringan).
Proses ekspresi gen memerlukan regulasi presisi dan terkontrol pada beberapa
langkah. Hanya seidkit gen diekspresikan di dalam sebauh sel pada waktu tertentu.
Satu set gen diekspresikan secar akonstitutif pada sebagian besar sel yang disebut
sebagai gen-gen housekeeping. Gen-gen ini diperlukan untuk replikasi sel,
pembentukan energi dan fungsi-fungsi survival. Set gen kedua diekspresikan
dengan cara spesifik silsilah (yaitu di dalam sel-sel tertentu). Gen-gen ini
diperlukan untuk fungsi-fungsi spesifiks el seperti kontraktulitas. Regulasi presisi
gen-gen spesifik silsilah menentukan identitas dan fungsi unik dari sebuah sel
tertentu. Set gen lainnya diinduksi sebagai respon terhadap stimuli lingkungan setset kontrol ini diperlukan untuk menghasilkan pola ekspresi gen kompleks dan
dinamik yang memungkinkan organisme merespon sinyal-sinyal eksternal dan
internal.

Prinsip-prinsip dan teknik-teknik biologi molekular


14

Teknologi DNA rekombinan berkembang pada 1970an sebagai respon terhadap


kebutuhan akan kuantitas DNA yang mencukupi untuk analisis biokimia. Metode
ini mengacu pada clipping sebuah segmen di luar DNA sekeliling menggunakan
endonuklease spesifik rangkaian yang dikenal sebagai enzim restriksi. Segmen bisa
dimasukkan sekehendaknya ke dalam vektor yang memungkinkan mengkopi dalam
jutaan kali (lihat kemudian). Sukses teknik-teknik DNA rekombinan mendorong
sebagian besar kemajuan dalam biologi molekular selama lebih dari 30 tahun.
Banyakdari teknik tersebut sekarang umum dalam lab riset. Pendekatan-pendekatan
ini digunakan secara rutin untuk analisis ekspresi gen; dan penemuan gen-gen dan
terapeutik baru. Kemajuan ini mengubah wajah riset medis. Teknik genetika
dimana sebuah organisme dimodifikasi meliputi gen-gen baru yang dirancang
dengan karakteristik yang diinginkan menjadi praktek rutin dalam banyak lab riset.
Teknologi DNA rekombinan berfungsi untuk memproduksi masa protein terapeutik
seperti aktivator plasminogen jaringan rekombinan. Kemampuan manipulasi genom
manusia membuka kemungkinan baru untuk pengembangan uji diagnostik dan
terapi-terapi baru. Teknik-teknik biologi molekular, seperti struktur DNA itu sendiri
sangat sederhana. Pendekatan-pendekatan dasar dijelaskan di sini; pembaca
dipandu utnuk meninjau secara mendalam untuk primer tentang bagaimana
menjalankan teknik-teknik tersebut.

Kloning DNA

Kloning molekular memberi cara untuk menghaslkan jutaan kopi rangkaian atau
gen DNA di dalam sel-sel bakterial. Fragmen DNA pertama kali dimasukkan ke
dalam vektor kloning. Vektor yang paling sering dipakai adalah molekul DNA kecil

15

dan sirkular yang disebut plasmid atau virus-virus bakteri yang disebut phage.
Vektor-vektor tersebut mengandung informasi genetik yang memungkinkan sel
bakterial untuk mereplikasi rangkiaan DNA. Setelah insersi rangkaian DNA vektor
plasmid atauphage dimasukkan ke dalam sel bakterial. Tumbuhnya kultur bakterial
mereplikasi vektor yang mengandung rangkaian DNA dalam ribuan kopi pe sel,
menghasilkan banyak klone identik dari rangkaian DNA awal. Vektor-vektor
kemudian dpanen untuk kultur bakterial dengan menggunakan enzim pembatasan
yang sama yang digunakan untuk memasukkan rangkaian DNA ke dalam vektor.
Ahli biologi molekular menggunakan endonuklease pembatasan yang diperoleh
dari bakteri sebagia gunting molekular yang memotong motif-motif DNA pada
rangkaian-rangkaian yang bisa diprediksikan. Setiap enzim pembatasan mengenali
rangkaian nukleotida spesifik. Tempat-tempat pengenalan tersebut terdapat secara
random di sepanjang DNA dari organisme dan terdiri atas motif rangkaian simetrik
pendek yang disebut palindrome yang diulangi dalam orientasi berlawanan pada
helai-helai DNA heliks ganda. Misalnya, enzim EcoRI dari bakteri Escherichia coli
mengenali dan memotong rangkaian GAATTC palindromic rangkaian asimetrik,
meninggalkan overhang helai ganda pada setiapujung potongan. Ujung-ujung
sticky tersbeut memiliki rangkaian unik dan kmplementer yang bisa digunakan
untuk menghubungkan fragmen DNA manusia dengan ujung-ujung DNA
komplementer dari sumber lain. Reaksi enzimatik berhubungan dengan DNA helai
ganda kontinyu yang membentuk splice halus. Prinsip-prinsip tersebut digunakan
untuk menyusun penyusunan kembakli DNA untuk tujuanganda seperti kloning
gen, menghasilkan tikus knockout, atau menyusun terapi-terapi DNA rekombinan.

16

Teknik-teknik Blotting
Blotting merupakan alat yang memugkinkan identifikasi DNA, RNA atau protein
oleh ukuran molekularnya. Analisis DNA disebut sebagai Southern blot; identifikasi
RNA adalah Northern blot; dan isolasi protein adalah western blot. Prinsip-prinsip
teknik blotting cukup jelas. Campuran molekul yang dianalisa ditujukan pada
elektroforesis gel, agarose gel digunakan di mana molekul-molekul dimasukkan ke
dalam well pada satu ujung. Gel dicelupkan ke dalam buffer dan ditujukan pada
arus listrik. Molekul-molekul tersebut bermograsi di antara medan listrik. Karena
DNA dan RNA asam yang memabwa muatan negatif, mereka bermigrasi ke arah
kutup positif gel. Matriks agarose menghambat migrasi molekul-molekul yang
lebih besar sheingga molekul-molekul juga berpisah menurut ukruannya. Ketika
elektroforesis rampung, gel diangkat dari bufer dan filter nilon dan bahan absorben
kering ditaruh di bagian atas. Buffer dari gel diblotting ke dalam bahan absorben
dengan membawa molekul-molekul terpisah yang tetap pada filter nilon. Filter ini
ditangani untuk menaruh molekul-molekul pada permukaannya, mencitpakan
bayangan cermin dari gel asli. Filter ini kemduian dibilas dengan molekul tagged
(uji) yang mengenali (berhibridasi ke) molekul yang dimaksud dan dibilas untuk
menghilangkan uji yang tidak dibatasi. Untuk southern (DNA) dan northern (RNA)
blot, uji merupakan fragmen kecila sam nukleik yang membawa rangkaian
komplementari pada molekul yang diinvestigasi. Asam nukleik ditag dengan
elemen radioaktif yang bisa dideteksi oleh pemaparan ke film sinar x atau teknikteknik lain.
Posisi uji hibridasi yang nampak sebagai sebuah pita, memberi estimasi ukuran
segmen DNA atau RNA. Dengan menjalankan lane-lane paralel dari amrker
17

moleklar dengan ukuran yang diketahui, ukuran preissi elemen DNA atau RNA
ditentukan. Untuk indentifikasi protein (Western blot), uji ini terdiri atas antibodi
tagged yang mengenaliprotein target. Marker-marker ukuran juga dijalankan dalam
gel untuk mengidentifikasi ukuranprotein.
Teknik-teknik blotting juga digunakan untuk tujuan-tujuan lain meliputi pemetaan
posisi tempat-tempat pemabtasan dalam gen khusus setelah pencernaan enzim
pembatasan dan dalam analisis sitogenik untuk membandingkan tempat-temppat
pembatasan pada DNA genomik dari sampel ujidan referensi.

Polymerase Chain Reaction (PCR)


PCR adalah prosedur amplifikasi yang berlangsung dalam tabung uji (gb 7-9).
Segmen DNA atau RNA yang diamplifikasi digabungkan dalam sebuah tabung uji
dengan dua primer oligonukleotida pendek (fragmen-fragmen DNA berhelai
tunggal yang disintesa secara kimia). Primer-primer ini memulai amplifikasi, yang
kemudian berlangsung dalam seri siklus dimana DNA awal, yang disebut template,
dipisahkan menjadi helai-helai tunggal. Pemisahan helai-helai memungkinkan
primer mengikat atua menempel ke rangkaian-rangkaian kompelmenter masingmasing disetiap ujung helai tunggal. Enzim polimerase DNA stabil panas
menambah basa nukleotida pada ujung setiap primer, membaca di antara helai DNA
tunggal, menghasilkan kopi komplementer dari helai tunggal. Pada saat polimerase
mencapai ujung helai tunggal, rangkaian berhelai ganda baru telah dihasilkan.
Siklus ini mulai lagi, memanskand an memisahkan helai ganda, dikuti oleh
pembentukan helai baru oleh primer dan polimerase. Setiap putaran amplifikasi
PCR menggandakan jumlah template DNA. Menciptakan jutaan kopi sebuahs
18

egmen DNA dimungkinkan dalam beberapa jam oleh PCR, bahkan ketika materi
pemulanya merupakan kopi DNA tunggal. Seluruh amplifikasi dilakukand alam
tabung uji bersegel atau dalam sebuah mesin yang dirancang khusus yang bisa
diprogram utn memanaskan dan mendinginkan sampel secara otoamtis. PCR
sekarng menjadi alat umum untuk menghasilkan jumlah materi genetik identik yang
cukup untuk analisis.

Prinsip-prinsip Genetik Molekular


Genotip dan Identifikasi Gen-gen penyebab penyakit
Penemuan struktur dan fungsi DNA pada 1953 memberi dasar bagi genetika
molekular. Penyelesaian perangkaian genom manusia menambah banyak pada
dasar ini. Para dokter sekarang memiliki perangkat genetika molekular di mana
mereka bisa melakukan diagnosis dan treatment. Dalamhal ini tiga konsep terbukti
berguna dalam enetika kardiovaskular: genotip, genomik dan proteomik. Genotip
merupakan campuran rangkaian DNA dalam set gen individu atau rangkaian
komplit DNA individu pada 23 pasang kromosom. Genomik ini merupakan
ekspresi rangkaian-rangkaian gen sebagai RNA. Fokus genomik adalah gen mana
yang diekspresikan? Proteomik adalh studi protein yang diekspresikan di dalam
sebuahsel atau organisme yang mencoba memahami jaringan interaksi proteinprotein.
Secara historis, bidang genetik berfokus pada gangguan-gangguanmonogenik yaitu
penyakit yang disebabkan oleh delesi gen tunggal atau mutasi. Dengan perangkat
genomik dan proteomik yang lebih baru, perhatian ditujukan pada evaluasi
19

kerentanan genetik terhadap ciri-ciri penyakit kompleks seperti penyakit arteri


koroner dan diabetes. Memahamidasar genetik dari penyakit kompleks memerlukan
pengetahuan tentang rangkaian-rangkaian gen, protein-protein yang dikodekan oleh
gen dan fungsi protein. Meski demikian semakin jelas bahwa problem
kardiovaskular kompleks tidak bisa dipeahkan hanya dengan mendapakan
rangkaian nukleotida genom manusia atau dari mengungkap 30.000 loci yang
mengkodekan protein-protein masing-masing atau meregulasi gen-gen lain.
Diperlukan karya yang besar untuk menentukan dengan tepat mekanisme molekular
di mana perubahan-perubahan pada gen individu atau set gen menetapkan atau
menyampaikan resiko untuk penyakit spesifik.

Gangguan-gangguan monogenik
Genetika medis berfokus pada penyakit monogenik atau gen tunggal, di mana
penyebab penyakit dilacak pada gen yang hilang atau bermutasi. Sekitar 1000 gen
penyebab penyakit telah diidentiifkasi. Gangguan-gangguan monogenik langka dan
biasanya diwariskan dengan cara mendelian atau autosomal. Yang menarik,
pemahaman kami tentang mekanisme di managemen tunggal menyebabkan
penyakit, meski mekanisme tersebut tidak lazim telah mendorong pada pemahaman
patogenesis penyakit kardiovaskular yang lebih umum.
Pemahaman terbaru faktor-faktor genetik dalam penyakit kardiovaskular diulas
secara lebih detail di tempat lain. Secara singkat, setiap gen ada dalam dua kopi,
dikenal sebagai alele. Individu homozigous pada suatu lokus jika dua alele identik,
atau heterozigous jika alelenya berbeda. Alele khusus yang muncul pada loci
tertentu merepresetnasikan genotip untuk gen-gen tersebut. dipandang lebih luas,
20

genotip merupakan campuran dari faktor-faktor genetik yang bertanggungjawba


menciptakan sebuah fenotip. Sebuah fenotip merupakan sifat yang nampak atau
bisa diukur yang berasal dari sebauh genotip seperti penyakit arteri kroner atau
obesitas. Fenotip bisa juga diartikan sebagai efek aksi gen, apakah karena gen
tunggal atau seluruh genotip.
Perbedaan-perbedaan pada rangkaian nukleotida, baik di antara dua individu atau di
antara semau individu dalam sebuah populasi merupakan variasi genetik.
Perbedaan-perbedaan yang muncul dalam rangkaian nukleotida dan menyebabkan
perubahan struktural pada protein yang dikodekan disebut mutasi. Mutasi diartikan
terjadi pada kurang dari 1 persen populasi tertentu. Sekitar 16.000 mutasi dalam
gangguan gen tunggal telah diidentifikasi. Contoh-contoh mutasi meliputi
msissense, non sense, pergeseran frame, delsi dan insersi (gb 7-10). Mutasi-mutasi
misssense berasal dari substitusi satu atau beberap anukleotide dengan cara yang
mengubah rangkaian primer protein yang dikodekan. Mutasi-mutasi missense
tersebut mengubah fungsi protein dengan mengubah struktur primernya. Mutasi
nonsense memperkenalkan kodon hentian prematur ke dalam gen menyebabkan
produk gen truncated yang bisa menunjukkan perubahan-perubahan dalam fungsi
dan bisa tidak stabil. Insersi atau delesi nukleotida menambah atau mensubstrak
asam amino dari protein-protein yangdihasilkan jika peurbahan-perubahan
nukleotida menyebabkan penambahan atau delesi triplet. Mutasi-mutasi frame-shift
terjadi ketika kodon sebuah gen dibaca dalam rangka pembacaan yang keliru.
Mutasi-mutasi ini basanya menyebabkan struktur proteina bnormal karena
pengenalan kodon termiansi out-of frame yang menyebabakn penghentian protein
prematur. Mutasi dalam introndan ekson menyebabkan splicing eror yang juga bisa
21

menyebabkan perubahan struktur protein atau penghentian prematur. Yang terakhir


mutasi dalam promoter atua enhancer gen bisa menyebabkan perubahan pada level
ekspresi sebuah protein, atau pola temporal atau spasial ekspresi gen sebuah
protein.
Beragam mutasi telah ditemukan dalam penyakit kardivoaskular monogenik.
Misalnya meski cacat primer dalam hiperkolesteromia familial merupakand eifist
LDLR, lebih dari 600 mutasi dalam gen LDLR telah diidentifikasi pada pasien
dengan gangguan ini. Demikian juga kardiomiopati hipertropik (sebuah penyakit
odminan autosomal) disebabkan oleh mutasi dalam en-gen yang mengkodekan
protein aparatus kontraktil-myocardial. Mtuasi-mutasi kausatif ganda pada
setidaknya 10 protein sarkomerik berbeda telah teridentifikasi antara lain rantai
beart beta-myosin kardiak, protein pengikatan miosin kardiak, cardiac troponin T,
cardiac triponin I, alfa-tropomyosin, rangai ringan regualtoris dan esnesia dan aktin
kardiak. Gangguan akrdiovaskular monogenik lainnyameliputi sindrom Q-T
panjang familial, venous trombosis karena faktor V leiden dan bentuk-bentuk
hipertensi turunan.
Analisis ciri kompleks
Polimorfisme merupakan variasi-variasi umum yang diartikan muncul dalam lebih
dari 1 persen populasi. SNP merupakan substitusi nukleotida yang tidak mengubah
struktur protein (gb 7-11). SNP merupakan penanda yang bergunauntuk memetakan
gen-gen ke dalam loci kromosomal. SNP bisa berupa marker kerentanan penyakit
(yaitu ini bisa berhubungan dengan penyakit karena efek langsungSNP terhadap
penyakit atau hubungandengan lokus kerentanan di sekitarnya). seklitar 1.4 juta
SNP

ada dalam genom manusia. SNP putatif dan konfirmatoris bisa diakses
22

melalui beberapa database publik seperti dbSNP, database yang disimpan oleh
National Center for Biotechnology Information.
Sebuah haplotipe adalah serangkaian SNP yang dikelompokkan dalma daerah
genetik kontiguous dan diwariskan en bloc di dalam sebuah populasi. Haplotipe
bisa memiliki hubungan yang jelas dengan penyakit atau hanya muncul dikaitkan
dengan faktor-faktor pengacau. Jika SNP dikaitkand engan sebuah penyakit
kemungkiann SNP diwariskan sebagai bagian dari ahplotipe di mana SNP lain juga
dikaitkan secara statistik dengan penyakit ini. Asosaisi non random alele ini disebut
linkage disequilibrium. Linkage disequilibrium ada ketika alele di dua loaksi
berbeda dalam genom diwariskan bersama secara lebih sering daripada yang
diperkirakan. Karena SNP bisa menjadi marker bukannya penyebab rpedisposisi
penyakit, bukti kausalitasmemerlukan penunjukan fugsi gen yang berubah.
Upaya internasional mengidnetifikasi semua SNP pada 22 kromosom somatik pada
300 individud ari latar belakang beragam di Asia, Afrika, Eroap dan Amerika.
Proyek ini disebut Haplotype Map atau HapMap yang dimulai pada 2002 untuk
menyusun peta kluster SNP genom luas berdasarkan sampel-sampel DNA dari
poulasi manusia yang berbeda dan HapMap komplit diterbitkan pada 2005.
HapMap memberi peta jalan SNP untuk melakukan analisis silsilah, studi-studi
asosiasi dan evaluasi partner SNP untuk kontribusi pada sebuah penyakit. SNP
memberi wawasan tentang dasar genetika untuk penyakit karena beberapa alasan:
agena-gen penyebab langsung dari fungsi gen yang berubah; marker penyakit,
tanpa memperhatikan kausalitas; marker genom luas untuk studi-studi genetik
karena kehadirannya pada kerapatan tinggi di seluruh genom.

23

Analisis Silsilah dan studi-studi Asosiasi


Dua tipe studi genetik menguji pewarisan: analisis silsilah dan studi-studi asosiasi.
Studi-studi silsilah dilakukan dalam keluarga-keluarga untuk mempelajari
pewarisan bersama dua ciri yang diturunkand ari orang tua ke anak. Analisis SNP
digunakan karena marker ini bisa menunjukkan ko-pewarisan dari dua sifat atau
alele yang berada berdekatan satu sama lain pada lokus kromosomal. Gen-gen yang
mengkodekan dua sifat berada berdekatan satu sama lain dan alele dihubungkan.
Silsilahditentukan oleh skor LOD, atau logaritma odds bahwa marker dihubungkan
pada jarak tertentu, dibagi oleh odd yang dihubungkan pada 50 persen kopewarisan (tidak dihubungkansama sekali). Analisis silsilah umumnya digunakan
untuk mengidentifikasi dan mempelajari sifat-sifat Mendleian. Metode pembagian
Allele juga digunakan untuk membandingkan kemiripan alele-alele dalam ndividu
yang terpengaruhseperti pasangan saudara kandung yang terkena.
Studi-studi asosiasi berbasis populasi berguna untuk investigasi ganguan-gangguan
umum tanpa pewarisan Mendelian yang jelas. Studi-studi asosiasi sering
menggunakan pendekatan kontrol kasus di mana grup eksperimental dan refernesi
dibandingkan. Pertimbangan cermat terhadap populasi kotnrol yang paling tepat
diperlukan untuk mengambil kesimpulan valid dan menduga fungsi gen dari studistudi tersebut. Studi-studi kontrol kasus harus diperkuat dengan ukuran sampel
yang cukup besar untuk mencapai signifikansi statistik. Dalam pendekatanini, SNP
yang dikenal dalam gen-gen calon disleidiki mewnggunakana lele-alele sebuah
SNP sebagai variabel yang kemudian dikaitkand engan kehadiran atau ketiadaan
penyakit atau hasil tertentu. Jika SNP dalam gen target tidak diketahui, maka gen
ini secara langsung dirangkaikan dalam subset studi dan dalam populasi kontrol
24

untuk menentukan SNP mana yang direpresentasikans ecara difernesial dalam dua
populasi. Konfirmasi SNP kemudiand ialkuaknda lam isa populasi menggunakan
teknik-teknik berbasis PCR. Validasi memerluakn pengujian asosaisi dalam kohort
indepdenden. Keterbatasan pendekatan asosiasi merupakan bias yang inheren
dalam seleksi gen-gen calon. Hanya gen-gen yang dikenal atau yang menarik yang
sering dipilih untuk investigasi. Sebaliknya, identifikasigen-gen dengan cloning
posisional sering mendorong pada penemuan tak terduga.

Scan luas Genom


Genome wide scan SNP merupakan teknik yang lebih baru yang dilakukan pada

platform high-troughput dan uji untuk beberapa ratus ribu SNP secara bersamaan.
Dengan mengambil keuntungan dari distribusi fisik SNP melalui genom, daerah
kromosmal dia ntara SNP bisa dihubungkan dengan penyakit menggunakan
metode-metode statisitk. Ini merupakan teknik yang kuat untuk membantu
penemuan SNP baru didalam atau di dekat gen-gen yang menyebabkan atau
dikaitkan dengan penyakit ini, seringkali penyakit-penyakit kardiovaskular
kompleks. Genom-wide scan juga merupakan perapatan berguna untuk riset yang
didorong oleh hipotesis. Pendekatan ini kemungkinan akan menerima perhatian
yang cukup besar dalam 5 hingga 10 tahun berikutnya ketika para peneliti
mempelajari kerentanan genetik terhadap penyakit kardiovaskuar kompleks,
modifier genetik penyakit dan interaksi-interaksi gen-lingkungan.

Genomik

25

Genomik adalah studi fungsi gen melalui pengukuran-pengukuran paralel genom,


sebagian besar menggunakan teknik-teknik microarray an analisi serial ekspresi gen
(SAGE). Pemakaian microarray dalam penemuan obat meluas, dan apliaksinya
meliputi rsiet dasar dan penemuan target, determinasi biomarker, farmakologi,
toksikgenomik, selektivitas target, perkembangan uji prognostik, dan determiansi
penyakit-subklas.
Teknik-teknik dasar melibatkan ekstraksi RNA dari sampel-sampel biologis dalam
kondisi uji atau normal (gb 7-12). RNA dikopi, semetnara mamsukkan flurescent
nukleotida atau tag yang kemudian di stain dengan fluerescence. RNA berlabel
kemduian dihibridsasi ke microarray, kelebihannya dibilas, dan microarray discan
di bawah sinar laser. Hasil akhir adalah 4000 hingga 5000 pengukuran ekspresi gen
per sampel biologis. Krena eksperimen komplit bisa melibatkan jumlah hinga
ratusan microarray, set data ekspresi RNA resultan bisa sangat beragam ukurannya.

cDNA Microarrays
cDNA (complementary DNA) microarrays dibentuk dari pustaka cDNA uji (500
hingga 5000 basa) dengan menentukan titik cDNA yang berhubungan dengan gen
individu atau uji di loaksi presisi pada slide mikroskop. Setiap microarray
mengukur dua sampel dan memberikan level pengukruan erealtif untuk setiap
molekul RNA. RNA target yang diberi label flurescencet dye dihibrdisasi ke
permukaan microarray cDNA, bersama dengan sampel kontrol. Dua sampel RNA
dirampungkan untuk mengikat setiap uji. RNA yang cocok dengan rangkaian
cDNA berhibidira ke titik cDNA pada slide mirkoskop. Label-label flurescenet
diaktivasi laser dan sinyal menguat dari uji fluerencence yang mengikat titik-titik
26

cDNA dibandingkan. Perbandingan ini merefleksikan rasio keberlimpahan RNA


untuk setiap gen yang diekspresikan. Strategi-strategi normalisasi yang
memungkinkan standardisasi perbandingan inter-array diterapkan, diikuti oleh
metode analisis, sebagaimana dijelaskan sebelumnya.

Oligonucleotide Arrays
Oligonucleotide arrays diciptakan oleh penempelan uji nukleotida sintetis (12-80mer oligonukleotida) yang mereprestnasikan bagian gen unik ke permukaan
susunan, cDNA disintesa dari sampel mRNA eksperimental, diikuti oleh langkah
transkripsi in vitro untuk menciptakan cRNA biotin-labeled, yang berhibrida ke
target microarray. Micrroarray ditangai dengan flurescencet dye yang ditag ke
avidin (protein yang mengikat secara kuat ke biotin) dan ditujukan ke aktivasi laser.
Dengan susunan oligonukleotida, setiap microarray mengukur sampel tunggal dan
memberi level pengukuran absolut dari setiap molekul RNA. Intensitas sinyal
diukur sebagi refleksi level ekspresi untuk setiap gen.

SAGE
SAGE adalah teknik untuk karakterisasi ekspresi gen berdasarkan pada perangkaian
langsung transkrip. Kekuatan utamanya adalah penentuan dan analisis transkrip
ketika rangkaian tidak diketahui. SAGE memerlukan sekitar 10 kali lebih besar
kuantitas mRNA untuk analisis dan lebih melelahkan daripada beberapa platform
susunan bahkan dengan sequencer otoamtis, karena

perbandingan dua sampel

paling sederhana memerlukan perangkaian sekitar 1.5 x 10 basa. Faktor ini saja
mengalami kesulitan ketika keberlimpahan RNA rendah, sementara keuntungan
27

utamanya adalah senitivtayang lebih tinggi untuk perubahan-perubahan pada level


ekspresi.
Setelah akuisisi data dengan pemrosesan gambar, data dianalisa dalam tiga langkah:
normalisasi, filtering dan komputasi. Normalisasi mencakup faktor-faktor teknik
seperti aray manufacturing, perbedaan-perbedaan pada penggunan dye, dan
ketidakteraturan dalam distribusi uji selama hibiridasasi dan dilakukan utn
memungkinkan perbandingan bermakna di antara susunan-susunan individu.
Penyaringan data mengacu padaseleksi data yang kemungkinan mepreresentasikan
temuan-temuan signifikan. Kriteria khusus untuk penyaringan meliputi pengukuran
kualitas sinyal dan perubahan lipatan pada level ekspresi gen. ekspresi gen
diferensial dalam analisis microarray seringkali diartikan sebagia perbedaan 1.5
hingga 2 kali lipat dalam level ekspresi gen relatif.
Penentuan kemiripan dan ketidakmiripan merupakan komponen penting dari
analisis data. Dua pendekatan umum digunakan: diawasi dan tidak diawasi.
Metode-metode yang diawasi digunakan untuk menemukan gen-gen dengan level
ekspresi yang secara signifikan berbeda di antara grup-grup sampel dan
menemukangen-gen yang dengan akurat memprediksikan karakteristik sampel. Dua
teknik diawasi yang seringdigunakan antara lain tetangga terdekat dan mesin
vektor pendukung. Pengguna metode yang tak terawasai mencoba menemukan
struktur internal atau hubungan dalam set data bukannya mencoba menentukan cara
terbaik memprediksikan jawaban yang benar. Emapt teknik tak terawasi yang
sering dipakai antara lain pengelompokan hirakis, peta pengaturan-diri, jaringan
relevansi dan analisis komponen-prinsip. Metod-emetode analitis tersebut
dijelaskan secara detail di bagian lain. Pendekatan-pendekatan komputasional
28

tersebut kemudian diikuti oleh analisis statistik. Sebelum data microarray diambil
pada nilai permukaan, temuan-temuan signifikan harus divalidasi dengan uji
independen level ekspresi RNA menggunakan PCR transkripsi terbalik kuantitatif
atau teknik-teknik blotting Northern konvensional .

Proteomics
Proteomic adalah studi protein yang diekspresikan oleh genom. Genomik dan
proteomik harus dipandang sebagai komponen komplementer dari spektrum
genetik, dimulai dengan DNA dan berakhir dengan protein-protein yang
dimodifikasi (gb 7-13). Protein adalah produk akhir dari genom manusia dan pada
akhirnya menentukan biologi manusia. Protein bertanggungjawab untuk bentuk dan
fungsi bioplogis. Para ilmuwan memperkirakan ada enam hingga tujuh kali protein
banyaknya gen (200.000) pada manusia karena splicing, pertukaran kaset-kaset
struktural di antara gen selama transkripsi dan modifikasi posttranslasional. Bidang
protemik mencoba memahami interaksi-interaksi kompleks dari semua protein yang
diekpsresikan dalam jaringan atau organisme di bawha kondisi normal atau
perturbansi. Sebenarnya proteomik manusia masih dalam tahap dini.
Metode-metode untuk analisis proteome masih dikembangkan dan divalidasi.
Meski demikian ada lima elemen dasr bagi analisis protemik: pemerolehan sampel,
ekstraksi

protein,

pemisahan

protein,

penentuan

rangkaian

protein

dan

perbandingan rangkaian dengan database referensi untuk identifikasi protein.


Pemerolahn sampel cukup jelas, melibatkan pemerolehan sebuah biopsi jaringan
atau sampel plasma dari seseorang (dibawah izin tertulis). Ekstraksi protein
umumnya dilakukan dengan metode-metode kimia, umumnya dengan metanol
29

untuk mengeluarkan semua DNA, RNA, karbohidrat dan lipid. Protein-protein yang
diekstraksi harus dipisahkan untuk identifikasi dan langkah ini secara tradisional
dilakukan elektroferesis gel dua dimensional. Dalam dimensi pertama proteinprotein dipisahkan oleh massa dan dalam dimensi keduamereka dipisahkan oleh
poin isoelektrik atau muatan jaring. Karena sebagian besar titik pada gel duadimensional mengandung beberapa konstituen protein, metode-metode alternatif
untuk memisahkandan mengidentifikasi protein, termasuk kromatografi cair, telah
berkembang. Kromatografi cair mengunakan media berfase padat dan berfase cair
untuk memisahkan protein menurut sifat-sifat biokimia yang meliputi massa
molekular, titik isoelektrik atau hidrofobisitas. Pemsiahan-pemisahan kromatografi
cair ini bisa dilakukandalam serial untuk memperbaiki resoluisi. Tipe-tipe kolom
kromatografi lain bisa digunakan untuk meningkatkan sensitivitas dan kekhususan
seperti kromatografi afinitas di mana sebuah kolom berisi antibodi-antibodi yang
spesifik untuk fungsi-fungsi tertentu untuk mencapai hasil yang diinginkan.s telah
pmeisahan protein diidentifiaski umumnya menggunakan suatu bentuk spektrometri
massa (gb 7-14). Spektrometri massa mengonversi protein atau peptida ke spesiesspesies bermuatan yang bisa dipisahkan berdasarkan rasio massa terhadap muatan.
Beberapa tipe metode ionisasi spektrometri massa digunakan antara lain ionisasi
elektrospary dan MALDI. Rangkaian-rangkaian peptida yang diidentifkasi engan
metode-metode ini selanjutnya harus dianalisa dengan dibandignkan dengan
rangkaian database yang dikenal untuk menentukan identitas protein unequivokal.
Sekali protein dalam proteme tertentu diidentifikasi, level keberlimpahan relatif
ditentukan untuk membandingkan keberlimpahan relatif protein dalma kondisi
normal atau sakit. Yang terakhir, analisis menyeluruh terhadap sebuah proteome
30

harus meliputi suatu ukuran fungsi apakah ini berada dalam sel-sel yang
dikulturkan atau dalam model-model binatang. Pendekatan ini mirip dengan
analisis genomik fungsinal di mana penting untuk mengukur pentingnya gen atau
mutasi melalui penentuan fungsi gen.
Analisis proteomik saat ini dibatasi oleh sensitivitas, kekhususan, dan throughput.
Meski demikian bidang ini dan metodologinya berkembang dengan cepat. Aplikasi
protemik terhadap penyakit kardiovaskular cukup menjanjikan untuk memahami
fungsi sistem kardiovaskular dalam semua kompleksitasnya.

Modifikasi Genetik Tikus untuk mempelajari penyakit kardiovaskular


manusia
Teknik-teknik untuk menghasilkan tikus yang dimodifikasisecara genetik memiliki
dampak yang besar terhadap riset kardiovaskular. Tikusadalah binatang kecil
dengan periode kehamilan pendek (21 hari). Ada konservasi yang besar dari jalur
khusus molekular yang mengontrol perkembangan dan fungsi kardiovaskular di
antara tikus dan manusia. Gen-gen yang sama dan jalru khusus signaling
meregulasi perkembangan jantung dan vaskulatur pada kedua spesies. Dengan
selesainya perangkaian genom manusia dan tikus, genetika komparatif sekarang
dimungkinkan. Karena alasan-alasan tersebut, tikus yang dimodifikasi secara
genetik

menjadi

model

binatang

penting

untuk

mempelajari

genetika

kardiovaskular, biologi perkembangan dan fisiologi. Keterbatasan-keterbatasan


model-model tikus untuk mempelajari penyakit kardiovaskular manusia juga
dibuktikan, tapi karena kesederhanaan manipasi genetik pada tikus, ini menjadi

31

temapt awal standar untuk uji hipotesis sebelum evaluasi pada binatang yang lebih
besar. bagian ini secara signkat menjelaskan prinsip-prinsip dari empat pendekatan
ke modifikasi dalam tikus: transgenik, delesi gen atau knockout, conditional
knockout dan mempelajari fisiologi tikus.

Tikus Transgenik
Penciptaan tikus transgenik melibatkan empat langkah: kloning gen yang
dimaksud; fusi gen ke rangkaian regulatoris transkripsional yang memprogram
ekspresinya dalam semua jaringan tikus atau dalam jaringan-jaringan khusu: injeksi
transgen yang dimurnikan ke dalam pronukleus jantan dari embrio tikus satu sel y
agn dibuahi; dan reimplantasi embrio yang disuntikkan ke ibu foster. Transgen yang
disuntikkan secara random berintegrasi ke dalam sebuah kromosom embrio yang
dibuahi menghasilkan seekor tikus founder yang mengekspresikan transgen yang
disuntikkan dan yang melewatkan transgen ke 50 persne dari progeninya. Studistudi komapratif bisa dilakukandi antara tikus littermate non transgenik dan tikus
transgenik sebagia kontrol produksi tikus transgenik founder sekarangs ecara rutin
dilakuakn dalam banyak lab dan dicapai scara umum dalam waktu kruang dari satu
bulan. Teknik-teknik yang sama telah digunakan utn menciptakan kelinci, tikus dan
babi transgenik.
Penyaringan teknik-teknik ini telah membantu model-model transgenik yang lebih
canggih. Promoter spesifik sel memprogram ekspresi transgen secara khussu dalam
akrdiomiosit, sel-sel endotel, dan sel-sel otot halus vaskular, menciptakan tikus
transgenik engan ekspresi terbatas pada sistem akrdiovaskular. Meski overekspresi
sebuah transgen menghasilkan pertambahan fungsi, ini juga dimungkinkan
32

menghilangkanf ugnsi gen tungal dengan mengovberekspresi mutan negaitf


dominand ari gen tersebut, protein yang dikodekan

yang mengganggu fungsi

protein tipe liar. Ekspresi transgene bisa juga dimatikan atau dihidupan dengan
menggunakan obat sederhana seperti tetracycline mengugnakan sistem tet operon
tikus ini memungkinakn eksrpesi transgene tepat waktu dan juga perbandingan
dengan bintang yang sama dari fenotip transgetn pad kondisi on dan off.

Inaktivasi gen atau pendekatan-pendekatan knockout


Delesi gen merupakan pendkeatn tambahan bagi transgenesis untuk mempelajari
peran gen khusus dalam perkemabgnandan fisiologi tikus (gb 7-15). Dalam studistudi delesi gen, ekspresi satu atau beberapa gen di knockout untuk menghasilkan
tikus mutan yang kehialngan fungsi. Pendekatan knockout melibatakn langkahlangkah beriktu: penyusunan vektor penarget yang berisi gen yang dimaksud
dengan delesi atau mutasi nonsnse; transfeksi sel batang embrionik tikus pluripotein
dengan vektor penarget; rekombinasi homolog di antar konstruk penarget dan satu
kopi gen endogen, menghasilkan sebuah sel batang embrionik dengan delesi
homozigous gen yang dimaksud; injeksi sel batang embrionik mutan ke blastokista
tikus yang dibuahi; dan implantasi blastokista ke dalam ibu foster. Anak tikus yang
dihasilkan adalah chimera di mana semua jaringan yang meliputi gonad diperoleh
sbeaigiand ari sel-sel batang embrionik mutan dan sebagian dari sel-sel tipe liar dari
blastokista yang disuntikkan. Binatang chimerik ini diternak ke sebuah biantang
tipe liar dan fertiliasasi telur tipe liar dengan sperma mutan dari chmera
menghasilkan tikus knockout heterozygous di mana satu kopi gen yang dimaksud
di semau sel merupakan mtuandan kopi lain merupakan tipe liar. Biantang
33

heterozigous kemudian diternak satu sama lain utn menghasilkan fenotip khsuus
yang menunjukkan fungsi langsung gen dalam perkembangan dan fisilogi nromal
dan yang terganggu. Penciptaan tikus knockout secara teknis lebih menantang
daripada transggenesis dan sering butuh 9 hingga 12 bulan untuk rampung.

Tikus knockout kondisional


Inaktivasi gen-gen penting umumnya menghasilkan fenotip mematikan embrionik
dini yang sulit dianalisa dan dimengerti. Akibatnya metode-metode telah
dikemabngkan untuk menghapus gen-gen dengan cara spesifik jaringan dan/atau
menonaktifkan gen-gen pada waktu-waktu yang berbeda dalam perkembangan
selain itu seringkali menarik untuk menghasilkan mutasi gen khusus dairpada
mengeliminasi ekspresi mereka secara utuh. Rekombinasi homolog juga digunakan
untuk memperkenalkan mtuasi-mutasi spesifik ke gen-gen tipe liar; perbedaan
dalam tekniknya adalah knock ins terebut menggunakan targeting construct yang
berisi gen mutan daripada delesi gen. pendekatan-pendekatn rekombinasi hoolog
lainnya memungkinkan pengenalan gen khusu atau tak berhubugnan ke dalam
sebuah lokus genetik asing untuk mengatur gen baru di bawah kontrol promoter
lokus yang ditargetkan.
Pendekatan lain pada delesi gen spesifik jaringan adalah penggunaan sistem
rekombinasi phage bakterial yang disebut Cre-lox. P1 bacteriophage mengkodekan
sebuah enzim yang disebut Cre yang mengkatalisis rekombinasi DNA di antara dua
rangkaian spesifik (disebut tempat-tempat loxP) yang menandai rekombinasi.
Sistem ini telah diterapkan pada tikus dengan menghasilkan targeting construct di
mana gen yang dimaksud diflanked dengan tempat-tempat loxP (sebauh floxed
34

allele). Tikus homozigous untuk floxed allele diternakkan dengan tikus transgenik
yang mengekspresikan Cre recombiase dengan cara spesifik jaringan (misalnya selsel endotel, sel-sel oto halus vaskular, kardiomiosit). Tikus yang dihasilkan
memiliki delesi gen yang menarik hanya pada jaringan yang mengekspresikan Cre
rekombinase. Dengan menempatkan Cre transgene di bawah kontrol promotor
responsif tetracycline, delesi gen diprogram hanya dengan mengikuti tetracycline
feeding.

Studi-studi Fisiologi Tikus


Menyadari keuntugnan potensi genetika tikus memerlukan teknologi yang bisa
mengolongkan fenotip tikus mutan. Tikus ini secara teknis menantang karena
pembuluh jantung dan hati berikuran kecil dan denyut jantung tikus yang
beristirahat lebih dari 500 denyut/menit. Teknik mikro bedah dan instrumentasi
miniatur membantu memecahkan problem ini. Dengan teknik-teknik tersebut,
dimungkinkan untuk mengambil ukuran-ukuran fisiologis pada tikus yang
dianastesi dan diintubasi termasuk tekanan darah aortik, tracing tekanan ventrikular
kiri dan hemodinamika kardiak sebelum dan setelah infusi zat-zat farmakologis,
seperti dobutamine atau isoproterenol. Pencitraan non invasif

jantung dan

vaskulatur membaik scara substnsial dan ekokardiogram dua dimensi sekarang ini
rutin dilakukan pada tikus dewasa dan fetal. MRI memberi gambar yang jelas pada
struktur dan fungsi kardiak. Teknik-teknik non invasif ini digunakan untuk mengkur
dimensi ventrikular kiri sistolik akhir dan diastolik akhir, ketebalan dan massa
dinding ventrikular kiri dan fraksi pemendekan. Infraksi miokard yang dihasilkan
oleh ligasi arteri koroner, cidera bawat pada pembuluh yang mensimulasi
35

angioplasti dan aortic banding untuk menginduksi hipertropi ventrikular kiri


umumnya dilakukan pada tikus yang dimodifikasi gen. uji latihan, 25 jam
pencatatan elektrokardiogram pada tikus sadar dengan menggunakan implanted
transducer dan studi-studi elektrofisiologis untuk mendeteksi cardiac arrhytmia juga
menjadi teknik standar. Dengan keterediaan teknik untuk mempelajari fisilogi
kardiovaskular, tikus yang dimodifikasi scara genetik sekarang memberi cara yang
akurat dan nyaman untuk mengevaluasi fungsi gen-gen khusus dalam penyakit
kardiovaskular.

Transfer Gen
Transfer gen adalah pengenalan atau ekspresi gen-gen rekombinan pad sel-sel
mamalia. Transfer gen bertujuan memperkenalkan gen-gen rekombinan ke sel-sel
target untuk mempelajari mekanisme dan konskenwesi ekspresi gen. gen-gen
ditranfeksi ke dalam sel-sel menggunakan vektor. Gen rekombinan mengalami
transkripsi ke dalam RNA dan translasi ke dalam protein oleh enzim inang, yang
emmuncak dalam ekspresi protein rekombinan. Protein rekombinan tetap
intraselular atau disekesi ke ruang ekstraselular atau sirkulasi. Ekspresi gen transien
atau stabil, bergantung pada apakah integrasi ke dalam kromosom terjadi. Efiisensi
uptake DNA dan ekspresi gen sering disebut sebagai efisiensi transfeksi bergantung
pada banyak faktor antara lain pengiriman DNA ke dalam sel, uptake DNA ke
dalam sitoplasma, degradsi DNA dalam endosom, pelepasan DNA dari endoosm ke
sitoplasma, transpor ke nukleus dan persistensi dalam nukleus.
Transfer gen in vivo dilakukan oleh metode transfer gen langsung atau dimediasi
sel. Transfer gen ex vivo atau yang dimediasi sel melibatkan pelepasan sel-sel
36

autolog dari inangd an mentransfeksi sel-sel dengan vektor in vitro. Sel-sel yang
dimodifikasi secara genetik diperkenalkan kembali ke inang oleh infusi atau injeksi.
Transfer gen ex vivo memungkinkan pengenalan materi genetik rekombinan ke
dalam sel spesifik misalnya sel-sel otot endotelial atau halus dan analisis
eksprei gen rekombinan di dalam tipe sel tersebut
Transfer gen in vivo menggunaan gen-gen rekombinan langsung ke dalam sel-sel
dan jaringan-jaringan target. Transfer gen yang ditargetkan dalam vaskulatur
dilakukan oleh promotor spesifik sel untuk mencapai ekspresi gen did alam sel
endotel atau sel-sel otot halus. Baik pendekatan transfer gen ex vivo dan in vivo
telah digunakan dalam pengembangan model binatang penyakit vaskular dan dalam
percobaan klinis transfer gen ke sistem kardiovaskular.

Vektor
Transfeksi sel-sel target yang cocok merupakan langkah pertama yang penting
dalam

transfer

gen.

akibatnya

pengembangan

metode

transfer

gen

merepresentasikan bidang penelitian yang cukup signifikan. Baik vektor viral dan
non viral telah digunakan dalam studi-studi transfer gen vaskular. Ciri-ciri umum
dari metode tersebut adalah pengiriman gen secara efisien ke dalam sel. Vektor
berbeda dalam pemrosesan DNA asing dan frekuensi integrasi ke dalam DNA
kromosomal. Dalam kasus vktor retroviral dan lentiviral, rangkaian-rangkaian yang
ditransfer diintegrasikanke dalam DNA kromosomal sel target. Vektor-vektor ini
paling sering digunakan dalam terapi gen ex vivo. Metode-metode lain dari hasil
transfer gen menghasilkan pengenalan dna asing ke nuklei sel target dalam bentuk
yang tidak terintegasi. Metode-metode ini menghasilkan ekspresi gen tinggi tapi
37

transien. Vektor-vektor yang meliputi adenovirus, virus terkait adeno dan liposome
kationik telahdigunakan terutama untuk studi-studi transfer gen in vivo.

Retrovirus
Retrovirus merupakan vektor-vektor pertama yang digunakan dalam studi transfer
gen sejak 1980an. Minat awal terhadap retrovirus sebagai vektor muncul dari
observasi bahwa vektor-vektor tersebut dengan stabil mentransduksi hampir sekitar
100 persen sel-sel target yang berproliferasi dalam kultur. Vektor-vektor retrovirus
digunakan pada awalnya dalam studi-studi tranfer gen vaskular, terutama studistudi ex vivo, tapi penggunaannya terbatas oleh efisiensi transfeksi. Vektor-vektor
retroviral telah digunakan baru-baru ini dalam studi-studi terapi gen klinis untuk
pengobatan SCID. Sayangnya dalam satu percobaan, dua anak mengalami
komplikasi insersi retroviral ke dalam tempat onkogenik kromosom X yang
menyebabkan leukemia.

Adenovirus
Adenovirus tipe 2 dan 5 adalah dua serotip yang digunakan untuk vektor-vektor
dalam transfer gen kardiovaskular. Genom adenovirus linear, DNA berhelai ganda,
sekitar 36kb panjangnya yang dibagi menjadi 100 unit peta masing-masing 360
pasangan basa panjangnya. DNA mengandung ITR pendek pada ujung genom yang
diperlukan untuk replikasi DNA viral. Produk-produk gen ini diatur ke daerah awal
(E1-E4) dan akhir (L1-L5) berdasarkan eksprei sebelum atau sesudah permulaan
replikasi DNA. Adenovirus emiliki siklus hidup litik yang ditandai oleh
penempelan ke reseptor glikoprotein adenoviral pada sel-sel mamali adan masuk k
38

sel-sel dengan endositosis yang dimediasi reseptor. Protein capsid adenoviral


melindungi adenovirus dari degradasi lisosomal, dan DNA viral bertranslokasi ke
nukleus. Ekspresi gen-gen viral berganung pada faktor-faktor transkripsi selular dan
ekpsreis daerah E1 adenoviral, yang mengkodekan transaktivator ekspresi gen viral.
Selama infeksi litik, genom viral mereplikasi ke beberapa ribu kopi per sel. Genom
viral berhubungan dengan protein inti dan dikemas ke dalam kapsid dengan
menyusun protein kapsid utama.
Genom adenovirus merupakan replikasi yang defisien untuk menciptakan sebuah
vektor. Vektor-vektor disusun oleh rekombinan homolog dalam lini sel yang dikenal
sebagi 293 sel oleh kontrasfeksi 1) plasmid bakteri yangmengandung cDNA yang
dimaksud dan daerah kecil genom adenoviral yang didelesi dari daerah E1A dan
E1B (daerah-daerah ini meregulasi transkripsi adenoviral dan diperlukan untuk
replikasi viral) dan 2) genom adenoviral tak sempurna. Rekombinasi homolog di
antara dua DNA menghasilkan genom rekombinan di mana gen asing
menggantikand aerah E1. Stok viral dipropagasi pada 293 sel ke titer tinggi yang
umumnya merupakan unit pembentuk plak (pfu) per mililiter.
Vektor-vektor adenoviral memiliki beberapa keuntungan tambahan yang meliputi
infeksi efisien sel-sel mamalia dan ekspresi dalam sel-sel non membelah dan in
vitro dan in vivo. Vektor-vektor ini relatif stabil dan bisa ditumbuhkan dan
dikonsenrasikan pada titer tinggi. Replikasi ekstrakromosomal dari vektor sangat
mengurangi peluang mutasi oleh integrasi random dan disregulasi gen-gen selular
inang. Meski demikian jumlah kekurangan membatsi penggunaannya sebagai
vektor transfer gen. ekpsresi gen dalam sel-sel vaskular dan miokardial setealh
infeksi adenoviral berumur pendek, terdiri hanya selama beberapa minggu. Respon
39

imun kekebalan terhadap protein adenoviral menunjukkan kelemahan utama pada


pemakaian in vivonya. Meski tingkat antibodi penetral yang rendah tidak nampak
menimbulkan efek klinis buruk, mash tetap ditentukan apakah respon kekebalan
inang terhadap adenovirus akan menghilangkan pemakaian adenoviral dari serotipe
adenovirus yang sama. vektor-fvektor adenoviral rekomin an

genrasi pertama

(delesi gen E1A dan E1B dan delesi partial gen-gen E3) telah digunakan
secaraklinis dalam studi-studi terapi gen, meski dalam model-model binatang
vektor-vektyor tersebut sering dikaitkan dengan inflamasi jaringan, khususnya pada
liver dan paru-paru. Pemaparan langsung liver yang sakit terhadap vektor
adenoviral titer tinggi sangat beracun dan dalam satu kasus mematikan. Inaktivasi
dari gen E2A memperpanjang ekspresi gen dan menghasilkan lebih sedikit
inflamasi pada paru-paru dan liver. Dalam studi-studi transfer gen artetrial yang
menggunakan avektor adenoviral,

infiltrat sel inflamatoris mononuklear telah

diamati dalam adventitia arteri pulmonary dan periferal tapi tidak ditemukan
adanya nekrosis atau vaskulitlis. Infeksi arteri pulmonary dengan adenovirus
dikaitkand engan tingkat inflamasi perivaskuarl reingan; meski demikaina rteri
pulmonary yang diberi saline atu lposome juga menunjukkan akumulasi ringan selsel mononuklear perivaskular. Meskid engan kelemahan respon imun terhadap
protein kapsid adenoviral, vektor-vektor adenoviral merupakan alat yang menarik
untuk transfer gen in vivo pada model-model binatang karena efisiensi tarnsfeksi.
Apakah vektor adenoviral akan digunakan secara klinis masih perlu dilihat.

Virus-virus terkait-Adeno

40

Adeno-associated virus (AAV) adalah parvovirus manusia defektif yang memiliki


ciri-ciri menarik sebagai vektor transfer gen. vektor viral ini dipersiapkan pada titer
tinggai dan normalnya tidak patogenik pada manusia dan meginfeksi banyak tipe
sel in vitro. Genom AAV adalah molekul berhelai tunggal, linear berukuran DNA
5kB. AAV tipe liar berinterasi menurut tempat dalam daerah 7 kb tunggal pada
kromosom 19 manusia. Genom AAV diflanking oleh 145 pengulangan terminal
terbalik-pasangan basa yang berisi rangkaian yang diperlukan untuk pengemasan,
replikasi DNA dan integrasi. Daerah koding mengandung dua frame badcaan
terbuka yang didelesi dan diganti dengan satu atau beberapa cDNA plus unit-unit
regulatoris transkripsional selama konstruksi vektor. Vektor-vektor AAV menerima
kaset transgene hanya 4 hingga 5 kb; ini membatsi tipe-tipe transgene yang bisa
digunakan. Propatgagasi vektor-vektor AAV memerluakn pekemasan kompleks
yang meliputi protein AAV Rep dan Cap dan lima protein adenoviral (E1A, E1B,
E2A, E4 dn VA). Syarat-syarat pengemasan kompleks ini menghilangakn
konstruksi lini sel helper untuk AAV. Aat ini vektor disusun oleh kontrasfeksi selsel dengan vektor AV dan plasmid non packeable yang berisi protein Rep dan Cap
AAV. Ini diikuti oleh infeksi sel-sel yang ditransfeksi dengan adenovirus helper
mutan atau tiep liar. AAV dipisahkan dari adenovirus pengontaminasi oleh
treatment panas dan sentrifugasi gradsi kerapatan ekulibrium.
Vektor-vektor AAV menginfeksi beberapa tipe sel in vitro tapi kegunaannya secara
in vivo masih tidak pasti. Transduksi sel-sel otot halus dan endotelial vaskular tetap
tidak diketahui. Kelemahan selanjutnya meliputi tidak adanya lin9-nili sel kemasan
dan kebutuan untuk koninfeksi dengan adenovirus sehinga memeprsulit
mempersiapkan vektor AAV murni dalam jumlah besar. delesi gen-gen viral selaam
41

konstruksi vektor membatasi kemampuan vektor-vektor tersebut berinterasi dengan


cara spesifik tempat tapi memberi kemungkinan mutagenesis interlesional. Vektorvektor AAV memiliki daya tarik teoritis tapi diperlukan karya yang lebih besar
sebelum bisa digunakan secara klinis.

CATIONIC LIPOSOMES
Cationic lipids merupakan preparasi lipid bermuatan positif yang secara spontan
berkompleks dengan DNA bermautan negatif membentuk konjugat lipid-DNA>
komponen lipid membantu pengiriman DNA ke sel-sel dengan fusi dengan
membran plasmid atau dengan membran endosomal setealh endositosis. Setelah
pelepasan

dari

endosom,

DNA

plasmid

dipertahnakand

alam

bentuk

ekstrakromosomal. Liposom kationik telah digunakan dalam studi-studi transfer


gen arterial dalam banyak model binatang termasuk tikus, kelinci, anjing dan babi.
Keuntungan liposom kationik melipuiti profil keamanan yang bagus, tidak adanya
rangkaian koding viral dan tidak ada batasan-batasan ukuran cDNA. Mereka
menghasilkan toksisitas biokimia, hemodinamika atau akrdiak minimal pada
biantang atau manusia. Vektor-vektor ini cukup jelas untuk dipersiapkan bagi
pemakaian klinis dan eksperimental. Kelemahan-kelemahan meliputi efisiensi
transfeksi rendah dan ekspresi gen jangka pendek.
POLYMERS
Asam nukleik dan obat telah digunakan pada gel-gel polimer yang dilapiskan
pada sten atu balon dan secara langsung diterapkan pada arteri. Banyak polimer
sebelumnya dikaitkand engan reaksi-reaksi ifnlamatoris kuat. Formualsi-

42

formualsi yang lebih baru telah berhasil dignakan dalam pengembagnan drugeluting stent.

Model-model binatang
Transfer gen adalah pendekatan yang berguna untuk memasukkan asam nukleik ke
sel-sel somatik pada binatang untuk menentukan fungsi gen, mendieseksi
patofisiolgoi penyakit atau mencapai efek terapeutik. Selama dekade yang lalu
transfer

gen

telah

diguanaknda

lam

banyak

model

binatang

penyakit

kardiovaskular. Pendekatan berbasis gen dan berbasis sel telah digunakan meliputi
minat terbaru dalam menggabungkan trasnfer gen dengan terapi-terapi berbasis sel
batng. Transfer gen sebagai perangkat untuk menginduksi pertumbuhan vaskular
merupakan contoh ilustratif.
Pertumbuhan vaskular berlangsung melalui beberapa tahap angiogenesis,
arteriogenesis dan limpoangiogenesis. Angiogenesis merpakan sprotuing pembuluh
darah baru dari pembuluh-pembuluh yang ada sebelumnya. Arteriogenesis adalah
pembesaran pembuluh darah kolateral muskular dari anastomosis arteriola yang ada
dan sering disebut sebagai kolateralisasi. Limpangiogenesis adalah pembentukan
pembuluh limpatik baru dari yang sudah ada. Ini dipakai scara luas dalam studi
klinis dan pra klinis. Dua varian splice dari VEGFA, VEGF dan VEGF memiliki
sifat-sifat angiogenik pada model binatang dan dievaluasi dalam percobaanpercobaan klinis. PIGF juga memiliki aktivitas angiogenik pada binatang. PIGF

43

mengikat ke VEGFR-1 dan berkontribusi pada angiogenesis di bawah kondisi


patologis. Yang menarik PIGF juga mendukung angiogenesis dan arteriogenesis
melalui mobilisasi sel-sel batang hematopoietik dan sel-sel progenitor endotel dari
sungsum tulang. Relevansi klinis VEGF, PIGF, dan sel-sel progenitor endotlial
dalam treatment klinis iskemia masih belum ditetapkan meski ada upaya
mentrandsuksi sel-sel batang dengan VEGF untuk meningkatkan angiogenesis.
Faktor-faktor pertumbuhan lain telah dievaluasi untuk sifat-sifat angiogenik dalam
model transfer gen. hypoxia-inducible transcription factor-1-alha mengaktifkan
faktor-faktor pertumbuhana ngiovengik antara lain VEGF-A, vEGR-2 faktor
pertumbuhan seperti insulin 2, dan eritropoiten. Faktor transkripsi lueicne zippr
yang mengaktivasi transkirpsi VEGF juga telah dijelaskan baru-baru ini.
Hipotesis bahwa overekspresi faktor-faktor pertumbuhan akan menyebabkan
pertumbuhan vaskular terapeutikt elah diuji pada beberapa model biantang iskemia
periferal dan myokarial termasuk transduksi ex vivo sel-sel batang dan sel-sel
progenitor endotel. VEGF yang dimedaisi adenoviral dan pengiriman dan
pertumbuhanv askular telah ditunjukkan dalam miokardium dan otot skeletal oleh
prolfeirasi dan pembesaran kapiler, meski penghentian terapi (atau pemusnahan
transgen) menyebabkan regresi sebagian besar pembuluh. Ekspresi VEGF selama
lebih dari 4 minggu menyebabkanr emodeling vaskular yang memadsi bahwa
pertumbuhan pembuluh baru berlangsung selama beberapa bulan setelah treatment
VEGF dihentikan. Pada model-model binatang, faktor hemodinamika dan
persistensi aliran darah penting bagi stabilitassi pembuluh yang baru dibentuk.
Selanjutnya nilai prediktif model binatang praklinis berhubungan terbalik dengan
ukuran binatang. Banyak aplikasi dan vektor bekerja dengan baik pada binatng
44

kecil seperti tiksu dan mencit tapi meningkat pada binatang besar seperti babi,
anjing dan bibri-biri terbukti sulit. Demo kemanjuran pad binatang normal dam
muda mungkint idak memprediksikanr espon pada pasien manusia tua dengan
penaykit kronis. Sebenarnya, binatang diabetik dan lansia mengalami gangguan
pertumbuhan vaskular. Banyak efek biologis menguntungkan yang dilaporkan pada
binatang tidak diterjemahkan pada manusia dengan keterbatasan vektor saat ini

Percobaan-percobaan klinis
Percobaan-percobaan terapig en kardiovaskular memiliki proses yang bisa
diperiksa. Banyak percobaan fase 1 etlah dirampungkan tapi sedikit yang berlanjut
ke studi fase II. Perhatian muncul tentang penggunan vektor-vektor adenoviral
bahkan utnuk aplikasi kardiak atau vaskular, dan juga efisiensi transfeksi rendah in
vivo. Sebagian besar studi berfokus pada stimulasi angiogenesis dan arteriogenesis
untuk memperbaiki perfusi otot skelatal atau myokardial. Tiga fase percobaan
angiogenesis terapeutik telah dilakukans aat ini. Percobaan fase 1 awal
menggunakan DNA plasmid dan adenovirus untuk menginduksi angiogenesis ke
iskemia miokardial atau periferal. Percobaan ini mengevaluasi keamanan fvektor
dan kateter atau pengiriman injekasi langsung pada sejumlahkecil pasien. Temuantemuan yang konsisten juga dibuktikan: tidak ditemukan peristiwa buruk serius
akibat vektor gen tersebut atau alat pengirim. Dengan menunjukkan keamanan,
percobaan fase I/II mengevaluasi jumlah pasien yang lebih besar dengan titik-titik
akhir keampuhan l;unak. Tidak ada perisitwa buruk utama yang dilaporkan dan
meski temuan-temuan kampuhan positif dilaporkan, banyak dari percobaan tersbeut
yang tidak dikontrol. Secara kolektif didapatkan pemahaman klinis berikut. Efek45

efek plasebo umum pada pasien yang diobati mungkinkarena perubahan


hemodinamika atau membaiknya perawatan klinis. Titik-titik akhir klinis tidak
slealu ditetapkan sebelumnyad an menimbulkan keraguan tentangdata kemanjuran.
Tidak adanya studi random dan terkontrol juga tidak memabntu bidang ini
melangkah lebih maju. Fase ketiga percobaan klinis telah dimulai dengan studi
terkontrol palcebo yang meliputi jumlah apsien yang lebih besar dan titik-titik akhir
klinis yang lebih jelas. Data dari studi fase III tersebut dan follow up jangka
panajgn penting untuk menentukana pakah sebuah produk terapi gen akan disetujui
oleh FDA dan digunakans cara klinis untuk mengobati iskemia perifral dan/atau
myokardial. Membaiknya pemahaman tentang farmakokinetika juga penting. Para
peneliti harus berlanjut dengan percobaan yang dievaluasi dan dilakukan dengan
hati-hati.

Petunjuk-petunjuk di masa mendatang


Biologi molekular dan selular sekarang bergabung dengan riset kardiovaskular
mainstream. Pendekatan-pendekatan ini mengedepankan pemahaan kami tentang
aptogenesis penyakit kardiovaskular yang mendorong pada pengembangan model
binatang yangs angat berguna dan memberi prinsip-prinsip dasar untuk terapi-terapi
molekular. Riset kardiovaskular sekarangberalih ke genetika molekular sebagai
areana ilmiah berikutnya di mana kemajuan utama akan terjadi. Saat ini, kami
mulai memahami mekanisme di mana gen-gen tunggal menyebabkan penyakit
akrdiovasular. Mekanisme ini memberikan wawasan yang luar biasa tentang
patofisiologi gangguan kardiovaskular umum kompleks. Tantangan utama
berikutnya dalam bidang genetika adalah memahami dengan lebih jelas kerentanan
46

genetik terhadap penyakit-penyakit kardivoaskular umum. Genotyping, genomik


dan proteomik merupakan pendekatan-pendekatan yang menjanjikan dan masih
pada tahap aplikasi dini. Informasi yang didapatkan dari teknik ini hanya akan
sebagus karakterisasi fenotip klinis

oleh dokter yang cermat dan pintar yang

mendeteksi pola-pola penyakit yang tak lazim pada para pasien mereka. Meski
banyak invetigator tetap bisa diharapkan, kami tidak tahu peran yang dimainkan
oleh terapi berbasis sel atau genetik dalam praktek kardiologi klinis. Upaya-upaya
dari banyak dokter-ilmuwan dan para peneliti klinis diperlukan untuk melakukan
studi yang cermat dan penuh pertimbangan. Hanya kemudian janji genetika
molekular bisa diwujudkan dan diterapkan untuk mengobati pasien kardiovaskular.

47