Mahmuddin

BelajardanBerbagi

PolymeraseChainReaction(PCR)
PostedbyMahmuddinpadaAgustus31,2010
A.PrinsipKerja
PolymeraseChainReaction(PCR)adalahmetodeuntukamplifikasi(perbanyakan)primer
oligonukleotidadiarahkansecaraenzimatikurutanDNAspesifik.Teknikinimampu
memperbanyaksebuahurutan105106kalilipatdarijumlahnanogramDNAtemplate
dalamlatarbelakangbesarpadasequenceyangtidakrelevan(misalnyadaritotalDNA
genomik).SebuahprasyaratuntukmemperbanyakurutanmenggunakanPCRadalah
memilikipengetahuan,urutansegmenunikyangmengapitDNAyangakandiamplifikasi,
sehinggaoligonucleotidestertentudapatdiperoleh.Halinitidakperlutahuapaapatentang
urutaninterveningantaraprimer.ProdukPCRdiamplifikasidaritemplateDNA
menggunakanDNApolimerasestabilpanasdariThermusaquaticus(TaqDNApolimerase)
danmenggunakanpengatursiklustermalotomatis(PerkinElmer/Cetus)untuk
menempatkanreaksisampai30ataulebihsiklusdenaturasi,anilprimer,danpolimerisasi.
SetelahamplifikasidenganPCR,produkinidipisahkandenganelektroforesisgel
poliakrilamidadansecaralangsungdivisualisasikansetelahpewarnaandenganbromida
etidium.
PCR(PolymeraseChainReaction)merupakansuatuteknikperbanyakan(amplifikasi)
potonganDNAsecarainvitropadadaerahspesifikyangdibatasiolehduabuahprimer
oligonukleotida.Primeryangdigunakansebagaipembatasdaerahyangdiperbanyakadalah
DNAuntaitunggalyangurutannyakomplemendenganDNAtemplatnya.Prosestersebut
miripdenganprosesreplikasiDNAsecarainvivoyangbersifatsemikonservatif.
PCRmemungkinkanadanyaperbanyakanDNAantaraduaprimer,hanyadidalamtabung
reaksi,tanpaperlumemasukkannyakedalamsel(invivo).PadaprosesPCRdibutuhkan
DNAuntaigandayangberfungsisebagaicetakan(templat)yangmengandungDNAtarget
(yangakandiamplifikasi)untukpembentukanmolekulDNAbaru,enzimDNApolimerase,
deoksinukleosidatrifosfat(dNTP),dansepasangprimeroligonukleotida.Padakondisi
tertentu,keduaprimerakanmengenalidanberikatandenganuntaianDNAkomplemennya
yangterletakpadaawaldanakhirfragmenDNAtarget,sehinggakeduaprimertersebut
akanmenyediakangugushidroksilbebaspadakarbon3.Setelahkeduaprimermenempel
padaDNAtemplat,DNApolimerasemengkatalisisprosespemanjangankeduaprimer

padaDNAtemplat,DNApolimerasemengkatalisisprosespemanjangankeduaprimer
denganmenambahkannukleotidayangkomplemendenganurutannukleotidatemplat.
DNApolimerasemengkatalisispembentukanikatanfosfodiesterantaraOHpadakarbon3
dengangugus5fosfatdNTPyangditambahkan.SehinggaprosespenambahandNTPyang
dikatalisisolehenzimDNApolimeraseiniberlangsungdenganarah53dandisebut
reaksipolimerisasi.EnzimDNApolimerasehanyaakanmenambahkandNTPyang
komplemendengannukleotidayangterdapatpadarantaiDNAtemplat.
PCRmelibatkanbanyaksiklusyangmasingmasingterdiridaritigatahapberurutan,yaitu
pemisahan(denaturasi)rantaiDNAtemplat,penempelan(annealing)pasanganprimerpada
DNAtargetdanpemanjangan(extension)primerataureaksipolimerisasiyangdikaalisis
olehDNApolimerase.
B.Kegunaan
PolymeraseChainReaction(PCR)dapatdigunakanuntuk:
1.
2.
3.
4.

amplifikasiurutannukleotida.
menentukankondisiurutannukleotidasuatuDNAyangmengalamimutasi.
bidangkedokteranforensik.
melacakasalusulsesorangdenganmembandingkanfingerprint.

C.WaktuyangDibutuhkan
1. 12hari
2. PCR:36jamatausemalam
3. PolyacrylamidegelelectrophoresisusingMightysmallIIgelapparatus:2.5hours
poliakrilamidgelelektroforesismenggunakanMightysmallIIbahangel:2,5jam
4. Etidiumbromidestainingdanfotografi:45menit
D.ReagenKhusus
1. Pasanganprimeroligonukleotidasintetikmengapiturutanyangakandiamplifikasi
2. BufferPCR5X(250mMKCl,50mMTrisHClpH8,3,7,5mMMgCl2)
3. CampurandariempatdNTP(dGTP,dATP,dTTP,dCTP)masingmasingsebesar2,5mM
(ultramurniDNTPset,Pharmacia#27203501).DNTPcampurandibuatdenganvolume
10mMlarutandarimasingmasingempatdNTPterpisahyangdigabung.
4. TaqDNAPolymerase(AmpliTaqTM,PerkinElmer/Cetus)
5. Minyakmineralringan
6. Akrilamida(gradeelektroforesis)
7. N,NMethylenebisacrylamide(gradeelektroforesis,UltraPure/BRL,#5516UB)
8. Amoniumpersulfat(UltraPure/BRL,#5523UA)
9. TEMED(N,N,NNTetramethylethylenediamine,UltraMurni/BRL,#5524UB)
E.PeralatanKhusus
1. MightysmallIISE250verticalgelelectrophoresisunit(Hoefer)
2. PerkinElmer/CetusThermalCycler
3. SterileThinwall0.5mlThermocyclermicrofugetubes:(TC5,MidwestScientific)
KomponenPCRlainnya:
1)EnzimDNAPolymerase

1)EnzimDNAPolymerase
Dalamsejarahnya,PCRdilakukandenganmenggunakanKlenowfragmentDNAPolimerase
Iselamareaksipolimerisasinya.Enzimeiniternyatatidakaktifsecaratermalselamaproses
denaturasi,sehinggapenelitiharusmenambahkanenzimdisetiapsiklusnya.Selainitu,
enziminihanyabisadipakaiuntukperpanjangan200bpdanhasilnyamenjadikurang
spesifik.Untukmengatasikekurangantersebut,dalamperkembangannyakemudiandipakai
enzimTaqDNApolymeraseyangmemilikikeaktifanpadasuhutinggi.Olehkarenanya,
penambahanenzimtidakperludilakukandisetiapsiklusnya,danprosesPCRdapat
dilakukandalamsatumesin
2)Primer
Primermerupakanoligonukleotidapendekrantaitunggalyangmempunyaiurutan
komplemendenganDNAtemplatyangakandiperbanyak.Panjangprimerberkisarantara
2030basa.Untukmerancangurutanprimer,perludiketahuiurutannukleotidapadaawal
danakhirDNAtarget.Primeroligonukleotidadisintesismenggunakansuatualatyang
disebutDNAsynthesizer.
3)Reagenlainnya
Selainenzimdanprimer,terdapatjugakomponenlainyangikutmenentukankeberhasilan
reaksiPCR.KomponentersebutadalahdNTPuntukreaksipolimerisasi,danbufferyang
mengandungMgCl2.KonsentrasiionMg2+dalamcampuranreaksimerupakanhalyang
sangatkritis.KonsentrasiionMg2+inisangatmempengaruhiprosesprimerannealing,
denaturasi,spesifisitasproduk,aktivitasenzimdanfidelitasreaksi.
F.TahapanPCR
1)Denaturasi
Selamaprosesdenaturasi,DNAuntaigandaakanmembukamenjadiduauntaitunggal.Hal
inidisebabkankarenasuhudenaturasiyangtinggimenyebabkanputusnyaikatanhidrogen
diantarabasabasayangkomplemen.Padatahapini,seluruhreaksienzimtidakberjalan,
misalnyareaksipolimerisasipadasiklusyangsebelumnya.Denaturasibiasanyadilakukan
antarasuhu90oC95oC.
2)Penempelanprimer
Padatahappenempelanprimer(annealing),primerakanmenujudaerahyangspesifikyang
komplemendenganurutanprimer.Padaprosesannealingini,ikatanhidrogenakan
terbentukantaraprimerdenganurutankomplemenpadatemplate.Prosesinibiasanya
dilakukanpadasuhu50oC60oC.Selanjutnya,DNApolymeraseakanberikatansehingga
ikatanhidrogentersebutakanmenjadisangatkuatdantidakakanputuskembaliapabila
dilakukanreaksipolimerisasiselanjutnya,misalnyapada72oC.
3)Reaksipolimerisasi(extension)

Umumnya,reaksipolimerisasiatauperpanjanganrantaiini,terjadipadasuhu72oC.Primer
yangtelahmenempeltadiakanmengalamiperpanjanganpadasisi3nyadengan
penambahandNTPyangkomplemendengantemplatolehDNApolimerase.
Jikasiklusdilakukanberulangulangmakadaerahyangdibatasiolehduaprimerakan
diamplifikasisecaraeksponensial(disebutamplikonyangberupauntaiganda),sehingga
mencapaijumlahcopyyangdapatdirumuskandengan(2n)x.Dimananadalahjumlah
siklusdanxadalahjumlahawalmolekulDNA.Jadi,seandainyaada1copyDNAsebelum
siklusberlangsung,setelahsatusiklus,akanmenjadi2copy,sesudah2siklusakanmenjadi
4,sesudah3siklusakanmenjadi8kopidanseterusnya.Sehinggaperubahaniniakan
berlangsungsecaraeksponensial.PCRdenganmenggunakanenzimTaqDNApolimerase
padaakhirdarisetiapsiklusakanmenyebabkanpenambahansatunukleotidaApadaujung
3daripotonganDNAyangdihasilkan.SehingganantinyaprodukPCRinidapatdikloning
denganmenggunakanvektoryangditambahkannukleotidaTpadaujungujung5nya.
ProsesPCRdilakukanmenggunakansuatualatyangdisebutthermocycler.
G.ReverseTranscriptionPolymeraseChainReaction(RtPcr)
RTPCRmerupakansingkatanReverseTranscriptionPolymeraseChainReaction.Seperti
namanya,prosesRTPCRmerupakanbagiandariprosesPCRbiasa.Perbedaanyadengan
PCRyangbiasa,padaprosesiniberlangsungsatusiklustambahanyaituadanyaperubahan
RNAmenjadicDNA(complementaryDNA)denganmenggunakanenzimReverse
Transkriptase.ReverseTranscriptaseadalahsuatuenzimyangdapatmensintesamolekul
DNAsecarainvitromenggunakantemplateRNA.
SepertihalnyaPCRbiasa,padapengerjaanRTPCRinijugadiperlukanDNAPolimerase,
primer,buffer,dandNTP.NamunberbedadenganPCR,templatyangdigunakanpadaRT
PCRadalahRNAmurni.OlehkarenaprimerjugadapatmenempelpadaDNAselainpada
RNA,makaDNAyangmengkontaminasiprosesiniharusdibuang.Untukproses
amplifikasimRNAyangmempunyaipoly(A)tailpadaujung3,makaoligodT,random
heksamer,maupunprimerspesifikuntukgentertentudapatdimanfaatkanuntukmemulai
sintesacDNA.
H.MetodaDeteksiProdukPCR
ProdukPCRadalahsegmenDNA(amplikon)yangberadadalamjumlahjutaancopy,tetapi
tidakdapatdilihatdenganmatatelanjang.OlehkarenaituPCRperludiikutidengansuatu
tahapakhiryangbertujuanuntukmemvisualisasikanprodukPCRsertasekaligusbertujuan
untukmengetahuiukuranprodukPCRdanmengetahuiapakahprodukyangdihasilkan
adalahbenarsepertiyangdiinginkan.Salahsatumetodadeteksiyangumumdilakukan
adalahelektroforesisgenagarosa.
ThisentrywaspostedonAgustus31,2010pada7:00amandisfiledunderBiomolekuler,
Bioteknologi.Dengankaitkata:DNAFingerPrint,Elektroforesis,KegunaanPCR,Metode
PCR,PCR,ReaksiPCR,Reaksirantaipolimerase,tahapanPCR,TesDNA,UjiDNA.Youcan
followanyresponsestothisentrythroughtheRSS2.0feed.Youcanleavearesponse,atau
trackbackfromyourownsite.