Anda di halaman 1dari 53

Prinsip dan Teknik Isolasi dan

Purifikasi Protein

Teknik isolasi dan purifikasi

Merupakan proses hilir dalam bioteknologi


Tidak kurang penting dibanding proses hulu
rekayasa genetik, teknik fermentasi

Yang diolah produk dari proses terdahulu

Protein produk dari rekayasa genetika


Yang paling banyak isolasi / purifikasi protein
dari tumbuhan, hewan, mikroorganisme

Teknik isolasi / purifikasi dapat dalam


skala laboratorium
skala industri

Sebelum melakukan isolasi penting


diperhatikan sumber produk yang akan

diisolasi
Hewan
Tumbuhan
Mikroorganisme

< tahun 1970 an digunakan sumber dari


hewan
- tripsin, lipase, rennin
- mahal, sumber terbatas
tumbuhan
- papain, bromelain, amilase, lipoksigenase
- dipengaruhi cuaca, politik
Sumber dari mikroorganisme
banyak digunakan setelah perkembangan
teknologi fermentasi
- relatif lebih murah

ISOLASI
Metode isolasi tergantung
Sumber produk
Skala produksi (lab / industri)
Stabilitas produk
Bentuk murni / tidak murni

oses isolasi dimulai dengan mengetahui letak / loka


roduk yang akan disolasi
Intrasel
Ekstrasel
Terikat membran

Protein larut intrasel dari tumbuhan


teknik isolasi tidak rumit karena jaringa
lunak, mudah dihancurkan dengan tissu
homogenizer

Protein intrasel dari mikroorganisme


lebih liat perlu metode lebih kuat

Protein terikat membran masalah


tersendiri tidak tergantung sumber

Metode penghancuran (lisis) sel

1. Abrasif
- dengan blender laboratorium dengan butiran gela
(glass beads)

2. Liquid shear
- suspensi sel dilewatkan dengan tekanan tinggi me
lubang kecil ke dalam ruang dengan tekanan atmo
- karena perbedaan tekanan mendadak sel pecah
- untuk dinding sel bakteri yang tidak terlalu keras
misal bakteri Gram negatif

3. Osmotic shock
- sel disuspensikan di dalam akuades / larutan hipot
sehingga sel lisis
- protein dilepaskan dari sel yang lisis
- tidak efektif untuk sel bakteri dan tumbuhan

4. Penambahan alkali
- metode paling sederhana untuk melisis sel
- sebagian besar sel pecah pada pH 11,5 12,5
- protein yang diisolasi harus stabil selama 20 30 m
pada pH tinggi tsb

5. Penambahan deterjen.
- selain lisis sel, sebagian besar protein sel mengala
denaturasi
- untuk isolasi protein terikat membran

6. Solid shear
- dengan membekukan sel - 20oC, dipaksa melalui lubang
kecil pada tekanan tinggi
7. Penambahan lisozim dan EDTA
- cocok untuk skala kecil karena mahal
- efektif untuk sel bakteri
8. Pelarut organik
- toluen dan aseton untuk melisis berbagai sel
- tidak untuk skala besar toksik, mahal, mudah terbakar
9. Sonikasi
- lisis sel dengan getaran ultrasonik
- untuk skala kecil

PURIFIKASI (PROTEIN)

ada waktu lisis sel seluruh isi sel keluar


banyak kontaminan oleh karena itu harus

disingkirkan, antara lain asam nukleat


sam nukleat meyebabkan viskositas
nggi pada tahap awal harus disingkirkan
Presipitasi penambahan polikation BM
(protamin, streptomisin, polietileneimin) ma
Digesti dengan nuklease mudah, murah

etelah asam nukleat disingkirkan sisa s


yang tidak larut (dinding sel, protein
membran, bagian sel yang hancur) harus

isingkirkan dengan
Sentrifugasi sangat baik untuk solid
yang bersifat licin (slimmy or gelatinous
solids)
Filtrasi

Sentrifugasi
Kecepatan mulai 100 x g sampai 600.00
xg
Dapat memisahkan organel sel
berdasarkan massa dan densitasnya
- 3000 g = sel dan nukleus
- 12.000 g = mitokondria / kloroplas
- 100.000 g = mikrosom, ribosom

enyingkiran asam nukleat + debris sel (=

resipitat, pelet) - menghasilkan supernat

ang mengandung
- protein yang diinginkan
kontaminan (protein yang tidak diingink
molekul organik dan inorganik)

Penyingkiran kontaminan presipitasi dengan

Amonium sulfat dengan berbagai konsentrasi


- protein yang tidak diinginkan diendapkan terlebih
dahulu, baru protein yang diinginkan diendapkan
dengan konsentrasi yang lebih tinggi
- paling banyak digunakan
- pada skala besar masalah penanganan dan
pembuangan korosif

Natrium sulfat
- tidak bersifat korosif
- kelarutan rendah, perlu suhu > 35 oC untuk fraksin

Pelarut organik
- skala lab, jarang skala industri karena muda
terbakar

Polimer
- polietilen glikol (PEG)
- tidak toksik
- tidak mudah terbakar
- penggunaan terbatas karena meningkatka
viskositas larutan
- polyacrylic acid
- non toksik

Presipitasi pada titik isoelektrik (pI)

Lisis sel

sentrifugasi
supernatan

presipitat

kontaminan
supernatan

Am. sulfat
presipitat

Am. sulfat
supernatan

presipitat

Fraksinasi

emisahan selanjutnya (fraksinasi) melibatka


komponen
1.

Fasa solid / stasioner


- berupa film, kolom, gel atau membran
2. Pelarut
- fasa mobil pada kromatografi
3. Solut
- molekul yang harus dipisahkan

Teknik

Dasar pemisahan

Fasa solid

Dialisis

Uk / btk molekul

Mbr semipermabel Air

Filtrasi gel

Uk / btk molekul

Gel

Bufer

Krom. Adsorpsi

Adsorpsi

Adsorben

Nonpolar

Krom. Partisi

Solubilitas

Innert support

Ionisasi listrik
Muatan

Innert
support
Mtrks +
ggs
terionisasi
Matriks + ligan
berpori
Innert support

Pelarut

Polar nonpolar

Krom. Afinitas
Elektr
Aset
Krom. sel.
Pertkr
ion

PAGE

Interaksilistr
ligan
Muatan
+ uk mol

Bufer
Bufer

Bufer
Bufer

ada dasarnya pemisahan molekul protein dapat berdasarkan


Sifat
Muatan

Polaritas

Ukuran molekul

Prosedur
- kromatografi pertukaran ion
- elektroforesis
- kromatografi adsorpsi
- kromatografi kertas
- dialisis dan ultrafiltrasi
- gel elektroforesis
- kromatografi gel filtrasi
- ultrasentrifugasi
- kromatografi afinitas

Dialisis

Untuk memisahkan protein (molekul besar) dari garam


(molekul kecil) dan kontaminan berukuran kecil

Protein dimasukkan ke dalam kantong selofan yang berpor


kecil

Kantong dimasukkan ke dalam wadah yang mengandung


akuades / bufer, sambil di putar dengan pemutar magnetik
semalaman dengan penggantian akuades / bufer beberapa
kali dalam wadah
Pori memungkinkan molekul kecil berdifusi keluar, molekul
besar tertahan di dalam kantong

Dapat untuk memekatkan larutan dengan meletakkan


kantong dialisis dalam polimer desikan , misal polietilen glik

Dialisisis

Kantong selofan
berisi larutan yang
akan dimurnikan

Magnetic stirrer

Kromatografi

emisahan molekul berdasarkan perbedaan

ruktur dan atau sifat fisik pada saat berintera


fasa mobil
engan
fasa stasioner (matriks)
- kertas saring ( krom. kertas)
- lapis tipis selulosa / silika / alumina
kromatografi lapis tipis

Kromatografi Kertas

Beberapa tetes larutan yang mengandung kompon


yang akan dipisahkan diteteskan pada sepotong ker
dibiarkan kering

Ujung kertas dicelupkan ke dalam pelarut yang ter


dari campuran pelarut polar dan nonpolar

Komponen polar akan terikat pada kertas memben


fasa stasioner, sedangkan komponen nonpolar berg
membentuk fasa mobil

Berbagai komponen dalam larutan akan terpisahka


berdasarkan perbedaan kelarutan dalam fasa stasio
atau fasa mobil koefisien partisi

Setelah bergerak dalam jarak tertentu


kromatogram diangkat dan dikeringkan
Dideteksi dengan
- radioaktif
sinar
UV
- pewarnaan dengan zat warna

Kecepatan migrasi Rf (rate of fractionatio


perbandingan jarak yang ditempuh solut
dengan jarak yang ditempuh solven

Kromatografi
kertas - dua
dimensi

Kromatografi kolom

Fasa stasioner kolom butiran kecil selulosa / akrila


/ silika

Fasa stasioner berinteraksi dengan protein berdasa


- muatan
- interaksi hidrofobik
- interaksi ligan
Campuran protein dimasukkan ke dalam kolom,
kemudian di luruhkan dengan fasa mobil (eluen)

Fasa mobil yang keluar (eluat) ditampung dalam fra


fraksi dengan volume tertentu

Matriks yang digunakan

Cross-linked
dextran (Sephadex)

Agarosa
(Sepharose, Biogel)

Cross-linked
agarosa (Sepharose CL)

Poliakrilamid
(Biogel P)

Porous
glass (Bio-glass)

Kromatografi kolom

Kromatografi kolom

Kromatografi Partisi
Pemisahan dengan kromatografi kolom berdasarkan
afinitas relatif berbagai protein terhadap fasa mobil dan
fasa stasioner
Protein yang lebih kuat berinteraksi dengan matriks akan
tertahan
Lamanya waktu protein berinteraksi dengan matriks
tergantung dari komposisi fasa stasioner dan fasa mobil

Pemisahan protein optimal diperoleh dengan


manipulasi komposisi fasa stasioner dan mobil

omatografi Berdasarkan Ukuran Molekul


trasi Gel, Size Exclusion Chromatography)

Pemisahan protein berdasarkan perbedaan ukuran


molekul dan melewatkannya melalui kolom gel yan
telah mengembang

Yang paling banyak dipakai Sephadex partikel k


hidrofilik, tidak larut karena cross-linking dekstran
membentuk jaringan 3 dimensi

Molekul >> keluar lebih dahulu, molekul << tertah


karena masuk ke dalam butiran gel
= Molecular sieving

Dapat memperkirakan BM suatu sampel

Size exclusion
chromatography

Size exclusion
chromatography

Size exclusion chromatography

Kromatografi adsorpsi

Teknik kromatografi paling tua I x digunakan oleh


Tswett untuk memisahkan pigmen tumbuhan

Senyawa diadsorpsi ke dalam kolom terjadi


keseimbangan antara molekul yang terikat pada ma
dengan yang terdapat di dalam pelarut

Derajat pengikatan ditentukan oleh muatan, ikatan


der Waals, interaksi ionik, ikatan hidrogen, struktur
senyawa yang dipisahkan

Adsorben alumina, kieselguhr, sukrosa, silika gel

Eluen kloroform, heksan, etil eter, campuran pela


organik

Kromatografi pertukaran ion

>> digunakan untuk purifikasi protein, molekul kec

Matriks bahan inert dengan gugus terionisasi D


selulosa, CM selulosa

Atom N dari DEAE pada pH < 9 mengikat moleku


bermuatan negatif disebut penukar anion (anion
exchanger)
CM selulosa penukar kation (cathion exchanger)
Peluruhan protein berdasarkan muatan atau
konsentrasi garam dalam bufer

Penting diperhatikan resin yang dipakai, pH, ioni


strength larutan bufer

Kromatografi afinitas

Ligan terikat secara kovalen pada matriks porous


inert
Ligan
- spesifik substrat, analog, inhibitor
- umum AMP, hidrokarbon, zat warna
Dalam skala besar jarang digunakan mahal,
keterbatasan kapasitas, tidak stabil

Resolusi tinggi, proses purifikasi berlangsung cepa

Kromatografi afinitas

Kromatografi afinitas

Kromatografi lapis tipis

Pemisahan senyawa pada lempeng tipis


Dasar adsorpsi, pertukaran ion, partisi, filtrasi gel
Berlangsung cepat
Dapat memisahkan beberapa pemisahan sekaligus
Bercak yang timbul diwarnai dengan pewarnaan tertentu
diukur kadarnya secara spektrofotometri

Kromatografi Lapis Tipis

Kromatografi Lapis Tipis

PLC (High Performance Liquid Chromatography)

Separasi berdasarkan adsorpsi, pertukaran ion at


filtrasi

Sampel diuapkan dan dimasukkan ke dalam kolom


dengan tekanan tinggi (sp 5000 psi)
Eluat dideteksi dengan mengukur serapan pada
gelombang UV

Resolusi tinggi, cepat, sensitivitas >> - dapat meng


sampai ng

Sering digunakan untuk steroid, vitamin

Prinsip HPLC

Elektroforesis
Merupakan teknik pemisahan protein yang paling sering
digunakan di lab
Berdasarkan pergerakan molekul bermuatan dalam
medan listrik
Pada pH > pI, protein bermuatan negatif bergerak ke
anoda; pada pH < pI, protein bermuatan positif bergerak
ke katoda; pada pH = pI, protein tidak bergerak
Matriks yang digunakan membran selulosa asetat,
starch gel, akrilamid, agarosa

Elektroforesis

SDS-PAGE (Polyacrylamide Gel


Electrophoresis)

SDS = Sodium dodecyl sulphate


Akrilamid berpolimerisasi dan cross-linked membentuk
matriks yang porous
SDS membuat protein bermuatan negatif, sehingga
pemisahan terjadi berdasarkan kecepatan bergerak
dalam medan listrik yang dipengaruhi oleh besar molekul
Molekul besar lebih tertahan pergerakannya dibanding
molekul kecil
Protein yang terpisah divisualisasi dengan zat warna
Coomassie blue

Pada tiap tahap purifikasi harus dilakukan


Pengukuran volume sampel
Penetapan kadar protein
Mulai dari tahap awal sampai tahap akhir
penetapan untuk mengetahui seberapa
jauh terjadi pemurnian produk

Bila pada elektroforesis diperoleh 1 puncak


setelah melalui berbagai tahap purifikasi
presipitasi, krom pertukaran ion, filtrasi gel, krom
afinitas dapat dikatakan protein telah murni

Bila mungkin protein murni disimpan dalam


bentuk kristal

ENTIFIKASI & PENGHITUNGAN KADAR PROTEIN

LAM BAHAN UJI PADA TAHAP PURIFIKASI


- serapan pada 280 nm (sinar UV)
ecara spektrofotometri
- serapan protein setelah diwarnai dengan pewarna
bereaksi dengan asam amino / protein
- ninhidrin ( biru ) kromatografi lapis tipis
- biuret (lembayung)
- Bradford (biru)

ibandingkan
terhadap serapan larutan standar yang
- fluoresamin
diketahui kadarnya

ntuk enzim dihitung aktivitas dan


aktivitas spesifik pada setiap tahap
purifikasi

Aktivitas (Unit) enzim = jumlah protein


yang dapat mengubah 1 mol substrat
menjadi produk per menit pada suhu 25
C pada pH optimum

Aktivitas Spesifik = Unit per mg protein

Homogenat

Vol, kdr protein, Akt, AS

Am. sulfat

presipitat

Fraksinasi
Krom. Pert. Ion

Gel filtrasi

Elektroforesis
Krom. Afinitas

1 pita

Volume, kadar protein,


Akt, AS

supernatan

Vol, kdr protein, Akt, AS pilih fraksi dengan AS paling

Vol, kdr protein, Akt, AS pilih fraksi dengan AS paling

Vol, kdr protein, Akt, AS pilih fraksi dengan AS paling

Enzim murni

Contoh purifikasi enzim X

Contoh Tabel Purifikasi Enzim X


Tahap

Vol fraksi (mL)

Prot total (mg)

Aktivitas (U)

Akt Spesifik
(U/mg prot)

1.400

10.000

100.000

10

Presipitat

280

3.000

96.000

32

Krom Pert Ion

90

400

80.000

200

Filtrasi gel

80

100

60.000

600

45.000

15.000

Homogenat

Krom Afinitas