TINCIONES

Una tincin o coloracin es una tcnica auxiliar utilizada en microscopa para

mejorar el contraste en la imagen vista al microscopio. Los colorantes y tinturas
son sustancias que usualmente se utilizan en biologa y medicina para resaltar
estructuras en tejidos biolgicos que van a ser observados con la ayuda de
diferentes tipos de microscopios. Los diferentes colorantes pueden ser
utilizados para aumentar la definicin y examinar grandes cortes de tejido
(resaltando
por
ejemplo fibras
musculares o tejido
conectivo),
poblaciones celulares (por ejemplo clasificando diferentes clulas sanguneas)
o incluso para resaltar organelas dentro de clulas individuales.
Mecanismos de Coloracin:
La coloracin celular y tejidos son una combinacin de fenmenos fsicos y
qumicos de absorcin: los fenmenos fsicos de absorcin, capilaridad y
smosis participan en cierto grado. La afinidad de colorantes bsicos por los
tejidos cidos y viceversa indican que hay reaccin qumica.
Los Colorantes:
Son compuestos, orgnicos que contienen radicales cromforos esto es que
producen color y grupo de anxocromos que forman sales los grupos nitrito (NO2) y azo (-N = N) son cromforos. Los radicales hidroxilo (-OH) y amino (NH2)
son
grupos
anxocromos.
Los
cromforos
imparten
la propiedad cromgena al colorante y los anxocromos permiten que el
colorante se una con la fibra o tejido.
Preparacin de Frotis Bacteriano para Coloracin:
Entes de la tincin las bacterias suelen encontrarse en agua o en otro lquido
en un porta objeto limpio y son extendido en una pelcula uniforme y delgada.
Se deja que la pelcula seque en el aire y los microorganismos son fijados por
sustancias qumicas o por el calor moderado.
Tinciones:
Es un mtodo utilizado para estudiar microorganismos. (no vivos); en estas
tinciones se observa morfologa, estructura y agrupamientos de
microorganismos.
Tipos de Tincin:
Tincin Simple: utiliza un solo colorante.
Tincin de Gram:
Utiliza varios colorantes (cristal violeta 1m, Yodo 1m, lavado con alcohol,
Safranina 30 seg)
Tincin cido Resistente:
Una vez teidos, conservan su color resistiendo al lavado con cido mineral
reducido. En esta tincin las bacterias cido resistentes conservan el colorante
primario color rosa o rojo, los dems microorganismos son decolorados por el
cido y toman el color azul.
Tincin de Giensa:
El colorante se aplica a un frotis de sangre y se utiliza cuando se sospeche de
protozoos en la sangre para observar materias ncleos de la clulas.
Tincin de Esporas:
Se usa verde de malaquita en contraste con safranina.
Tincin de Cpsula:

Colorante nigrosuna, aqu se observa microorganismos encapsulados

creando resistencias.
Tincin de Flagelos:
Se usa mordiente el cual aumenta el tamao del microorganismo.
Endsporas:
Son unos cuerpos resistentes que se producen en el interior de la clula los
cuales contienen los componentes necesarios para conservar la vida.
Las esporas pueden situarse en el centro de la clula o en situaciones
excntricas cerca de un extremo de la misma.
Levaduras:
Son esfricas, elpticas y cilndricos, su tamao vara notablemente. Son
hongos cuya forma corriente y dominante de crecimiento es unicelular.
Las Cpsulas:
Son estructuras grueso viscosas gelatinosas que rodean las clulas de algunas
especies.
Sarcina:
Son anaerobios obligados y son extremadamente cido tolerantes que
pueden fermentar azcares y crecer a pH inferior a 2.
Este gnero comprende 2 especies de bacterias que se dividen en tres planos
perpendiculares para producir paquetes de 8 en una clula.
Bacillus Cereus:
La mayora se encuentra en el suelo o en partculas de polvo en suspensin y
son uno de los organismos del gnero Bacillus que pueden ser aislados
fcilmente.

Rojo Neutro
El rojo neutro es un colorante que se une a las
regiones basfilas del tejido nervioso. Se tien
los ncleos de todas las clulas (neuronas y
clulas gliales) y la sustancia de Nissl
(ribosomas libres y asociados a membranas del
retculo endoplasmatico rugoso). No se tien los
axones, por carecer de ARN en su interior. Al teir de color rojo las clulas, es
muy til para contrastar cortes teidos con otras tcnicas como por ejemplo la
tcnica A-Cu-Ag (tcnica de plata), donde la degeneracin se tie de color
negro. De esta manera el rojo neutro permite reconocer reas especficas del
cerebro que han sido afectadas por la degeneracin.

Nissl

Esta tcnica generalmente utiliza como colorante el

violeta de cresilo, este colorante es una anilina bsica
(cargada en forma positiva) que se une a las regiones
basfilas de las clulas del tejido nervioso. Tambin
se utiliza el azul de tionina el cual da un color azulviolceo. Tiene mayor contraste que la tcnica con
rojo neutro por lo que es la contracoloracin elegida
para el estudio de detalles citolgicos y
citoarquitectnicos.

Hematoxilina-eosina
Es una coloracin topogrfica de rutina ya que
permiten distinguir detalles morfolgicos de clulas y
tejidos. Existen mltiples variantes, segn se emplee
un tipo u otro de eosina y de hematoxilina
(generalmente se emplea la hematoxilina de Harris).
Por lo comn, este mtodo siempre consta de una
etapa inicial, en la que se colorean los ncleos celulares con la hematoxilina
(violeta), y en una fase ulterior de contraste citoplasmtico y de los
componentes extracelulares con la eosina (rojo-rosado).

Inmunohistoqumica
La inmunohistoqumica es una tcnica utilizada para
la localizacin de molculas especficas en los
tejidos mediante el empleo de anticuerpos (protenas
del tipo inmunoglobulina G). Es una tcnica que
gracias a la oferta comercial de anticuerpos y a la
estandarizacin de su protocolo se ha convertido en un mtodo sencillo, rpido
y muy potente. Se basa en la gran especificidad y alta afinidad que tienen los
anticuerpos para reconocer a molculas y unirse a ellas. Adems, la
conjugacin o combinacin de los anticuerpos con enzimas o con sustancias
fluorescentes permite detectar molculas presentes en el tejido.

Tipos de tcnicas de tincin.

Tinciones simples:
Se usa un nico colorante, que siempre es de tipo bsico. Se utilizan
solamente para incrementar el contraste; todas las clulas absorbern el
colorante y quedarn teidas del mismo color. Se fija el espcimen, se aade el
colorante y se deja el tiempo adecuado para que se absorba, se retira el
exceso de colorante y la preparacin ya est lista para ser observada.
Tinciones diferenciales:
Se utilizan para distinguir entre tipos de microorganismos. La tcnica de tincin
diferencial consta de dos etapas: una tincin simple seguida de una tincin de
contraste. En la tincin de contraste se utiliza otro colorante que tie (y por
tanto, revela) las clulas no teidas por el primer colorante. Estas tinciones son
muy utilizadas en microbiologa.
Tinciones especficas:
Se utilizan para incrementar el contraste en las clulas microbianas y revelan
estructuras particulares, entre las que se incluyen en los flagelos y las
cpsulas.
Tincin adecuada:
En su forma ms simple, el verdadero proceso de tincin puede implicar la
inmersin de la muestra en la solucin colorante, seguido del aclarado que es
un lavado para eliminar el exceso de colorante y la observacin. Muchos tintes,
sin embargo, requieren del uso de un mordiente. Cuando la solucin de
colorante en exceso se elimina durante el aclarado, la tincin mordentada
permanece.
Tincin negativa:
Un mtodo sencillo de tincin para bacterias, que adems es un claro caso de
cromofobia y que por lo tanto funciona aun cuando los mtodos de tincin
positiva fallan, es la tincin negativa. Esto puede ser conseguido simplemente
extendiendo la muestra en un portaobjetos y aplicando directamente sobre ella
una gota de nigrosina o tinta china y cubriendo luego la muestra humedecida
con un cubreobjetos. Luego de esto, los microorganismos pueden ser
observados fcilmente por medio de microscopa en campo claro como
inclusiones claras muy bien contrastadas contra el medio oscuro que las rodea.
Tincin indirecta:
Se denomina de este modo a las tinciones que hacen uso de un mordiente. Un
mordiente habitual es el cido tnico.

Tincin directa:
Hablamos de tincin directa cuando el colorante interacciona directamente con
el sustrato, sin otro tratamiento previo.
Tincin Gram:
La tincin de Gram es uno de los mtodos de tincin ms importantes en el
laboratorio bacteriolgico. Su utilidad en la prctica de referencias a la
morfologa celular bacteriana (cocos, bacilos, positivos, negativos, etc.) se
basan justamente en la tincin de GRAM
1. Se tie el espcimen con el primer colorante, cristal violeta.
2. Se aade el mordiente, yodo.
3. Se aplica el agente decolorante, normalmente una solucin de acetona o
etanol. En este momento, las bacterias Gram negativas pierden su tincin
violeta, pero las Gram positivas retienen el colorante.
4. Como colorante de contraste se aade safranina, que tie de rosa las
bacterias Gram negativas, previamente decoloradas; mientras que a las
bacterias Gram positivas les proporciona un color violeta ms intenso.
Tincin: RODAMINA-AURAMINA
Los cidos miclicos de las paredes celulares de las micobacterias poseen
afinidad para los fluorocromos auramina y rodamina. Estos colorantes se fijan a
las bacterias, que aparecen de color amarillo o naranja brillante contra un fondo
verdoso. El permanganato de potasio, empleado como contraste, evita la
fluorescencia inespecfica. Todos los microorganismos cido-alcohol
resistentes, incluyendo los esporozoarios parsitos, se tien con estos
colorantes.
Un aspecto importante de la coloracin rodamina-auramiria es que luego los
frotis pueden ser reteidos con la coloracin de Ziehl-Neelsen o Kinyoun
directamente sobre la tincin con el fluorocromo, si se elimina antes el aceite
de inmersin. De esta forma, los resultados positivos pueden ser confirmados
con las coloraciones tradicionales, que adems permiten la diferenciacin
morfolgica.

Tincin: NARANJA DE ACRIDINA

El fluorocromo naranja de acridina se une al cido nucleico ya sea en su forma
nativa o desnaturalizada. En algunas preparaciones de naranja de acridina, el
color de la fluorescencia puede variar, dependiendo del pH y de la
concentracin. El naranja de acridina ha sido empleado como colorante vital,

que da una fluorescencia verde si el microorganismo est vivo y roja si est

muerto. De todos modos, como el colorante se intercala en el cido nucleico, el
germen viable se inactivar poco tiempo despus de la tincin.

Colorantes.
La mayora de los colorantes son compuestos orgnicos que tienen alguna
afinidad especfica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados
con frecuencia son molculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan
con intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente, tales
como los cidos nucleicos y los polisacridos cidos.
Azul de metileno: El azul de metileno se utiliza para teir clulas animales,
para hacer ms visibles sus ncleos. Es tambin utilizado para teir los
extendidos de sangre para ser utilizados en citologa y como colorante vital en
el recuento de reticulocitos.
Azul Nilo: Tie los ncleos de color azul. Tambin puede ser utilizado para
teir clulas vivas.
Cristal violeta: El cristal violeta, al ser combinado con un mordiente adecuado,
tie las paredes celulares de color prpura. El cristal violeta es un componente
importante en la coloracin de Gram.
Eosina: La eosina se utiliza ms frecuentemente como contra coloracin de la
hematoxilina, impartiendo un color que va del rosado al rojo al
material citoplasmtico, membrana
celular,
y
algunas
estructuras
extracelulares. Adems imparte un fuerte color rojo a los eritrocitos. La eosina
puede ser utilizada tambin en algunas variantes de la coloracin de Gram, y
en muchos otros protocolos de tincin.

Safranina: La safranina es un colorante nuclear. Colorea los ncleos celulares

de rojo, y se utiliza principalmente como contracoloracin. Tambin puede ser
utilizada para darle una coloracin amarilla al colgeno.

Verde de metilo: El verde de metilo se utiliza frecuentemente en microscopia

de campo claro, para teir la cromatina de las clulas y facilitar as su
visualizacin.