BAB III

KEGIATAN PRAKTEK
3.1 Deskripsi Kegiatan
Kegiatan praktik di UPT. PPMHP Surabaya dilaksanakan pada tanggal 6
Juli - 6 Agustus 2015. Kerja praktik dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi
dengan membantu pengerjaan uji cemaran mikroba dalam sampel hasil perikanan,
tetapi dalam laporan ini dikhususkan dalam pengujian salah satu sampel saja,
yaitu udang putih beku (Gambar 3.2), yang dilakukan pada minggu pertama dan
kedua. Berdasarkan SNI tahun 2006 yang digunakan sebagai acuan pada UPT.
PPMHP dan permintaan pembeli produk, jenis cemaran mikroba yang diuji adalah
Escherichia coli, ALT, dan Salmonella.
3.2

Alat
Alat-alat yang digunakan adalah tabung reaksi, cawan Petri, tabung

Durham, pipet boy, dispenser, bunsen, pipet ukur, rak tabung reaksi, timbangan
analitik, autoklaf, inkubator, waterbath, botol kaca, erlenmeyer, pisau, pinset
panjang, gunting, korek api, loyang, ose, vorteks, laminar air-flow (LAF), colony
counter, spidol marker, kulkas, oven.
3.3

Bahan
Bahan-bahan yang digunakan adalah media LB (Lactose Broth), Rappaport-

Vassiliadis (RV) broth, EC broth, Lauryl Tryptose Broth (LTB), Plate Count Agar
(PCA), XLD (Xylose-Lysine-Deoxycholate) agar, HE (Hectoen Enteric) agar,
Levines Eosin Methylen Blue (LEMB) agar, Butterfields phosphate-Buffered
Dilution Water (BFP), aquades, alkohol 70%, alkohol 96%.

14

15
3.4

Skema Pengujian
225 ml BFP

225 ml LB
25 gram udang putih beku

Udang putih + BFP

Udang putih + LB

Uji E. coli

Uji ALT

Diinkubasi 24 jam 35C

Uji
Salmonella
Gambar 3.1 Skema Pengujian Udang Putih Beku
3.5
3.5.1

Metode Penelitian
Persiapan Sampel, Media, dan Peralatan
Langkah awal yang harus disiapkan adalah sampel (Gambar 3.2), media dan

peralatannya. Media harus diautoklaf terlebih dahulu agar kondisi steril, tetapi ada
media yang tidak boleh diautoklaf (misalnya XLD) sehingga sterilisasinya
menggunakan filter. Peralatan disterilisasi kering dengan oven bersuhu 180 oC
selama minimal 2 jam, lalu dilakukan penimbangan udang putih secara aseptis.

Gambar 3.2 Sampel dan homogenisasi sampel. Keterangan foto dari kiri ke
kanan: sampel udang putih beku dan 25 gram sampel dalam 225 ml
BFP.
3.5.2

Homogenisasi Sampel

16
Berdasarkan SNI 01-2332.3-2006 dan SNI 01-2332.1-2006, untuk
menghomogenkan sampel padat diperlukan 25 gram sampel ditambah 225 ml
larutan pengencer berupa BFP (Butterfields phosphate) sehingga didapatkan
pengenceran 1:10 (10-1). Kemudian ditunggu selama 15 menit hingga sampel
terlarut/homogen. Digunakan BFP sebagai larutan pengencer karena mengandung
sumber C, P, Na, K yang baik untuk pertumbuhan mikroorganisme dan MgCl2
(menjaga tekanan osmotik sel) (Acumedia, 2013). Hasil homogenisasi udang
putih beku dengan BFP terlihat pada Gambar 3.2.
3.5.3 Uji E. coli dengan Metode MPN
3.5.3.1 Uji Pendugaan
Media yang digunakan adalah Lauryl Tryptose Broth (LTB) dengan 3 seri
pengenceran (10-1, 10-2, dan 10-3) masing-masing pengenceran menggunakan 3
tabung. Untuk membuat pengenceran 10-1, dipipet larutan BFP + udang putih
sebanyak 1 ml ke dalam tiap 3 tabung berisi 9 ml LTB (terdapat tabung Durham
terbalik). Kemudian, sebanyak 1 ml sampel pengenceran 10-1 dipipet ke dalam tiap
3 tabung berisi 9 ml LTB sehingga didapatkan pengenceran 10-2. Dilakukan juga
dengan cara yang sama pada pengenceran 10 -2 terhadap pengenceran 10-3 pada tiap
3 tabung berisi 9 ml LTB (terdapat tabung Durham terbalik) yang lain. Semua
tabung diinkubasi pada inkubator selama 48 jam 2 jam pada suhu 35C 1C.
Jumlah tabung yang keruh dan membentuk gelembung gas pada tiap pengenceran
dicatat. Jika terbentuk gas dan keruh, tabung positif LTB diinokulasi ke media EC
broth.
Sebanyak 1 ose dari tiap tabung LTB yang positif (keruh dan terbentuk gas
dalam tabung durham) dipindahkan ke dalam media EC broth secara aseptis.
Kemudian diinkubasi dalam waterbath selama 48 jam 2 jam pada suhu 45C
0,5C. Waterbath harus dalam keadaan bersih, air di dalamnya harus lebih tinggi
dari tinggi cairan yang ada dalam tabung yang akan diinkubasi. Adanya gas dan
kekeruhan pada tabung EC broth menandakan adanya fekal koliform dalam
sampel.
3.5.3.2 Uji Penegasan

17
Tabung EC broth yang positif diambil 1 ose dan diinokulasi pada media
LEMB agar secara aseptis, kemudian diinkubasi selama 24 jam 2 jam pada suhu
35C 1C untuk uji penegasan Escherichia coli. Koloni yang diduga
Escherichia coli memberikan ciri yang khas warna hitam pada bagian tengah
dengan atau tanpa hijau metalik. Banyaknya bakteri Escherichia coli dapat dilihat
dengan menghitung tabung EC broth yang menunjukkan hasil positif E. coli
ketika diinokulasi di media LEMB agar, yang kemudian disesuaikan dengan tabel
MPN (Tabel 2.1) sehingga didapatkan perkiraan jumlah E. coli dalam sampel
dengan satuan APM/gram. Koloni yang terduga E. coli juga dapat ditegaskan lagi
dengan uji biokimia IMViC dan pewarnaan Gram bila waktu mencukupi.
3.5.4

Uji Angka Lempeng Total (ALT)

Uji ALT yang dilakukan menggunakan metode pour plate. Digunakan

pengenceran 10-1, 10-2, 10-3, 10-4 dan 10-5 untuk uji ini. Sebanyak 1 ml sampel dari
masing masing pengenceran dipindahkan ke dalam cawan Petri steril. Kemudian
ke dalam setiap cawan Petri dituangkan sebanyak 12 15 ml media PCA cair
steril. Dibuat juga kontrol yang hanya mengandung media PCA dan media PCA +
1 ml BFP untuk mengetahui keberadaan kontaminan dalam media. Campuran
dalam cawan Petri dibiarkan membeku. Semua cawan Petri diinkubasi dalam
posisi terbalik dalam inkubator selama 48 jam 2 jam pada suhu 35C.
Pertumbuhan koloni pada setiap cawan Petri dicatat dan dihitung angka lempeng
total per gram sampel dengan perhitungan ALT.
3.5.5 Uji Salmonella
3.5.5.1 Tahap Pra-pengkayaan
Sebanyak 25 gram udang putih dimasukkan dalam 225 ml lactose broth
(LB) dan dikocok selama 2 menit untuk menghomogenkan, kemudian diinkubasi
24 jam 2 jam pada suhu 35C 1C.
3.5.5.2 Tahap Pengkayaan dan Pengkayaan Selektif
Sebanyak 0,1 ml larutan LB + sampel dipindahkan ke dalam 10 ml
Rappaport-Vassiliadis (RV) broth dan diinkubasi pada waterbath selama 24 jam
2 jam pada suhu 42C 0,2C. Kocok tabung (dengan vorteks) dan sebanyak 1
ose diinokulasikan ke dalam media HE dan XLD agar, kemudian diinkubasi pada
inkubator selama 24 jam pada suhu 35C 1C. Pada Hectoen Enteric (HE)

18
Agar, koloni Salmonella akan berwarna hijau kebiruan sampai biru dengan atau
tanpa inti hitam. Pada XLD Agar, koloni Salmonella akan berwarna merah dengan
atau tanpa inti hitam. Pengujian dapat dilanjutkan dengan uji biokimia bila waktu
mencukupi.
3.6

Hasil
Tabel 3.1 Hasil Pengamatan Uji Cemaran Mikroba Pada Udang Putih Beku
Uji

Hasil Percobaan

Interpretasi Hasil

Escherichia
coli

0-0-0

<3 APM/g

Jumlah
koloni
TBUD
TBUD
79
14
0
Negatif
Salmonella
Negatif
Salmonella

Standar
(SNI)
<3
APM/g

Lolos /
Tidak Lolos
Lolos

Pengenceran
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5

ALT (Angka
Lempeng
Total)

XLD
Salmonella
HE

79
[(1x1)+(0,1x0)]x10-3
= 7,9 x 104 koloni/g

5 x 105
koloni/g

Lolos

Negatif / 25 gram

Negatif
/ 25
gram

Lolos

Keterangan :
TBUD : terlalu banyak untuk dihitung (>250 koloni)
APM : Angka Paling Memungkinkan
3.7

Pembahasan
Pada sampel udang putih yang diteliti menunjukan hasil negatif pada uji

Escherichia coli (Gambar 3.4), karena pada media EC broth (pendugaan E. coli),
tidak memberikan hasil positif (tidak ada yang keruh dan bergas), meskipun pada
tahap uji pendugaan koliform terdapat hasil positif di media LTB (1-0-0) (Gambar
3.3). Oleh karena itu, uji E. coli tidak dilanjutkan sampai uji penegasan karena
pada uji pendugaan saja tidak ada hasil yang positif.

19
Gambar 3.3 Hasil uji pendugaan koliform di media LTB. Keterangan foto dari
kiri ke kanan: tabung kontrol positif, pengenceran 10-1, 10-2, 10-3.

Gambar 3.4 Hasil uji pendugaan E. coli di media EC broth. Keterangan tabung
dari kiri ke kanan: hasil inokulasi dari LTB pengenceran 10 -1 yang
positif dan kontrol positif EC broth.
Uji ALT pada sampel udang putih menunjukan hasil yang tidak terlalu
tinggi, dalam artian masih di bawah batas standar (5 x 105 koloni/g). Dari hasil
penghitungan koloni di media PCA, koloni yang dapat dihitung adalah pada
sampel pengenceran 10-3, 10-4, dan 10-5. Karena pada pengenceran 10-4 dan 10-5
menunjukkan jumlah koloni kurang dari 25 koloni, maka pengenceran tersebut
tidak dimasukkan dalam perhitungan ALT. Oleh karena itu, sampel pengenceran
10-3 yang terhitung sebanyak 79 koloni pada media PCA digunakan untuk
perhitungan ALT. Dari hasil perhitungan, didapatkan ALT udang putih sebesar 7,9
x 104 koloni/g. Selain itu, pada kontrol media PCA maupun kontrol media PCA +

BFP (larutan yang digunakan untuk pengenceran) tidak ada koloni bakteri yang
tumbuh (Gambar 3.5), artinya tidak ada kontaminasi pada media PCA maupun
larutan pengencer BFP. Hasil pengamatan koloni ALT dapat dilihat di Gambar 3.6.

Gambar 3.5 Hasil inkubasi kontrol media PCA dan BFP. Keterangan cawan Petri
dari kiri ke kanan: cawan Petri berisi media PCA saja dan cawan
Petri berisi media PCA + 1 ml BFP.

20

Gambar 3.6 Hasil uji ALT. Keterangan cawan Petri dari kiri ke kanan (atas):
sampel pengenceran 10-1, 10-2, dan 10-3. Keterangan cawan Petri dari
kiri ke kanan (bawah) : sampel pengenceran 10-4 dan 10-5. Tanda
panah hitam merupakan contoh koloni yang dihitung, sedangkan
tanda panah merah merupakan koloni jamur yang tidak dihitung
untuk ALT.
Pada uji Salmonella, pra-pengkayaan di media LB (Gambar 3.7) dilanjutkan
dengan pengkayaan di media RV (Gambar 3.7), kemudian dilanjutkan dengan
pengkayaan selektif di media XLD dan HE (Gambar 3.8). Pada media XLD dan
HE, tidak ada koloni yang menunjukkan ciri-ciri koloni Salmonella. Koloni yang
tumbuh diperkirakan merupakan golongan koliform, yaitu berwarna kekuningan
(Cappucino & Sherman, 2008). Bila terdapat Salmonella pada sampel udang
putih, Salmonella akan memfermentasi xylose, mendekarboksilasi lysine dan
memproduksi H2S sehingga Salmonella akan membentuk koloni merah dengan
atau tanpa inti hitam di media XLD, sedangkan di media HE, koloni Salmonella
akan tumbuh dengan warna hijau kebiruan sampai biru dengan atau tanpa inti
koloni hitam, seperti pada kontrol positif (Gambar 3.9).

21

Gambar 3.7 Pre-enrichment dan enrichment uji Salmonella. Keterangan foto dari
kiri ke kanan: pra-pengkayaan di media LB, media RV berisi kontrol
positif dan media RV berisi sampel.

Gambar 3.8 Selective enrichment uji Salmonella. Keterangan cawan Petri dari
kiri ke kanan: pengkayaan selektif di media XLD dan HE. Tanda
panah kuning menunjukkan salah satu koloni yang tidak
menunjukkan ciri-ciri koloni Salmonella.

Gambar 3.9 Kontrol positif selective enrichment uji Salmonella. Keterangan

cawan Petri dari kiri ke kanan: kontrol positif Salmonella di media
XLD dan HE. Koloni-koloni yang berada di lingkaran hitam
merupakan koloni Salmonella.
Berdasarkan hasil pengamatan yang dilakukan, udang putih beku ini sudah
dapat disertifikasi untuk diekspor karena uji E. coli, ALT, dan Salmonella pada

22
sampel ini sudah memenuhi standar SNI udang beku, sehingga dapat dikatakan
proses pengolahan maupun packing produk oleh produsen sudah cukup baik.