Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), coccus, spirilum.

Bakteri yang
berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa macam. Pada bentuk basil
pembagiannya yaitu basil tunggal, diplobasil, dan tripobasil.Sedangkan pada coccus dibagi
menjadi monococcus, diplococcus, sampai stophylococcus. Khusus pada spirilum hanya dibagi
dua yaitu setengah melengkung dan melengkung (Dwidjoseputro.1998).
Melihat dan mengamati bakteri dalam kedaan hidup sangat sulit, karena selain bakteri itu
tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal tersebut maka
dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling
utama
dalam
penelitian-penelitian
mikrobiologi
(Dwidjoseputro.1998).

Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen seluler dari
bakteri dengan senyawa aktif dari pewarnaan yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena
adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarnaan. Berdasarkan adanya
muatan ini maka dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna basa.
Teknik Pewarnaan bukan pekerjaan yang sulit tapi perlu ketelitian dan kecermatan
bekerja serta mengikuti aturan dasar yang berlaku (Lay.1994)
Oleh karena itu yang melatar belakangi praktek ini yaitu untuk mengetahui teknik
pewarnaan mikroorganisme sehingga mempermudah dalam melihat bagian-bagian bakteri.
1.2 Tujuan
Untuk mengetahui faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri
Untuk mengetahui perbedaan gram positif dan gram negatif
Untuk mengetahui jenis-jenis pewarnaan bakteri
Untuk mengetahui larutan pewarna yang digunakan pada percobaan pewarnaan

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA
Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang
khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan
air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel
bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan.
Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding
sel bakteri melalui serangkaian pengecatan
Mikroorganisme sulit dilihat dengan mikroskop cahaya, karena tidak mengadsorpsi
ataupun membiaskan cahaya. Alasan inilah yang menyebabkan zat warna digunakan untuk
mewarnai mikroorganisme ataupun latar belakangnya. Zat warna mengadsorpsi dan membiaskan
cahaya sehingga kontras mikroorganisme disekelilingya ditingkatkan. Penggunaan zat warna
memungkinkan pengamatan struktur sel seperti spora dan bahan infeksi yang mengandung zat
pati dan granula fosfat. Pewarnaan yang digunakan untuk melihat salah satu struktur sel disebut
pewarnaan khusus. Sedangkan pewarnaan yang digunakan untuk memilahkan mikroorganisme
disebut pewarnaan diferensial yang memilahkan bakteri menjadi kelompok gram positif dan
gram negatif. Pewarnaan diferensial lainnya ialah pewarnaan ziehl neelsen yang memilihkan
bakterinya menjadi kelompok-kelompok tahan asam dan tidak tahan asam
(Dwidjoseputro.1998).
Pengenalan bentuk mikroba (morfologi), kecuali mikroalgae harus dilakukan pewarnaan
terlebih dahulu agar dapat diamati dengan jelas (Hadiutomo. 1990). Pada umumnya bakteri
bersifat tembus cahaya, hal ini disebabkan karena banyak bakteri yang tidak mempunyai zat
warna (Waluyo, 2004). Tujuan dari pewarnaan adalah untuk mempermudah pengamatan bentuk
sel bakteri, memperluas ukuran jazad, mengamati struktur dalam dan luar sel bakteri, dan melihat
reaksi jazad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat fisik atau kimia jazad dapat
diketahui (Hadiutomo. 1990).
Metode pengecatan pertama kali ditemukan oleh Christian Gram pada tahun 1884. Dengan
metode ini. Bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua yatu, bakteri gram positif dan bakteri
gram negative. Yang didasarkan dari reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau
sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya sehingga pengecatan gram tidak
bias dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma
sp (Waluyo, 2004).
Berhasil tidaknya suatu pewarnaan sangat ditentukan oleh waktu pemberian warna dan
umur biakan yang diwarnai (umur biakan yang baik adalah 24 jam). Umumnya zat warna yang
digunakan adalah garam-garam yang dibangun oleh ion-ion yang bermuatan positif dan negatif
dimana salah satu ion tersebut berwarna. Zat warna dikelompokkan menjadi dua, yaitu zat
pewarna yang bersifat asam dan basa. Jika ion yang mengandung warna adalah ion positif maka

zat warna tersebut disebut pewarna basa. Dan bila ion yang mengandung warna adalah ion
negatif maka zat warna tersebut disebut pewarna negatif (Hadiutomo. 1990).
Zat warna yang digunakan dalam pewarnaan bersifat basa dan asam. Pada zat warna basa
bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut disebut kromofor dan memiliki muatan
positif. Sebaliknya, pada zat warna asam bagian yang berperan memberikan zat warna
mempunyai muatan negatif zat warna basa lebih banyak digunakan karena muatan negatif
banyak ditemukan didinding sel, membran sel dan sitoplasmasewaktu proses pewarnaan muatan
positif pada zat warna basa akan berkaitan dengan muatan negatif dalam sel, sehingga
mikroorganisme lebih jelas terlihat (Dwidjoseputro.1998).
Zat warna asam yang bermuatan negatif lazimnya tidak digunakan untuk mewarnai
mikroorganisme, namun biasanya dimanfaatkan untuk mewarnai mikroorganisme, namun
biasanya dimanfaatkan untuk mewarnai latar belakang sediaan pewarnaan. Zat warna asam yang
bermuatan negatif ini tidak dapat berkaitan dengan muatan negatif yang terdapat pada struktur
sel. Kadangkala zat warna negatif digunakan untuk mewarnai bagian sel yang bermuatan positif,
perlu diperhatikan bahwa muatan dan daya ikat zat warna terhadap struktur sel dapat berubah
bergantung pada pH sekitarnya sewaktu proses pewarnaan (Dwidjoseputro.1998).
Prosedur pewarnaan yang menghasilkan pewarnaan mikroorganisme disebut pewarnaan
positif dalam prosedur pewarnaan ini dapat digunakan zat warna basa yang yang bermuatan
positif maupun zat warna asam yang bermuatan negatif. Sebaliknya pada pewarnaan negatif latar
belakang disekeliling mikroorganisme diwarnai untuk meningkatkan kontras dengan
mikroorganisme yang tak berwarna. Pewarnaan mencakup penyiapan mikroorganisme dengan
melakukan preparat ulas (Dwidjoseputro.1998)
Sebelum dilakukan pewarnaan dibuat ulasan bakteri di atas kaca objek. Ulasan ini
kemudian difiksasi. Jumlah bakteri yang terdapat pada ulasan haruslah cukup banyak sehingga
dapat terlihat bentuk dan penataanya sewaktu diamati. Kesalahan yang sering kali dibuat adalah
menggunakan suspensi bakteri yang terlalu padat terutama bila suspensi tersebut berasal adari
bukan media padat. Sebaliknya pada suatu suspensi bakteri bila terlalu encer, maka akan
diperoleh kesulitan sewaktu mencari bakteri pada preparatnya (Sutedjo.1991).
Untuk pewarnaan yang mengamati morfologi sel mikroorganisme maka seringkali setelah
pembuatan preparat ulas dilakukan fiksasi diikuti oleh pewarnaan. Fiksasi dapat dilakukan
dengan cara melewatkan preparat diatas api atau merendamnya dengan metanol. Fiksasi
digunakan untuk :
1. Mengamati bakteri oleh karena sel bakteri lebih jelas terlihat setelah diwarnai
2. Melekatkan bakteri pada glass objek
3. Mematikan bakteri
Pada pewarnaan sederhana hanya digunakan satu macam zat warna untuk meningkatkan
kontras antara mikroorganisme dan sekelilingnya. Lazim, prosedur pewarnaan ini menggunakan

zat warna basa seperti seperti crystal violet, biru metilen, karbol fuchsin basa, safranin atau hijau
malakit. Kadang kala digunakan zat warna negatif untuk pewarnaan sederhana : zat warna asam
yang sering digunakan adalah nigrosin dan merah kongo (Lay.1994).
Prosedur Pewarnaan sederhana mudah dan cepat, sehingga pewarnaan ini sering
digunakan untuk melihat bentuk ukuran dan penataan pada mikoorganisme bakteri pada bakteri
dikenal bentu yang bulat (coccus), batang (basil), dan spiral. Dengan pewarnaan sederhana dapat
juga terlihat penataan bakteri. Pada coccus dapat terlihat pewarnaan seperti rantai (stertococcus),
buah anggur ( stafilococcus), pasangan (diplococcus), bentuk kubus yang terdiri dari 4 atau 8
(saranae) (Lay.1994).
Beberapa mikroba sulit diwarnai dengan zat warna yang bersifat basa, tetapi mudah
dilihat dengan pewarnaan negatif, pada metode ini mikroba dicampur dengan tinta cina atau
nigrosin, kemudian digesekkan diatas kaca objek.Zat warna tidak akan mewarnai bakteri, akan
tetapi mewarnai lingkungan sekitar bakteri. Dengan mikroskop mikroba akan terlihat tidak
berwarna dengan latar belakang hitam (Lay.1994).
Metode pengecatan pertama kali ditemukan oleh seorang ahli bioteknologi dari Denmark
yang bernama Christian Gram pada tahun 1884. Menemukan metode pewarnaan secara tidak
sengaja. Dengan metode ini. Bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua yatu, bakteri gram positif
dan bakteri gram negative. Yang didasarkan dari reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut.
Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya sehingga pengecatan
gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel
seperti Mycoplasma sp. Pewarnaan gram merupakan pewarnaan diferensial yang sangat berguna
dan paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi. Pewarnaan itu merupakan tahap
penting dalam pencirian dan identifikasi bakteri (Lay,1994)
Pewarnaan gram memberikan hasil yang baik, bila digunakan biakan segar yang berumur
24-48 jam. Bila digunakan biakan tua, terdapat kemungkinan penyimpanan hasil pewarnaan
gram. Pada biakan tua, banyak sel mengalami kerusakan pada dinding-dinding selnya.
Kerusakan pada dinding sel ini menyebabkan zat warna dapat keluar sewaktu dicuci dengan
lartan pemucat. Ini berarti bahwa bakteri gram positif dengan dinding sel yang rusak tidak lagi
dapat memertahankan crystal violet sehingga terlihat sebagai bakteri gram negatif (Lay,1994)
Cirri-ciri gram negative:
Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10-45mm, berlapis tiga atau multi layer
Dinding slnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapat dalam lapisan
kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit 10% dari berat kering, tidak mengandung asam
laktat.
Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.
Tidak resisten terhadap gangguan fisik
Ciri-ciri bakteri gram positif:

Struktur dindingnya tebal

Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal
Bersifat lebih rentan terhadap senyawa penisilin
Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu Kristal
Komposisi yang dibutuhkan lebih rumit
Lebih resisten terhadap gangguan fisik.
Pengecatan gram dilakukan dalam 4 tahap. Yaitu
a. Pemberian cat warna utama (cairan Kristal violet) berwarna ungu
b. Pengintensifan cat warna dengan penambahan larutan mordan
c. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alcohol asam
d. Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin
Banyak seenyawa organic berwarna (zat warna) digunakan untuk mewarnai
mikroorganisme untuk pemeriksaan mikroskopis dan telah dikembangkan prosedur pewarnaan
gram untuk :
Mengamati dengan baik morfologi mikroorganisme secara kasar
Mengidentifikasi bagian-bagian structural sel mikroorganisme
Membantu mengidentifikasi atau membedakan organisme yang serupa

BAB III
METODOLOGI PERCOBAAN
3.1.Waktu dan Tempat
Praktikum mikrobiologi mengenai pewarnaan dan cara-cara pewarnaan yang
dilaksanakan hari Rabu, 6 April 2011 pukul 10.00-12.00 WITA. Bertempat di Laboratorium
Mikrobiologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Mulawarman
Samarinda.
3.2. Alat dan Bahan
3.2.1. Alat-alat
Mikroskop
Jarum ose
Cawan petri
Bunsen
Kapas
Pipet tetes
Botol
Beaker gelas
Gelas piala
Cover glass
Kertas saring
Pinset
Objek glass
Gunting
3.2.2. Bahan-bahan
Alkohol 95%
Aquades
Carbol Fuchsin
Crystal Violet
Nigrosin
Tinta cina
Malachite green
Lugols iodida
Safranin
Tisu
Alkohol 70%

Biakan murni bakteri