PANDUAN PRAKTIKUM

BLOK 9 BIOLOGI MOLEKULER

FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS SRIWIJAYA
TAHUN AJARAN 2014-2015

POLYMERASE CHAIN REACTION

(PCR)
I.

PENDAHULUAN
Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah suatu teknik atau metode perbanyakan

(amplifikasi) DNA secara in vitro. Dengan PCR, suatu fragmen DNA dapat
diamplifikasi hingga jutaan kali dalam waktu yang relatif singkat. Teknik ini sendiri
pertama kali dikembangkan oleh Karry Mullis pada tahun 1985.
Secara umum, komponen- komponen yang diperlukan pada proses PCR adalah
sebagai berikut:
1. DNA template,
2. Sepasang primer, yaitu suatu oligonukleotida pendek yang mempunyai
urutan nukleotida yang komplementer dengan urutan nukleotida DNA
template,
3. dNTPs (Deoxynucleotide triphosphates),
4. Buffer PCR,
5. Magnesium klorida (MgCl2), dan
6. Enzim polimerase DNA.
Proses PCR biasanya berulang sekitar 20-30 siklus, dimana setiap siklus terdiri
dari 3 tahap, yakni: denaturasi, penempelan (annealing), dan pemanjangan
(elongasi).
1. Denaturasi
Merupakan proses pemutusan ikatan hidrogen DNA sehingga menjadi berkas
DNA tunggal. Proses ini berlangsung pada suhu 9496C. Biasanya pada tahap
awal PCR (pra-PCR denaturasi) tahap ini dilakukan selama 5 menit untuk
memastikan semua berkas DNA terpisah. Pemisahan ini menyebabkan DNA tidak

1 | Panduan Praktikum Blok 9

PANDUAN PRAKTIKUM
BLOK 9 BIOLOGI MOLEKULER
FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS SRIWIJAYA
TAHUN AJARAN 2014-2015

stabil dan siap menjadi templat bagi primer. Durasi proses denaturasi adalah 1
2 menit.
2. Penempelan (annealing) merupakan proses penempelan primer pada bagian
DNA templat yang komplementer urutan basanya dan berlangsung pada suhu
5065C. Tahap ini berlangsung 12 menit.
3. Pemanjangan (elongasi) Dengan Taq-polimerase, proses ini biasanya dilakukan
pada suhu 72C, sesuai dengan suhu optimum enzim Taq.

II.

TUJUAN PRAKTIKUM

Mahasiswa mengetahui prinsip dan cara kerja Polymerase Chain Reaction (PCR)

2 | Panduan Praktikum Blok 9

PANDUAN PRAKTIKUM
BLOK 9 BIOLOGI MOLEKULER
FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS SRIWIJAYA
TAHUN AJARAN 2014-2015

III.

BAHAN DAN ALAT

BAHAN
1. DNA template
Fungsi DNA template adalah sebagai cetakan untuk amplifikasi atau
perbanyakan DNA baru yang sama seperti DNA template. DNA template diperoleh
sebelumnya dari proses isolasi dan purifikasi DNA, dari berbagai jenis spesimen.
2. Primer
Primer merupakan suatu urutan DNA dengan panjang berkisar antara 18-30
pasangan basa yang bersifat komplemen terhadap DNA template. Dalam proses PCR
biasanya digunakan sepasang primer, dimana kedua primer tersebut akan bertindak
seolah sebagai pembatas fragmen DNA target yang akan diamplifikasi. Primer
biasanya dirancang berdasarkan data urutan DNA yang sebelumnya telah diketahui.
Ada beberapa hal yang perlu diperhatikan sebelum merancang primer, seperti:
panjang primer, komposisi primer (contoh: kandungan G dan C), melting
temperature, serta interaksi antar primer itu sendiri.
3. dNTPs (deoxynucleotide triphosphates)
dNTPs

merupakan

suatu

campuran

yang

terdiri

atas

dATP

(deoksiadenosintrifosfat), dTTP (deoksitimidin trifosfat) , dCTP (deoksisitidin

trifosfat) dan dGTP (deoksiguanosin trifosfat). dNTPs sendiri bertindak sebagai
building block DNA yang diperlukan dalam proses ekstensi DNA, dimana dNTP akan
menempel pada

ujung dari primer membentuk untaian baru yang sifatnya

komplementer dengan untaian DNA template.

4. Buffer PCR dan MgCl2
PCR merupakan suatu proses yang amat bergantung pada kondisi optimal pH
tertentu. Disinilah buffer berperan sangat penting, karena buffer berfungsi dalam
menjaga pH medium.

3 | Panduan Praktikum Blok 9

PANDUAN PRAKTIKUM
BLOK 9 BIOLOGI MOLEKULER
FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS SRIWIJAYA
TAHUN AJARAN 2014-2015

Lebih lanjut lagi, reaksi PCR juga memerlukan ion Mg2+, yang diperoleh dari
penambahan MgCl2 pada reaksi PCR. MgCl2 sendiri berfungsi sebagai kofaktor yang
menstimulasi aktivitas DNA polimerase.
5. Enzim Polimerase DNA
Enzim polimerase DNA berperan sebagai katalisis untuk reaksi polimerisasi
DNA. Dengan kata lain, enzim polimerase berfungsi dalam proses ekstensi atau
perpanjangan DNA yang baru. Enzim polimerase DNA umumnya didapat dari hasil
isolasi bakteri termofilik atau hipertermofilik sehingga enzim ini bersifat
termostabil sampai temperatur 950C.
ALAT
a.

Tabung PCR

b.

Rak tabung

c.

Micropipet dengan berbagai ukuran (ukuran 0,1-10 ;rl, 10-100 prl dan 1001000 gl)

d.

Pipet tip dengan berbagai ukuran

e.

Tabung eppendorf 1,5 ml

f.

Mesin vorteks

g.

Alat untuk spin

h.

Mesin PCR

4 | Panduan Praktikum Blok 9

PANDUAN PRAKTIKUM
BLOK 9 BIOLOGI MOLEKULER
FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS SRIWIJAYA
TAHUN AJARAN 2014-2015

IV.

CARA KERJA

IV.1. Optimasi
Dalam upaya untuk memperoleh hasil reaksi PCR yang optimal, perlu dilakukan
suatu tindakan optimasi PCR. Optimasi PCR dilakukan dengan cara mengubah berbagai
variabel atau kondisi yang terlibat dalam suatu reaksi PCR. Beberapa variabel ataupun
kondisi yang sering kali divariasikan dalam upaya optimasi PCR adalah jenis DNA
polimerase, suhu, konsentrasi dNTPs, konsentrasi MgCl2, buffer PCR hingga waktu.

IV.2. Amplifikasi
Contoh:
Suatu penelitian bertujuan untuk melihat jumlah CAG repeat pada pasien-pasien
isolated hypospadias. Amplifikasi dilakukan pada volume reaksi 25 L yang
mengandung 2 L of DNA, 2.5 L PCR buffer, 1.5 ul 25 mM MgCL2, 2.0 ul 2.5 mM
deoxynucleotide triphosphate, 0.5 ul dari 20 mM pada masing-masing primer, dan 0.1
units dari Taq polymerase Fermentas serta 15.9 air steril (seperti dapat dilihat di tabel
1).
Pada penelitian ini digunakan primer AIF (5 AGCCTGTTGAACTCTTCTGAGC -3)
sebagai forward primer dan A2R (5 TCCAGGCTCTGGACGCAACC -3) sebagai reverse
primer. Reaksi PCR dilakukan dengan menggunakan PCR machine AB Biosystem, Verriti
96 well.

5 | Panduan Praktikum Blok 9

PANDUAN PRAKTIKUM
BLOK 9 BIOLOGI MOLEKULER
FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS SRIWIJAYA
TAHUN AJARAN 2014-2015

Tabel 1. Protokol PCR

No

Reagents

Volume (l)

Sterile Distill Water

15.9

Fermentas 10X PCR Buffer with [(NH4)2 2.5

SO4]

2.5 mM dNTPs

2.0

25 mM MgCL2

1.5

20 mM A1F (Forward Primer)

0.5

20 mM A2R (Reverse Primer)

0.5

Fermentas Taq Polymerase 5 U/ul

0.1

DNA

Profil atau kondisi PCR-nya sendiri adalah sebagai berikut: denaturasi awal
selama 3 menit pada suhu 95 C; diikuti 35 siklus proses annealing dan extension;
masing-masing pada suhu 950C selama 30 detik, 620C selama 45 detik, dan 720C selama
2 menit 30 detik. Siklus ekstensi dilakukan pada suhu 720C selama 10 menit dilanjutkan
proses pendinginan dalam suhu 150C selama beberapa lama.

6 | Panduan Praktikum Blok 9