Bahan:

1. AmpliLute Liquid Media Extraction Kit:

buffer ATL (tissue lysis buffer)
buffer AL (lysis buffer)
buffer AW2 (wash buffer 2)
buffer AVE (elution buffer)
CAR (carrier RNA)
PK (Proteinase K)
2. Linear Array HPV Kit:
PCR Master mix
Magnesium Solution
HPV positive control
HPV negative control
3. Linear Array Detection Kit:
Denaturation solution
SDS concentrate
SSPE concentrate
SA-HRP conjugate
citrate concentrate
substrate A
substrate B.
4. Hybridization dan Detection:
working hybridization buffer
working stringent wash buffer
working ambient wash buffer
working citrate buffer
working conjugate
working substrate.

Prosedur ekstraksi DNA

1. Ambil sampel DNA dari wadah spesimen dengan menggunakan pipet sekali pakai steril
sebanyak 500-1500 L, kemudian masukkan ke dalam tabung sentrifugasi ukuran 1,5 ml.

2. Tabung berisi sampel DNA tersebut disentrifugasi dengan kecepatan 13.200 rpm selama
5 menit. Pasca sentrifugasi akan terpisah antara medium cair (supernatant) dengan
endapan sel.
3. Tambahkan 200 L reagent A ke dalam sampel DNA, campurkan dengan bantuan vortex.
4. Dingikan sampel DNA pada suhu kamar, kemudian tambahkan 200 L reagent B.
Campurkan dengan bantuan vortex.
5. Tambahkan 400 L reagent C. Campurkan dengan membolak-balik tabung sentrifugasi,
kemudian diamkan selama 1 menit.
6. Lakukan sentrifugasi dengan kecepatan 13.200 rpm selama 5 menit. Buang medium cair
(supernatant) dengan menggunakan pipet.
7. Diamkan selama 15 menit atau hingga tidak terdapat sisa percikan cairan pada tabung
sampel DNA.
8. Tambahkan 30 akua destilata. Sampel DNA siap digunakan pada proses selanjutnya atau
disimpan dalam suhu 20C sebelum digunakan.

Prosedur amplifikasi menggunakan PCR : (Anic GM et al, 2011)

1. Keluarkan campuran primer 21 tipe HPV (PCR mix) pada suhu ruangan.
2. Siapkan campuran amplifikasi PCR ke dalam tabung PCR sebagai berikut :

PCR mix

22,25 L

DNA polymerase

0,25 L

Sampel DNA

2,5 L

3. Masukkan tabung ke dalam mesin amplifikasi PCR dengan siklus sebagai berikut :
Temperatur (C)
95
94
55
72
72
16

Durasi
Jumlah Siklus
15 menit
1
15 detik
40
30 detik
40
1 menit
40
5 menit
1
Inkubasi sebelum tahap selanjutnya

Prosedur hibridisasi dot blot :

1. Siapkan sumur hibridisasi dan membran hibridisasi dot blot.
2. Nyalakan mesin hibridisasi dan atur suhu 45C.
3. Membran tidak boleh disentuh dengan tangan. Penempatan membran ke dalam sumur
menggunakan bantuan pinset.
4. Sumur hibridisasi yang tidak digunakan ditutup dengan para film.
5. Sampel DNA yang telah diamplifikasi dengan PCR dipanaskan pada suhu 95C selama 5
menit untuk mendenaturasi DNA dari rantai ganda menjadi rantai tunggal.
6. Tambahkan reagent hibridisasi ke sampel DNA, kemudian masukkan ke dalam sumur
hibridisasi. Diamkan selama 2 menit.
7. Tutup dan jalankan proses hibridisasi dot blot pada suhu 45C selama 15 menit.
8. Bilas membran dengan 800 L reagent pasca hibridisasi dot blot sebanyak 2 kali.

9. Ubah suhu mesin hibridisasi menjadi 25C.

10. Tambahkan 500 L blocking reagent dan diamkan selama 5 menit.
11. Tambahkan 500 L enzim konjugasi dan diamkan selama 3 menit.
12. Keluarkan seluruh cairan dalam sumur hibridisasi menggunakan pipet.
13. Ubah temperatur sumur hibridisasi menjadi 36C.
14. Bilas membran 800 L reagent 1 sebanyak 3 kali.
15. Bilas membran dengan 3 mL akua destilata.
16. Angkat membran dan keringkan.
17. Interpretasi hasil.