Laporan Praktikum
Laporan Praktikum
REKAYASA GENETIKA
LAPORAN II
(ISOLASI DNA GENOM)
KHAIRUL ANAM
P051090031/BTK
BIOTEKNOLOGI
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2010
0
TINJAUAN PUSTAKA
Isolasi DNA genom sangat penting dalam rangka pengklonan DNA atau gen sasaran.
Konstruksi pustaka genom dan pengklonan DNA membutuhkan DNA yang utuh agar fragmen
DNA betul-betul berasal dari proses pemotongan enzimatik yang sangat spesifik. Bila
terpotongnya DNA bukan karena reaksi enzimatik, maka fragmen DNA tersebut sulit
disambungkan dengan DNA dari vektor pengklonan. Oleh sebab itu isolasi DNA genom yang
utuh sangat diperlukan bila DNA tersebut akan diproses untuk pengklonan (Suharsono dan
Widyastuti, 2006).
16S rRNA
Berbagai metode analisis DNA yang cepat telah diperkenalkan, antara lain yang
mentarget keseluruhan genom seperti AFLP, RAPD, ERIC, BOX, REP, dan PFGE. Analisis
juga dapat mentarget hanya suatu klaster gen seperti ribotyping pada operon rrn, atau bahkan
gen individual seperti ARDRA dan T-RFLP pada gen penyandi 16S rRNA, intergenic spacer
regions/ISR, serta elemen genetik mobile. Di antara berbagai teknik yang digunakan, RNA
ribosomal paling banyak digunakan sebagai penanda molekuler. Pada prokaryota terdapat tiga
jenis RNA ribosomal, yaitu 5S, 16S, dan 23S rRNA. Di antara ketiganya, 16S rRNA yang paling
sering digunakan. Molekul 5S rRNA memiliki urutan basa terlalu pendek, sehingga tidak ideal
dari segi analisis statistika, sementara molekul 23S rRNA memiliki struktur sekunder dan tersier
yang cukup panjang sehingga menyulitkan analisis. Analisis gen penyandi 16S rRNA telah
menjadi prosedur baku untuk menentukan hubungan filogenetik dan menganalisis suatu
ekosistem.
16S rRNA dapat digunakan sebagai penanda molekuler karena molekul ini bersifat
ubikuitus dengan fungsi yang identik pada seluruh organisme. Molekul ini juga dapat berubah
sesuai jarak evolusinya, sehingga dapat digunakan sebagai kronometer evolusi yang baik.
1
Molekul 16S rRNA memiliki beberapa daerah yang memiliki urutan basa yang relatif konservatif
dan beberapa daerah urutan basanya variatif. Perbandingan urutan basa yang konservatif
berguna untuk mengkonstruksi pohon filogenetik universal karena mengalami perubahan relatif
lambat dan mencerminkan kronologi evolusi bumi. Sebaliknya, urutan basa yang bersifat variatif
dapat digunakan untuk melacak keragaman dan menempatkan galur-galur dalam satu spesies.
Jika urutan basa 16S rRNA menunjukkan derajat kesamaan yang rendah antara dua taksa,
deskripsi suatu takson baru dapat dilakukan tanpa hibridisasi DNA-DNA (Biasanya jika derajat
kesamaan urutan basa gen penyandi 16S rRNA kurang dari 97% dapat dianggap sebagai
spesies baru. Analisis gen penyandi 16S rRNA praktis untuk definisi spesies, karena molekul ini
bersifat ubikuitus, sehingga dapat dirancang suatu primer yang universal untuk seluruh
kelompok. Penentuan spesies baru pun dapat dilakukan tanpa mengisolasi mikroorganisme
yang bersangkutan. Taksa baru yang ditetapkan hanya berdasarkan data molekular oleh The
International Committee on Systematic Bacteriology diberi status provisional candidatus
(Pangastuti, 2006).
etanol absolut, kemudian campur secara perlahan. Taruh ke dalam pendingin -20C selama 30
menit. Larutan yang ada di dalam tabung disentrifugasi selama 15 menit pada kecepatan
14.000 rpm. Buang semua supernatant. Ke dalam tabung yang berisi pelet, ditambahkan 500 ul
etanol 70% lalu disentrifugasi selama 5 menit pada kecepatana 14.000 rpm. Setelah itu, buang
supernatant secara hati-hati dan keringkan pelet dengan vakum. Pelet adalah DNA genom. Ke
dalam tabung, ditambahkan 10 ul dH2O lalu ditambahkan 1 ul RNase dan di inkubasi pada suhu
37C selama 1 jam hingga semalaman.
mendapatkan DNA yang utuh sehingga ditakutkan apabila divortex DNA keluar akan tetapi
akan terpotong-potong.
Proses tetap dilanjutkan dengan mengekstraksi larutan setalah lisis dengan CI. Setelah
Pada larutan diekstraksi dengan CI dan diambil fase airnya yang terdapat DNA proses
diteruskan dengan ekstraksi dengan penambahan PCI (Phenol-Chloroform-Isoamyl Alcohol)
dengan tujuan untuk memisahkan antara DNA dan komponen lainnya dimana PhenolChloroform berfungsi sebagai pelarut dari senyawa organik dan komponen lipid. Dengan
dilakukannya ekstraksi menggunakan PCI maka setelah disentrifugasi terbentuklah 3 fase
dimana terdiri dari fase air yang ada di paling atas tempat DNA plasmid berada, protein yang
terkoagulasi di fase yang ada di tengah dan fase Phenol-Chloroform yang ada di paling bawah
karena sifat chloroform yang berat jenisnya besar. Proses ekstraksi dilakukan dua kali untuk
pemisahan DNA dengan komponen lainnya menjadi lebih baik.
Fase air yang diambil kemudian diendapkan menggunakan sodium acetat untuk
menciptakan kondisi netral dan alkohol untuk mengikat air yang sebelumnya terikat pada DNA
sehingga DNA mengendap. Penambahan RNase dapat diberikan untuk menghilangkan sisasisa fragmen RNA.
Konsentrasi
171
779.3
256.6
94.3
158.2
110.6
479.9
391.5
259.3
631.2
128.8
187.2
Unit
ng/l
ng/l
ng/l
ng/l
ng/l
ng/l
ng/l
ng/l
ng/l
ng/l
ng/l
ng/l
A260
3.421
15.586
5.131
1.886
3.163
2.213
9.598
7.831
5.185
12.625
2.576
3.744
Dari hasil pengukuran secara spektrofotometri maka diperoleh konsentrasi sampel DNA genom
yang diisolasi adalah 110.6 ng/ul
5
Dari gambar 5 juga dapat diketahui bahwa tidak semua hasil isolasi DNA genom
memiliki pita pada ukuran 1600 pasang basa. Hal ini mengindikasikan bahwa PCR yang
dilakukan tidak berhasil, bisa dikarenakan kurang banyaknya DNA yang terbentuk akibat terlalu
banyak penambahan bobot molekul dari DNA yang akan di PCR sehingga primer dan DNA Taq
Polimerase tidak bekerja secara maksimal maka amplifikasi yang dilakukan tidak maksimal.
SIMPULAN
1. Dari isolasi DNA plasmid, diperoleh DNA plasmid yang kurang murni dan diperoleh
konsentrasi plasmid sebesar 110.6 ng/ul.
2. 16s rRNA digunakan sebagai penanda molekular untuk organism prokariot.
DAFTAR ACUAN
Suharsono dan Widyastuti, U. 2006. Penuntun Praktikum Pelatihan Teknik Pengklonan Gen.
Pusat Penelitian Sumber Daya Hayati dan Bioteknologi, IPB
Pangastuti, A. 2006. Definisi Spesies Prokaryota Berdasarkan Urutan Basa Gen Penyandi 16s
rRNA dan Gen Penyandi Protein. Biodiversitas, Volume 7, Nomor 3 : Halaman: 292-296
Bahan Kuliah dan Praktikum Rekayasa Genetika