Tidak kurang penting dibanding proses hulu rekayasa genetik, teknik fermentasi
Yang diolah produk dari proses terdahulu
Protein produk dari rekayasa genetika
Yang paling banyak isolasi / purifikasi protein dari tumbuhan, hewan, mikroorganisme
Teknik isolasi / purifikasi dapat dalam
skala laboratorium skala industri
Sebelum melakukan isolasi penting
diperhatikan sumber produk yang akan
diisolasi Hewan Tumbuhan Mikroorganisme
< tahun 1970 an digunakan sumber dari
hewan - tripsin, lipase, rennin - mahal, sumber terbatas tumbuhan - papain, bromelain, amilase, lipoksigenase - dipengaruhi cuaca, politik Sumber dari mikroorganisme banyak digunakan setelah perkembangan teknologi fermentasi - relatif lebih murah
ISOLASI Metode isolasi tergantung Sumber produk Skala produksi (lab / industri) Stabilitas produk Bentuk murni / tidak murni
oses isolasi dimulai dengan mengetahui letak / loka
roduk yang akan disolasi Intrasel Ekstrasel Terikat membran
Protein larut intrasel dari tumbuhan
teknik isolasi tidak rumit karena jaringa lunak, mudah dihancurkan dengan tissu homogenizer
Protein intrasel dari mikroorganisme
lebih liat perlu metode lebih kuat
Protein terikat membran masalah
tersendiri tidak tergantung sumber
Metode penghancuran (lisis) sel
1. Abrasif - dengan blender laboratorium dengan butiran gela (glass beads)
2. Liquid shear - suspensi sel dilewatkan dengan tekanan tinggi me lubang kecil ke dalam ruang dengan tekanan atmo - karena perbedaan tekanan mendadak sel pecah - untuk dinding sel bakteri yang tidak terlalu keras misal bakteri Gram negatif
3. Osmotic shock - sel disuspensikan di dalam akuades / larutan hipot sehingga sel lisis - protein dilepaskan dari sel yang lisis - tidak efektif untuk sel bakteri dan tumbuhan
4. Penambahan alkali - metode paling sederhana untuk melisis sel - sebagian besar sel pecah pada pH 11,5 12,5 - protein yang diisolasi harus stabil selama 20 30 m pada pH tinggi tsb
5. Penambahan deterjen. - selain lisis sel, sebagian besar protein sel mengala denaturasi - untuk isolasi protein terikat membran
6. Solid shear - dengan membekukan sel - 20oC, dipaksa melalui lubang kecil pada tekanan tinggi 7. Penambahan lisozim dan EDTA - cocok untuk skala kecil karena mahal - efektif untuk sel bakteri 8. Pelarut organik - toluen dan aseton untuk melisis berbagai sel - tidak untuk skala besar toksik, mahal, mudah terbakar 9. Sonikasi - lisis sel dengan getaran ultrasonik - untuk skala kecil
PURIFIKASI (PROTEIN)
ada waktu lisis sel seluruh isi sel keluar
banyak kontaminan oleh karena itu harus
disingkirkan, antara lain asam nukleat
sam nukleat meyebabkan viskositas nggi pada tahap awal harus disingkirkan Presipitasi penambahan polikation BM (protamin, streptomisin, polietileneimin) ma Digesti dengan nuklease mudah, murah
etelah asam nukleat disingkirkan sisa s
yang tidak larut (dinding sel, protein membran, bagian sel yang hancur) harus
isingkirkan dengan Sentrifugasi sangat baik untuk solid yang bersifat licin (slimmy or gelatinous solids) Filtrasi
Sentrifugasi Kecepatan mulai 100 x g sampai 600.00 xg Dapat memisahkan organel sel berdasarkan massa dan densitasnya - 3000 g = sel dan nukleus - 12.000 g = mitokondria / kloroplas - 100.000 g = mikrosom, ribosom
enyingkiran asam nukleat + debris sel (=
resipitat, pelet) - menghasilkan supernat
ang mengandung - protein yang diinginkan kontaminan (protein yang tidak diingink molekul organik dan inorganik)
Penyingkiran kontaminan presipitasi dengan
Amonium sulfat dengan berbagai konsentrasi
- protein yang tidak diinginkan diendapkan terlebih dahulu, baru protein yang diinginkan diendapkan dengan konsentrasi yang lebih tinggi - paling banyak digunakan - pada skala besar masalah penanganan dan pembuangan korosif
Natrium sulfat - tidak bersifat korosif - kelarutan rendah, perlu suhu > 35 oC untuk fraksin
Pelarut organik - skala lab, jarang skala industri karena muda terbakar
Polimer - polietilen glikol (PEG) - tidak toksik - tidak mudah terbakar - penggunaan terbatas karena meningkatka viskositas larutan - polyacrylic acid - non toksik
Presipitasi pada titik isoelektrik (pI)
Lisis sel
sentrifugasi supernatan
presipitat
kontaminan supernatan
Am. sulfat presipitat
Am. sulfat supernatan
presipitat
Fraksinasi
emisahan selanjutnya (fraksinasi) melibatka
komponen 1.
Fasa solid / stasioner
- berupa film, kolom, gel atau membran 2. Pelarut - fasa mobil pada kromatografi 3. Solut - molekul yang harus dipisahkan
Teknik
Dasar pemisahan
Fasa solid
Dialisis
Uk / btk molekul
Mbr semipermabel Air
Filtrasi gel
Uk / btk molekul
Gel
Bufer
Krom. Adsorpsi
Adsorpsi
Adsorben
Nonpolar
Krom. Partisi
Solubilitas
Innert support
Ionisasi listrik Muatan
Innert support Mtrks + ggs terionisasi Matriks + ligan berpori Innert support
Pelarut
Polar nonpolar
Krom. Afinitas Elektr Aset Krom. sel. Pertkr ion
PAGE
Interaksilistr ligan Muatan + uk mol
Bufer Bufer
Bufer Bufer
ada dasarnya pemisahan molekul protein dapat berdasarkan
Sifat Muatan
Polaritas
Ukuran molekul
Prosedur - kromatografi pertukaran ion - elektroforesis - kromatografi adsorpsi - kromatografi kertas - dialisis dan ultrafiltrasi - gel elektroforesis - kromatografi gel filtrasi - ultrasentrifugasi - kromatografi afinitas
Dialisis
Untuk memisahkan protein (molekul besar) dari garam
(molekul kecil) dan kontaminan berukuran kecil
Protein dimasukkan ke dalam kantong selofan yang berpor
kecil
Kantong dimasukkan ke dalam wadah yang mengandung
akuades / bufer, sambil di putar dengan pemutar magnetik semalaman dengan penggantian akuades / bufer beberapa kali dalam wadah Pori memungkinkan molekul kecil berdifusi keluar, molekul besar tertahan di dalam kantong
Dapat untuk memekatkan larutan dengan meletakkan
kantong dialisis dalam polimer desikan , misal polietilen glik
Dialisisis
Kantong selofan berisi larutan yang akan dimurnikan
yang akan dipisahkan diteteskan pada sepotong ker dibiarkan kering
Ujung kertas dicelupkan ke dalam pelarut yang ter
dari campuran pelarut polar dan nonpolar
Komponen polar akan terikat pada kertas memben
fasa stasioner, sedangkan komponen nonpolar berg membentuk fasa mobil
Berbagai komponen dalam larutan akan terpisahka
berdasarkan perbedaan kelarutan dalam fasa stasio atau fasa mobil koefisien partisi
Setelah bergerak dalam jarak tertentu
kromatogram diangkat dan dikeringkan Dideteksi dengan - radioaktif sinar UV - pewarnaan dengan zat warna
Kecepatan migrasi Rf (rate of fractionatio
perbandingan jarak yang ditempuh solut dengan jarak yang ditempuh solven
Kromatografi kertas - dua dimensi
Kromatografi kolom
Fasa stasioner kolom butiran kecil selulosa / akrila
/ silika
Fasa stasioner berinteraksi dengan protein berdasa
- muatan - interaksi hidrofobik - interaksi ligan Campuran protein dimasukkan ke dalam kolom, kemudian di luruhkan dengan fasa mobil (eluen)
Fasa mobil yang keluar (eluat) ditampung dalam fra
fraksi dengan volume tertentu
Matriks yang digunakan
Cross-linked dextran (Sephadex)
Agarosa (Sepharose, Biogel)
Cross-linked agarosa (Sepharose CL)
Poliakrilamid (Biogel P)
Porous glass (Bio-glass)
Kromatografi kolom
Kromatografi kolom
Kromatografi Partisi Pemisahan dengan kromatografi kolom berdasarkan afinitas relatif berbagai protein terhadap fasa mobil dan fasa stasioner Protein yang lebih kuat berinteraksi dengan matriks akan tertahan Lamanya waktu protein berinteraksi dengan matriks tergantung dari komposisi fasa stasioner dan fasa mobil
Pemisahan protein optimal diperoleh dengan
manipulasi komposisi fasa stasioner dan mobil
omatografi Berdasarkan Ukuran Molekul
trasi Gel, Size Exclusion Chromatography)
Pemisahan protein berdasarkan perbedaan ukuran
molekul dan melewatkannya melalui kolom gel yan telah mengembang
Yang paling banyak dipakai Sephadex partikel k
hidrofilik, tidak larut karena cross-linking dekstran membentuk jaringan 3 dimensi
Molekul >> keluar lebih dahulu, molekul << tertah
karena masuk ke dalam butiran gel = Molecular sieving
Dapat memperkirakan BM suatu sampel
Size exclusion chromatography
Size exclusion chromatography
Size exclusion chromatography
Kromatografi adsorpsi
Teknik kromatografi paling tua I x digunakan oleh
Tswett untuk memisahkan pigmen tumbuhan
Senyawa diadsorpsi ke dalam kolom terjadi
keseimbangan antara molekul yang terikat pada ma dengan yang terdapat di dalam pelarut
Derajat pengikatan ditentukan oleh muatan, ikatan
der Waals, interaksi ionik, ikatan hidrogen, struktur senyawa yang dipisahkan
Adsorben alumina, kieselguhr, sukrosa, silika gel
Eluen kloroform, heksan, etil eter, campuran pela
organik
Kromatografi pertukaran ion
>> digunakan untuk purifikasi protein, molekul kec
Matriks bahan inert dengan gugus terionisasi D
selulosa, CM selulosa
Atom N dari DEAE pada pH < 9 mengikat moleku
bermuatan negatif disebut penukar anion (anion exchanger) CM selulosa penukar kation (cathion exchanger) Peluruhan protein berdasarkan muatan atau konsentrasi garam dalam bufer
Penting diperhatikan resin yang dipakai, pH, ioni
strength larutan bufer
Kromatografi afinitas
Ligan terikat secara kovalen pada matriks porous
inert Ligan - spesifik substrat, analog, inhibitor - umum AMP, hidrokarbon, zat warna Dalam skala besar jarang digunakan mahal, keterbatasan kapasitas, tidak stabil
Resolusi tinggi, proses purifikasi berlangsung cepa
Kromatografi afinitas
Kromatografi afinitas
Kromatografi lapis tipis
Pemisahan senyawa pada lempeng tipis
Dasar adsorpsi, pertukaran ion, partisi, filtrasi gel Berlangsung cepat Dapat memisahkan beberapa pemisahan sekaligus Bercak yang timbul diwarnai dengan pewarnaan tertentu diukur kadarnya secara spektrofotometri
Kromatografi Lapis Tipis
Kromatografi Lapis Tipis
PLC (High Performance Liquid Chromatography)
Separasi berdasarkan adsorpsi, pertukaran ion at
filtrasi
Sampel diuapkan dan dimasukkan ke dalam kolom
dengan tekanan tinggi (sp 5000 psi) Eluat dideteksi dengan mengukur serapan pada gelombang UV
Resolusi tinggi, cepat, sensitivitas >> - dapat meng
sampai ng
Sering digunakan untuk steroid, vitamin
Prinsip HPLC
Elektroforesis Merupakan teknik pemisahan protein yang paling sering digunakan di lab Berdasarkan pergerakan molekul bermuatan dalam medan listrik Pada pH > pI, protein bermuatan negatif bergerak ke anoda; pada pH < pI, protein bermuatan positif bergerak ke katoda; pada pH = pI, protein tidak bergerak Matriks yang digunakan membran selulosa asetat, starch gel, akrilamid, agarosa
Elektroforesis
SDS-PAGE (Polyacrylamide Gel
Electrophoresis)
SDS = Sodium dodecyl sulphate
Akrilamid berpolimerisasi dan cross-linked membentuk matriks yang porous SDS membuat protein bermuatan negatif, sehingga pemisahan terjadi berdasarkan kecepatan bergerak dalam medan listrik yang dipengaruhi oleh besar molekul Molekul besar lebih tertahan pergerakannya dibanding molekul kecil Protein yang terpisah divisualisasi dengan zat warna Coomassie blue
Pada tiap tahap purifikasi harus dilakukan
Pengukuran volume sampel Penetapan kadar protein Mulai dari tahap awal sampai tahap akhir penetapan untuk mengetahui seberapa jauh terjadi pemurnian produk
Bila pada elektroforesis diperoleh 1 puncak
setelah melalui berbagai tahap purifikasi presipitasi, krom pertukaran ion, filtrasi gel, krom afinitas dapat dikatakan protein telah murni
Bila mungkin protein murni disimpan dalam
bentuk kristal
ENTIFIKASI & PENGHITUNGAN KADAR PROTEIN
LAM BAHAN UJI PADA TAHAP PURIFIKASI
- serapan pada 280 nm (sinar UV) ecara spektrofotometri - serapan protein setelah diwarnai dengan pewarna bereaksi dengan asam amino / protein - ninhidrin ( biru ) kromatografi lapis tipis - biuret (lembayung) - Bradford (biru)
ibandingkan terhadap serapan larutan standar yang - fluoresamin diketahui kadarnya
ntuk enzim dihitung aktivitas dan
aktivitas spesifik pada setiap tahap purifikasi
Aktivitas (Unit) enzim = jumlah protein
yang dapat mengubah 1 mol substrat menjadi produk per menit pada suhu 25 C pada pH optimum
Aktivitas Spesifik = Unit per mg protein
Homogenat
Vol, kdr protein, Akt, AS
Am. sulfat
presipitat
Fraksinasi Krom. Pert. Ion
Gel filtrasi
Elektroforesis Krom. Afinitas
1 pita
Volume, kadar protein,
Akt, AS
supernatan
Vol, kdr protein, Akt, AS pilih fraksi dengan AS paling
Vol, kdr protein, Akt, AS pilih fraksi dengan AS paling
Vol, kdr protein, Akt, AS pilih fraksi dengan AS paling
Enzim murni
Contoh purifikasi enzim X
Contoh Tabel Purifikasi Enzim X
Tahap
Vol fraksi (mL)
Prot total (mg)
Aktivitas (U)
Akt Spesifik (U/mg prot)
1.400
10.000
100.000
10
Presipitat
280
3.000
96.000
32
Krom Pert Ion
90
400
80.000
200
Filtrasi gel
80
100
60.000
600
45.000
15.000
Homogenat
Krom Afinitas
Dokumen Serupa dengan Prinsip Dan Teknik Isolasi Protein
