Lampiran 1.

Pembuatan Media
1. Pembuatan Nutrient Agar Plate
a. Bahan ditimbang sebanyak 20 gram, dimasukkan dalam erlenmeyer.
b. Aquades ditambahkan sebanyak 1000 ml, campur hingga homogen.
c. Erlenmeyer dimasukkan dalam waterbath.
d. pH media NA diukur 7,0 0,2 pada suhu 25oC.
e. Erlenmeyer ditutup dengan kertas dan karet.
f. Media disterilkan dalam autoclave pada suhu 121oC selama 15 menit.
g. Media dituang dalam plate steril dan ditunggu memadat (Merck, 2012).
2. Pembuatan Media MCA (Mac Conkey Agar)
a. Bahan ditimbang sebanyak 50 gram dan dimasukkan dalam erlenmeyer.
b. Bahan dilarutkan dalam 1 liter aquades di waterbath.
c. pH media NA diukur 7,1 0,2 pada suhu 25oC.
d. Media dimasukkan dalam tabung lalu disterilkan dalam autoclave pada
suhu 121oC selama 15 menit.
e. Media dituang dalam plate steril, tunggu hingga memadat (Merck, 2012).
3. Pembuatan standar Mac Farland
a. Larutan H2SO4 0,36 N sebanyak 99,5 ml dimasukkan dalam erlenmeyer.
b. BaCl2.2H2O 1,175% ditambahkan sebanyak 0,5 ml.
c. Larutan dihomogenkan sampai terbentuk kekeruhan dan dipakai standar
kekeruhan bakteri uji (Mpila, 2012)
4. Pembuatan NaCl 0,9% steril
a. Reagen NaCl ditimbang sebanyak 9 gram, dimasukkan ke dalam labu
takar 100 ml.
b. Aquades ditambahkan sampai tanda 100 ml, dan dihomogenkan.
c. Larutan dituang ke dalam tabung reaksi masing-masing 9 ml.
d. Tabung reaksi ditutup dengan kapas, diikat tiap 10 tabung dan dibungkus
dengan kertas,
e. Larutan disterilkan dalam autoclave pada suhu 121oC selama 15 menit,
biarkan agak dingin.
f. Media dituang dalam tabung reaksi.
5. Pembuatan media Brain Heart Infusion (g/l)
a. Bahan ditimbang sebanyak 37 gram, dimasukkan dalam erlenmeyer.
b. Media dilarutkan dalam 1 liter aquades di waterbath.
c. pH media BHI diukur 7,4 0,2 pada suhu 25oC
d. Media dituang dalam tabung reaksi.

e. Disterilkan dalam autoclave pada suhu 121oC selama 15 menit (Merck,

2012).
6. Pembuatan media Kligler Iron Agar (g/l)
a. Bahan ditimbang sebanyak 55 gram dimasukkan dalam erlenmeyer.
b. Bahan dilarutkan dengan 1 liter aquades di waterbath.
c. pH media KIA diukur 7,4 0,2 pada suhu 25oC
d. Media dimasukkan ke dalam tabung.
e. Media disterilkan dalam autoclave pada suhu 121oC selama 15 menit.
f. Media ditunggu memadat dalam posisi miring (Merck, 2012).
7. Pembuatan media Sulfit Indol Motil (g/l)
a. Bahan ditimbang sebanyak 30 gram dimasukkan dalam erlenmeyer.
b. Bahan dilarutkan dengan 1 liter aquades di waterbath.
c. pH media SIM diukur 7,3 0,2 pada suhu 25oC
d. Media dimasukkan dalam tabung.
e. Media disterilkan dalam autoclave pada suhu 121oC selama 15 menit.
g. Media ditunggu memadat dalam posisi tegak (Merck, 2012).
8. Pembuatan media Urea (g/l)
a. Bahan ditimbang sebanyak 24 gram dimasukkan dalam erlenmeyer.
b. Bahan dilarutkan dalam 950 ml aquades di waterbath.
c. Media disterilkan dalam autoclave pada suhu 121oC selama 15 menit.
d. Media ditunggu hingga dingin (kira-kira 45-55 oC), lalu ditambahkan 50
ml urea 40%, homogenkan.
e. pH media Urea diukur 6,8 0,2 pada suhu 25oC.
f. Media dimasukkan dalam tabung, tunggu hingga memadat dalam posisi
tegak (Merck, 2012).
9. Pembuatan media Citrat (g/l)
a. Bahan ditimbang sebanyak 24,3 gram dimasukkan dalam erlenmeyer.
b. Bahan dilarutkan dalam 1 liter aquades di waterbath.
c. pH media Citrat diukur 6,6 0,2 pada suhu 25oC.
d. Media dituang dalam tabung.
e. Media disterilkan dalam autoclave pada suhu 121oC selama 15 menit.
f. Media ditunggu memadat dalam posisi miring (Merck, 2012).
10. Pembuatan media Methyl Red Voges Proskauer (g/l)
a. Bahan ditimbang sebanyak 17 gram dimasukkan dalam erlenmeyer
b. Bahan dilarutkan dalam 1 liter aquades di waterbath.
c. pH media MR/VP diukur 6,9 0,2 pada suhu 25oC.
d. Media dimasukkan dalam tabung.
e. Media disterilkan dalam autoclave pada suhu 121oC selama 15 menit
(Merck, 2012).
11. Pembuatan media PAD (Phenyl Alanin deaminase) (g/l)

a. Bahan ditimbang masing-masing (Yeast extract 3 gram, KH2PO4 1

gram, NaCl 5 gram, L-Phenylalanine 2 gram, agar agar 12 gram)
b. Bahan dilarutkan dalam 1 liter aquades di waterbath.
c. Media dimasukkan dalam tabung.
d. Media disterilkan dalam autoclave pada suhu 121C selama 15 menit
e. Media ditunggu memadat dalam posisi miring (Merck, 2012).
12. Pembuatan media Gula- gula
a. Larutkan peptone water 15 gram dimasukkan dalam erlenmeyer
b. Bahan ditambah 1 liter aquades, homogenkan.
c. Larutan dibagi dalam 5 tabung dan beri label (glukosa, laktosa, maltosa,
manitol, sakarosa/sukrosa).
d. Indikator gula-gula ditambahkan pada masing-masing tabung sebanyak
2 gram.
e. Larutan dituang ke dalam tabung reaksi sebanyak 5 ml kemudian tutup
tabung dengan kapas diberi tanda warna.
f. Tiap 10 tabung diikat kemudian disterilkan dalam autoclave pada suhu
121oC selama 15 menit (Merck, 2012).

Lampiran 2. Komposisi Reagen

1. Komposisi cat Gram

a. Cat Gram A :
Kristal violet
Etil alkohol 95%
Ammonium oksalat
Aquades
b. Cat Gram B :
Iodium
Kalium iodida
Aquades
c. Cat Gram C :
Aceton
Etil alkohol 95%
d. Cat Gram D
Safranin
Etil alkohol
Aquades
(Triyana, 2013)
2. Komposisi reagen penguji (reagen ujibiokimia)
a. Reagen Kovac
Paradimethyl amino benzalhedid
Amyl alkohol
HCl conc
b. Reagen KOH 40%
KOH
Aquades
c. Reagen FeCl3 10%
FeCl3
Aquades
d. Reagen Methyl red
Methyl red
Alkohol 96%
e. Reagen barried
Alfa naftol
Alkohol 96 %
3. Komposisi media Mac Conkey
a. Peptone from casein
b. Peptone from gelatin
c. Petone from meat
d. NaCl
e. Lactose
f. Osbile Salt
g. Kristal violet
h. Neutral Red
i. Agar- agar
pH = 7,1 (Merck, 2012)

: 2 gram
: 20 ml
: 0,8 gram
: 80 ml
: 1 gram
: 2 gram
: 300 ml
: 50 ml
: 50 ml
: 0,25 gram
: 10 ml
: 90 ml

: 5 gram
: 75 ml
: 25 ml
: 40 gram
: 100 ml
: 10 gram
: 100 ml
: 1 gram
: 100 ml
: 5 gram
: 100 ml
: 1,5 gram
: 17 gram
: 3 gram
: 5 gram
: 10 gram
: 1,5 gram
: 0,001 gram
: 0,03 gram
: 13,5 gram

4. Komposisi media NA miring

a. Peptones from meat
b. Meat extract
c. Agar-agar
(Merck, 2012)
5. Komposisi standart Mac Farland 0,5
a. H2SO4 0,36
b. BaCl2.2H2O 1,175%
(Mpila, 2012)

: 5,0 gram
: 3,0 gram
: 12,0 gram
: 99,5 ml
: 0,5 ml

Lampiran 3. Cara Sterilisasi Alat

1. Cara sterilisasi alat gelas
a. Alat dicuci bersih dengan sabun dan dikeringkan.
b. Alat dibungkus dengan kertas.
c. Alat disterilkan dengan oven suhu 175oC selama 90
sampai 120 menit.
2. Cara sterilisasi tip
a. Tip dan wadah dibersihkan, tip dimasukkan ke wadahnya
b. Wadah dibungkus dengan kertas alumunium foil.
c. Dibungkus lagi dengan kertas.
d. Wadah disterilkan ke dalam auoclave suhu 121oC selama 15
menit.
3. Alat seperti kawat ohse dan object glass disterilkan dengan pembakaran
langsung di atas pembakar spirtus (Putri, 2014)

Lampiran 4. Range Antibiotik Ciprofloksasin 5g

Zona Ihibisi
Resisten
Intermediet
Sensitif
(CLSI, 2012)

Diameter Zona Inhibisi (mm)

< 15
16-20
>21