MAKALAH PERKEMBANGAN HEWAN

KRIOPRESERVASI (PEMBEKUAN)

Oleh :
Septian Theo Fandani
121810401058

JURUSAN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS JEMBER
2015

BAB 1. PENDAHULUAN

1.1

Latar belakang
Teknologi kriopreservasi oosit, sperma dan embrio banyak dikembangkan

pada berbagai spesies hewan dan manusia bersamaan dengan kemajuan pesat
teknologi produksi embrio baik secara in vivo maupun in vitro. Walaupun
viabilitas sperma, oosit dan embrio segar lebih baik daripada setelah pembekuan,
namun teknologi ini berkembang pesat untuk menangani ketersediaan gamet
(sperma dan oosit) pada saat in vitro fertilisasi serta kelebihan embrio hasil
produksi in vivo maupun in vitro. Teknologi ini memungkinkan penyimpanan
oosit dalam jangka waktu yang relatif lama sehingga bisa dimanfaatkan dalam
kondisi tertentu.

1.2

Rumusan masalah
1. Apa pengertian dari teknologi kriopreservasi?
2. Apa prinsip utama dari teknologi kriopreservasi?
3. Apa kelebihan dan kekurangan dari teknologi kriopreservasi?

1.3

Tujuan
1. Mengetahui pengertian dari teknologi kriopreservasi
2. Mengetahui prinsip utama dari kriopreservasi
3. Mengetahui kelebihan dan kekurangan teknologi kriopreservasi

BAB 2. PEMBAHASAN

2.1

Kriopreservasi
Secara teoritis, kriopreservasi berasal dari kata krio yang berarti beku, dan

preservasi yang berarti penyimpanan pada temperatur rendah. Jadi kriopreservasi

adalah teknik penyimpanan materi genetik dalam keadaan beku pada temperatur
rendah atau suatu teknik penyimpanan sel hewan, tumbuhan dan materi genetika
lainnya (termasuk semen dan oosit) dalam keadaan beku melalui reduksi aktivitas
metabolisme tanpa mempengaruhi organel-organel di dalam sel, fungsi fisiologi,
biologi, dan morfologi (Suprianata dan Pasaribu, 1992).
Metode kriopreservasi sel spermatozoa dibedakan atas pembekuan lambat
(slow freezing), pembekuan cepat (rapid freezing), dan pembekuan sangat cepat
(ultra rapid freezing). Prinsip yang terpenting dari kriopreservasi sel spermatozoa
ialah pengeluaran air dari dalam sel (dehidrasi) sebelum membeku intraseluler.
Bila tidak terjadi dehidrasi akan terbentuk kristal es besar dalam sel yang dapat
merusak sel dan bila terjadi dehidrasi yang sangat hebat maka sel akan mengalami
kekeringan sehingga sel mati (Supriatna dan Pasaribu 1992). Prinsip perpindahan
air keluar masuk membran, baik dehidrasi sebelum deep freezing maupun
rehidrasi pada saat pencairan kembali (thawing) menjadi perhatian khusus.
Pada dasarnya tujuan utama kriopreservasi sel spermatozoa ialah
melestarikan plasma nutfah yang mendekati kepunahan dan mendukung program
teknologi inseminasi buatan (IB) pada ternak. Keuntungan kriopreservasi sel
spermatozoa ialah sel spermatozoa dapat disimpan dalam waktu yang tidak
terbatas dan dapat digunakan kapan saja bila diperlukan (Toelihere 1985).

2.2

Prinsip Kriopreservasi
Kriopreservasi merupakan teknik penyimpanan materi biologi tanpa

mengalami kerusakan dalam waktu yang sangat lama, hingga ribuan tahun.
Perkembangan terakhir yang dikenal dengan metode slow cooling, dimana materi
biologi dibekukan dengan tingkatan pembekuan yang cukup cepat agar tidak
terjadi kerusakan pembekuan lambat (slow cooling damage), tetapi juga cukup

lambat agar tidak terjadi dehidrasi dari sel dan pembentukan krital es intraselular
(intracellular ice formation) (Porcu, 2001).

2.3

Teknik Kriopreservasi
Menurut Ika (2003), teknik kriopreservasi dapat dibedakan atas teknik lama

(klasik) dan teknik baru:

A. Teknik lama (klasik)
Teknik ini didasarkan pada freeze-induced dehydration, yaitu dehidrasi
yang diinduksi dengan pembekuan pada suhu di bawah titik beku air
hingga -40C. Teknik lama juga disebut teknik pembekuan lambat atau
teknik pembekuan dua tahap. Teknik pembekuan dua tahap meliputi
inkubasi sel pada krioprotektan (cryoprotectant)

dengan total

konsentrasi 1-2 M yang menyebabkan dehidrasi moderat dan diikuti

oleh pembekuan lambat, misalnya dengan kecepatan 1C per menit
hingga suhu -35C, lalu pembekuan dalam nitrogen cair dan selanjutnya
thawing (pelelehan) (Ika, 2003).
B. Teknik baru
Teknik ini didasarkan pada vitrification, yaitu dehidrasi yang diinduksi
pada suhu di atas titik beku air. Vitrification (vitrifikasi) adalah fase
transisi air dari bentuk cair menjadi bentuk nonkristalin atau amorf,
tembus pandang (glassy) karena elevasi ekstrim dari larutan yang
viskos selama pendinginan. Teknik vitrifikasi didasarkan pada dehidrasi
sel pada suhu non-freezing (tidak beku), yaitu dengan merendam bahan
dalam larutan krioprotektan dengan total konsentrasi 5-8 M pada suhu
0-25C dan diikuti oleh pembekuan dan selanjutnya pelelehan. Macammacam teknik baru antara lain (1) vitrifikasi, (2) enkapsulasidehidrasi,
(3) enkapsulasi-vitrifikasi, (4) desikasi, (5) pratumbuh, (6) pratumbuhdesikasi, dan (7) dropplet-freezing (Ika, 2003).

Adapun penjelasannya sebagai berikut:

a. Pada teknik vitrifikasi, bahan diperlakukan dengan senyawa
krioprotektif dan dehidrasi dengan larutan vitrifikasi, lalu diikuti
dengan pembekuan cepat, pelelehan, dan pembuangan krioprotektan
serta pemulihan kultur.
b. Teknik enkapsulasidehidrasi didasarkan pada teknologi yang telah
dikembangkan pada produksi benih sintetik. Pada teknik tersebut,
bahan dienkapsulasi pada kapsul alginat, lalu ditumbuhkan pada
medium yang diperkaya dengan sukrosa dan dikeringkan secara
parsial dalam laminar air flow cabinet atau gel silika hingga
kandungan air sekitar 20% dan diikuti oleh pembekuan cepat.
c. Teknik enkapsulasi-vitrifikasi merupakan kombinasi antara teknik
vitrifikasi dan enkapsulasidehidrasi, yaitu bahan dienkapsulasi
dengan kapsul alginat, lalu dibekukan dengan teknik vitrifikasi.
d. Teknik desikasi merupakan teknik yang paling sederhana, yaitu
mengeringkan bahan dalam laminar air flow cabinet, gel silika
atau flash drying hingga kandungan air 10-20%, kemudian diikuti
oleh pembekuan cepat.
e. Teknik pratumbuh meliputi penanaman bahan ke dalam media yang
mengandung krioprotektan, lalu diikuti oleh pembekuan cepat.
f. Teknik pratumbuh-desikasi dilakukan dengan menanam bahan ke
dalam

media

yang

mengandung

krioprotektan,

lalu

mengeringkannya dalam laminar air flow cabinet atau gel silika dan
diikuti oleh pembekuan cepat.
g. Droplet-freezing diawali dengan pra-perlakuan bahan ke dalam
media cair yang mengandung krioprotektan, lalu meletakkan pada
Al-foil yang disertai dengan droplet krioprotektan dan diikuti oleh
pembekuan cepat (Ika, 2003).

Teknik lama memerlukan peralatan terprogram yang cukup mahal

harganya, sedangkan teknik baru tidak memerlukan peralatan canggih

dan prosedurnya relatif lebih mudah. Teknik lama memerlukan

peralatan pembekuan, digunakan pada kultur sel, dan lebih sulit
diaplikasikan pada unit sel yang lebih besar seperti tunas apikal atau
embrio. Teknik lama berhasil diterapkan pada sistem kultur yang tidak
terdiferensiasi (suspensi sel dan kalus) dan spesies yang toleran
terhadap suhu dingin, namun tidak berhasil diterapkan pada spesies
tropis. Teknik vitrifikasi telah berhasil diterapkan pada spesies dengan
skala yang lebih luas (tropis dan subtropis) dan sistem kultur yang lebih
kompleks (embriosomatik, suspensi sel, dan meristem apikal)
(Ika, 2003).

2.4

Faktor yang Mempengaruhi Kriopreservasi

Sejumlah faktor yang mempengaruhi keberhasilan kriopreservasi dengan

teknik pembekuan lambat adalah (1) kecepatan pembekuan, (2) jenis dan
konsentrasi krioprotektan, (3) suhu akhir pembekuan, dan (4) tipe dan keadaan
fisiologis bahan yang akan disimpan. Jika pembekuan terlalu lambat maka sel
terlalu terdehidrasi sehingga konsentrasi zat elektrolit dalam sel menjadi tinggi.
Jika pembekuan terlalu cepat maka sel kurang mengalami dehidrasi sehingga
terjadi formasi es intraseluler yang bersifat letal.
Penambahan krioprotektan dapat memelihara keutuhan membran dan
meningkatkan potensial osmotik media sehingga cairan di dalam sel mengalir
keluar dan terjadi dehidrasi. Krioprotekan yang umum digunakan adalah DMSO,
gliserol, PEG, sorbitol, dan manitol. Senyawa dalam krioprotektan dapat dipisah
menjadi dua, yaitu senyawa yang dapat masuk ke dalam sel (permeating agent)
seperti DMSO, gliserol (pada suhu tertentu) dan yang tidak dapat masuk ke dalam
sel (non permeating agent) seperti sukrosa dan gula alkohol (manitol, sorbitol)
(Ika, 2003).
Selama pembekuan dan pelelehan, sel dapat mengalami kerusakan sebagai
akibat dari (1) eksposur bahan pada suhu rendah, (2) formasi kristal es, (3) sel
terdehidrasi, dan (4) formasi radikal bebas. Eksposur pada suhu rendah dapat
menyebabkan inaktivasi protein yang sensitif terhadap suhu dingin. Sebagian

besar formasi es intraseluler bersifat letal dan pada dasarnya sel dapat mentolelir
formasi es ekstraseluler. Namun demikian, formasi es ekstraseluler juga dapat
merusak sel karena daya mekanis dari kristal es yang tumbuh, gaya adesi kristal es
terhadap membran, interaksi elektris yang disebabkan oleh perbedaan solubilitas
ion pada fase es dan cair, formasi gelembung udara intraseluler, luka khemis yang
berhubungan dengan peroksidase lipid dan perubahan pH pada lokasi tertentu
(Ika , 2003).
Sel yang terdehidrasi terlalu kuat dapat mengalami plasmolisis yang kuat
pula sehingga berakibat terhadap perubahan pH, interaksi mikromolekuler, dan
peningkatan konsentrasi zat elektrolit. Pada saat pelelehan, kontraksi osmotik
dapat menyebabkan endositotik vesikulasi irreversibel yang mengakibatkan sel
lisis karena bahan membran yang baru tidak mampu memfasilitasi deplasmolisis
(Ika, 2003).

2.5

Faktor-Faktor yang Dapat Merusak Spermatozoa Selama Pemyimpanan

Kejadian yang dapat merusak dan menurunkan viabilitas spermatozoa

selama proses penyimpanan dan pembawa materi genetik ternak (sel gamet)
dengan teknik kriopreservasi yaitu kejutan dingin (cold shock) dan pembentukan
krista-kristal es. Kejutan dingin terjadi karena adanya penurunan suhu secara
mendadak dibawah suhu 0C. berkaitan erat dengan fase pemisahan dan
penurunan sifat-sifat permeabilitas secara selektif dan membran bioligik sel hidup
(Sinha et al, 1992).
Pengaruh kejutan dingin terhadap pembawa materi genetik ternak dapat
dilihat pada sel spermatozoa dan sel telur (oosit). Pada sel spermatozoa, kejutan
dingin menyebabkan terjadi penurunan motilitas, pelepasan enzim pada akrosom,
perpindahan ion melewati membran dan penurunan kandungan lipid (fosfolipid
dan kolestrol) yang berperan untuk mempertahankan integritas strukturalmembran plasma (Upreti et al, 1996).
Pembentukan kristal-kristal es berkaitan erat dengan perubahan tekanan
osmotik dalam fraksi yang tidak beku (Watson, 2000). Pengaruh pembentukan
kristal-kristal es terhadap pembawa materi genetik ternak selama proses

kriopreservasi dapat dilihat pada sel spermatozoa dan sel telur. Pada sel
spermatozoa dapat menyebabkan penurunan motilitas dan viabilitas spermatozoa,
peningkatan pengeluaran enzim-enzim intraseluler ke ekstraseluler dan kerusakan
pada organel-organel sel, seperti mitokondria dan lisosom (Suprianata dan
Pasaribu, 1992). Apabila mitokondria rusak dan rantai oksidasi putus akan
mengakibatkan spermatozoa berhenti bergerak karena tidak ada pasokan energi
dari organel mitokondria. Sumber energi mitokondria berperan untuk menggertak
mikrotubul

sehingga

terjadi

pergesekan

diantara

mikrotubul

sehingga

spermatozoa dapat bergerak secara bebas (motil).

2.6

Aspek-Aspek Praktis dari Kriopreservasi Semen

Pemrosesan semen pada kriopreservasi telah dijelaskan sebelumnya. Semen

dikemas dalam straw (0,25 dan 0,5 ml) untuk pembekuan dan penyimpanan, atau
dibekukan sebagai pelet pada depresi dangkal es kering. Straw dibekukan dalam
fase uap diatas nitrogen cair atau pada mesin pembeku dengan laju terkontrol.
Spermatozoa dikemas dalam bentuk straw 0,2 ml atau sekitar 10 15 juta sel
spermatozoa yang diinseminasikan langsung dari straw sesudah pencairan.
Sedangkan semen babi dapat dibekukan pada kuantitas yang lebih besar dengan
volume 200 l pada tabung 10 15 ml spermatozoa untuk satu kali inseminasi.
Hewan ternak seperti biri-biri, rusa dan hewan ruminansia eksotik lainnya
dapat

menggunakan

pipet

khusus

inseminasi

laparoskopis

yang

telah

dikembangkan dengan ukuran straw 0,25 ml dan jumlah sperma lebih rendah dari
metode inseminasi secara trans servikal. Inseminasi dapat dilakukan setelah
proses pencairan dalam waktu beberapa detik dengan menggunakan pipet trans
servikal. Cara yang lebih mudah untuk mencairkan sampel semen dengan
mengurangi konsentrasi simultan krioprotektan yang dapat

memberikan

keunggulan secara cepat dan jelas setelah proses pencairan basah dengan
menuangkan pelet ke dalam larutan khusus. Pencairan straw biasanya dilakukan
dengan pencelupan dalam bak air hangat dengan suhu optimum dan kombinasi
waktu dapat digunakan dalam penelitan ini dengan pencairan pada suhu
maksimum (60-70C). Teknik pencairan dengan laju penghangatan yang lebih

cepat dan dapat menghasilkan kualitas sperma yang. Penyimpanan volume sel
lebih besar dapat menyebabkan membran pecah (Suyadi et al, 2004). Supriatna
(1992) menyatakan bahwa periode pendinginan dan pembekuan dapat
mempengaruhi kelangsungan hidup sperma

dan meningkatkan fertilitas

spermatozoa. Volume pembekuan yang lebih besar seperti maxi-straw atau

kantung plastik dapat mempengaruhi kebutuhan dan pengembangan sistem
control suhu yang lebih selektif.

2.7

Kelebihan dan kekurangan

Setiap teknik penyimpanan mempunyai kelebihan dan kekurangan. Pada

penyimpanan in vitro jangka pendek dan jangka menengah diperlukan tindakan

subkultur yang berulang-ulang sehingga kurang efisien dalam hal waktu, tenaga,
ruangan, dan biaya. Tindakan tersebut juga dapat menyebabkan kultur mengalami
kontaminasi dan kehilangan vigoritas dan berpeluang terjadinya perubahan
genetik akibat penggunaan zat penghambat tumbuh dalam jangka waktu yang
relatif lama (Ika, 2003).
Dengan teknik kriopreservasi, kekurangan dari metode penyimpanan in
vitro tersebut dapat ditekan seminimal mungkin karena bahan disimpan dalam
ruangan bersuhu sangat rendah. Pada suhu yang sangat rendah, sel-sel tidak
mempunyai aktivitas metabolik dengan viabilitas yang tetap terpelihara sehingga
bahan dapat disimpan dalam jangka waktu yang sangat lama tanpa memerlukan
tindakan subkultur yang berulang-ulang. Keuntungan lain dari kriopreservasi sel
spermatozoa ialah sel spermatozoa dapat disimpan dalam waktu yang tidak
terbatas dan dapat digunakan kapan saja bila diperlukan (Ika, 2003)

BAB 3. PENUTUP

3.1

Kesimpulan
Kesimpulan yang dapat diambil dari makalah ini adalah:
a) Teknologi

kriopreservasi

adalah

salah

satu

usaha

untuk

mempertahankan plasma nutfah dari organisme yang ada atau yang

hampir punah.
b) Prinsip utama dari kriopreservasi adalah pembekuan oosit atau embrio
untuk selanjutnya dicairkan (thawing) kembali jika akan dipakai.
c) Teknik kriopreservasi lebih menguntungkan dilihat dari sisi ketahanan
sel daripada teknik in vitro lain.

DAFTAR PUSTAKA

Ika, R. T., I. Mariska. 2003. Pemanfaatan Teknik Kriopreservasi dalam

Penyimpanan

Plasma

Nutfah

Tanaman.

Bogor

: Balai

Penelitian

Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian.

Porcu. E. 2001. Oocyte cryopreservation. In Textbook of Assested Reproductive
Techniques Laboratory and Clinical Perspectives. United Kingdom : Martin
Dunitz Ltd. : 233-241
Sinha, S., B.C. Deka, M.K. Tamulu, and B.N. Borgohain. 1992. Effect of
equilibration period and glycerol level in Tris extender on quality of frozen
goat semen. Indian Vet. J. 69: 1107-1110.
Suprianata, I. dan F.H. Pasaribu. 1992. In Vitro Fertization, Transfer Embrio dan
Pembekuan Embrio. Bogor : Institut Pertanian Bogor.
Toelihere, M.R. 1985. Inseminasi Buatan pada Ternak. Bandung : Angkasa.
Upreti, G.C., S.R. Payne, D.M. Duganzich, J.E. Oliver, and J.F. Smith. 1996.
Enzyme leakage during cryopreservation of ram spermatozoa. Anim. Reprod.
Sci. 41:27-36.
Watson, P.F. 2000. The Causes of reduced fertility with cryopreserved semen.
Anim. Reprod. Sci.

10