Dalam biologi molekuler, pembatasan panjang fragmen polymorphism, atau RFLP (biasanya

diucapkan "rif-bibir"), adalah teknik yang memanfaatkan variasi urutan DNA homolog. Hal ini
mengacu pada perbedaan antara sampel molekul DNA homolog yang berasal dari lokasi situs
enzim restriksi yang berbeda, dan teknik laboratorium terkait dimana segmen ini dapat
digambarkan. Dalam analisis RFLP, sampel DNA rusak menjadi potongan-potongan (dicerna)
oleh enzim restriksi dan fragmen restriksi yang dihasilkan dipisahkan menurut panjang mereka
dengan gel elektroforesis. Meskipun sekarang sebagian besar usang karena munculnya
teknologi murah sekuensing DNA, analisis RFLP adalah teknik profiling DNA pertama cukup
murah untuk melihat aplikasi luas. Analisis RFLP adalah alat penting dalam pemetaan genom,
lokalisasi gen untuk gangguan genetik, penentuan risiko penyakit, dan pengujian paternitas.

Isi [hide]
1 Analisis teknik 1.1 Contoh
2 Aplikasi
3 Alternatif
4 Lihat juga
5 Pranala luar
6 Referensi

Teknik analisis [sunting]

Teknik dasar untuk mendeteksi RFLPs melibatkan memecah-belah sampel DNA oleh enzim
restriksi, yang dapat mengenali dan memotong DNA dimanapun urutan pendek tertentu terjadi,
dalam proses yang dikenal sebagai pembatasan digest. Fragmen DNA yang dihasilkan
kemudian dipisahkan oleh panjang melalui proses yang dikenal sebagai elektroforesis gel
agarosa, dan ditransfer ke membran melalui prosedur Selatan blot. Hibridisasi membran untuk
probe DNA berlabel kemudian menentukan panjang fragmen yang melengkapi probe. Sebuah
RFLP terjadi ketika panjang fragmen terdeteksi bervariasi antara individu. Setiap panjang
fragmen dianggap sebagai alel, dan dapat digunakan dalam analisis genetik.
Analisis RFLP dapat dibagi menjadi single (SLP) dan penyelidikan multi-lokus (MLP)
paradigma. Biasanya, metode SLP lebih disukai daripada MLP karena lebih sensitif, lebih
mudah untuk menafsirkan dan mampu menganalisis sampel campuran DNA. [Rujukan?] Selain
itu, data dapat dihasilkan bahkan ketika DNA terdegradasi (misalnya ketika ditemukan dalam
tulang tetap.)

Skema untuk RFLP dengan hilangnya tempat pembelahan.

Analisis dan warisan dari fragmen RFLP alel (NIH).

Skema untuk RFLP dengan variasi panjang VNTR.

Contoh [sunting]
Ada dua mekanisme umum yang digunakan ukuran fragmen restriksi tertentu dapat bervariasi.
Dalam skema pertama, segmen kecil dari genom yang terdeteksi oleh pemeriksaan DNA (garis
tebal). Dalam alel "A", genom dibelah oleh enzim restriksi pada tiga lokasi terdekat (segitiga),
tetapi hanya fragmen paling kanan akan terdeteksi oleh probe. Dalam alel "a", situs
pembatasan 2 telah hilang oleh mutasi, sehingga probe sekarang mendeteksi menyatu fragmen
yang lebih besar berjalan dari situs 1 sampai 3. Diagram kedua menunjukkan bagaimana
variasi ukuran fragmen ini akan terlihat pada blot Southern, dan bagaimana masing-masing alel
(dua per individu) mungkin diwariskan pada anggota keluarga.
Dalam skema ketiga, probe dan pembatasan enzim yang dipilih untuk mendeteksi daerah
genom yang mencakup VNTR segmen variabel (kotak). Dalam alel "c" ada lima mengulangi di
VNTR, dan probe mendeteksi fragmen yang lebih panjang antara dua lokasi pembatasan.
Dalam alel "d" hanya ada dua mengulangi di VNTR, sehingga probe mendeteksi fragmen
pendek antara dua situs restriksi yang sama. Proses genetik lainnya, seperti sisipan,
penghapusan, translokasi, dan inversi, juga dapat menyebabkan RFLPs. RFLP menggunakan
sampel jauh lebih besar dari DNA dari STR.
Aplikasi [sunting]
Analisis variasi RFLP dalam genom adalah alat vital dalam pemetaan genom dan analisis
penyakit genetik. Jika peneliti mencoba untuk awalnya menentukan lokasi kromosom gen
penyakit tertentu, mereka akan menganalisis DNA dari anggota keluarga yang menderita
penyakit ini, dan mencari alel RFLP yang menunjukkan pola yang sama dari warisan seperti
yang penyakit (lihat Pautan genetik). Setelah gen penyakit yang terlokalisasi, analisis RFLP
keluarga lain bisa mengungkapkan siapa yang berisiko untuk penyakit ini, atau yang mungkin
menjadi pembawa gen mutan.
Analisis RFLP juga dasar untuk metode awal sidik jari genetik, berguna dalam identifikasi
sampel diambil dari TKP, dalam penentuan ayah, dan karakterisasi keragaman genetik atau
pola peternakan di populasi hewan.
Alternatif [sunting]

Teknik analisis RFLP, bagaimanapun, lambat dan rumit. Hal ini membutuhkan sejumlah besar
DNA sampel, dan proses gabungan probe pelabelan, fragmentasi DNA, elektroforesis,
menutupi, hibridisasi, mencuci, dan autoradiografi bisa memakan waktu hingga satu bulan
untuk menyelesaikan. Sebuah versi terbatas metode RFLP yang digunakan probe
oligonukleotida dilaporkan pada tahun 1985. [1] Untungnya, hasil Proyek Genom Manusia telah
banyak menggantikan kebutuhan untuk pemetaan RFLP, dan identifikasi berbagai polimorfisme
nukleotida tunggal (SNP) di bahwa proyek (serta identifikasi langsung banyak gen penyakit dan
mutasi) telah menggantikan kebutuhan untuk analisis linkage penyakit RFLP (lihat SNP
genotipe). Analisis VNTR alel terus, tapi sekarang biasanya dilakukan oleh polymerase chain
reaction (PCR) metode. Sebagai contoh, protokol standar untuk sidik jari DNA melibatkan
analisis PCR panel lebih dari selusin VNTRs.
RFLP masih teknik yang digunakan dalam pemilihan penanda dibantu. Terminal polimorfisme
panjang fragmen restriksi (TRFLP atau kadang-kadang T-RFLP) adalah teknik biologi molekuler
pada awalnya dikembangkan untuk mengkarakterisasi komunitas bakteri dalam sampel
campuran spesies. Teknik ini juga telah diterapkan untuk kelompok lain termasuk jamur tanah.
TRFLP bekerja dengan PCR amplifikasi DNA menggunakan pasangan primer yang telah diberi
label dengan tag neon. PCR produk yang kemudian dicerna menggunakan enzim RFLP dan
pola yang dihasilkan divisualisasikan menggunakan sequencer DNA. Hasilnya dianalisis baik
dengan menghitung dan membandingkan band atau puncak dalam profil TRFLP, atau dengan
cara mencocokkan band dari satu atau lebih TRFLP berjalan ke database spesies yang dikenal.
Teknik ini mirip dalam beberapa aspek untuk DGGE atau TGGE.
Urutan perubahan terlibat langsung dengan RFLP juga dapat dianalisis lebih cepat dengan
PCR. Amplifikasi dapat diarahkan di situs pembatasan berubah, dan produk dicerna dengan
enzim restriksi. Metode ini telah disebut Cleaved Amplified Polymorphic urutan (CAPS). Atau,
segmen diperkuat dapat dianalisis oleh alel oligonukleotida spesifik (ASO) probe, sebuah
proses yang sering dilakukan oleh seorang Dot blot sederhana.