METODOLOGI PENELITIAN

4.1 DesainPenelitian
Jenis penelitian adalah experimental. akar mambung diperoleh dari Kabupaten
Murung Raya. Akar mambung dibuat menjadi ekstrak dengan pelarut etanol
dengan cara maserasi. Maserasi adalah proses pengekstrakan simplisia dengan
menggunakan pelarut dengan beberapa kali pengocokan atau pengadukan pada
temperatur kamar. Maserasi berarti dilakukan pengulangan penambahan pelarut
setelah dilakukan penyaringan maserat pertama dan seterusnya. Lalu dilakukan uji
aktivitas antioksidan dengan metode DPPH.

4.2 Waktu dan Lokasi Penelitian

4.2.1 Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan pada bulan Desember sampai Januari tahun 2014
4.2.2 Tempat penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Fakultas Kedokteran Universitas
Palangkaraya.
4.3 Estimasi Besar Sampel

26

Besar sampel pada penelitian ini dihitung dengan menggunakan rumus Federer:

( n1 )( t1 ) 15
dengan n

merupakan jumlah pengulangan dan t merupakan jumlah perlakuan.

dalam penelitian ini akan dilakukan tujuh perlakuan dengan dua perlakuan
merupakan kontrol positif dan negatif sehingga estimasi besar sampel dihitung sebagai
berikut :
Diketahui t adalah 7, maka

( n1 )( t1 ) 15
( n1 )( 71 ) 15

6 ( n1 ) 15
6n-615
6n=15+6
Jadi n = 21/6=3,5 4
sehingga masing-masing perlakuan dilakukan empat kali pengulangan.22

4.4 Kriteria Pemilihan

4.4.1 Kriteria Inklusi
Akar tumbuhan mambung

yang tidak terlalu muda dan tidak terlalu tua

pada cabang ke -4 sampai ke -6.

4.4.2 Kriteria Ekslusi
Akur tumbuhan mambungyang tidak terlalu muda dan tidak terlalu tua pada
cabang ke -4 sampai ke -6 yang kemudian dikeringkan namun membusuk.
4.5 Variabel Penelitian
4.5.1 Variabel Bebas
Variabel bebas penelitian ini adalah ekstrak etanol akar tumbuhan mambung
(Blumea balsamifera.
4.5.2 Variabel Tergantung
Variabel tergantung penelitian ini adalah aktivitas antioksidan ekstrak etanol
akar tumbuhan mambung (Blumea balsamifera).
4.6 Definisi Operasional
Tabel 4.1 Definisi Operasional

Variabel
Ekstrak

Definisi Operasional
Akar mambung yang

Hasil Ukur
Konsentrasi

Alat Ukur
Tabung

etanol

telah dilumatkan halus

(ppm)

Reaksi

Skala
Numerik

akar

kemudian

dimaserasi

tumbuha

dengan

erlenmeyer selama 24

mambun

jam

perbandingan 50 gram

etanol

dalam
dengan

dengan pelarut etanol

96%

kemudian

dimaserasi
jam

selama

dengan

24
kali

pengulangan kemudian
disaring dengan kertas
saring

untuk

memisahkan ampas dan

filtratnya,

filtratnya

kemudian

dievaporasi

untuk

menguapkan

pelarutnya.

Sehingga

diperoleh
kental

Aktivitas
Antioksida
n

ekstrak
dari

filtrat

rendaman

daun

mambung.
Antioksidan

merupakan

Persen

Spektofot

elektron

Inhibisi

ometer

(%)

UV vis

senyawa

pemberi

(donor elektron) atau reduktan

dan

merupakan

Numerik

senyawa

penghambat radikal bebas.

4.7 Pertimbangan Etika Penelitian
Penelitian ini menggunakan sampel berupa akar tumbuhan mambung
(Blumea balsamifera) dengan pertimbangan :
a. Tumbuhan ini bukan merupakan tumbuhan langka dan dilindungi.
b. Penggunaan tumbuhan ini sebagai sampel tidak akan mengganggu populasi
tumbuhan itu sendiri.

c.Determinasi

penamaan

dan

klasifikasi

tumbuhan

ini

dilakukan

di

laboratorium LIPI.
d. Tumbuhan ini bukan merupakan tumbuhan yang berbahaya seperti halnya
beracun.
e.Metode, alat dan bahan dalam penelitian ini bukan merupakan zat yang
bersifat toxic.
f. Limbah sisa penelitian akan didekontaminasi dengan pembagian antara
bahan yang dapat dibakar dan tidak dapat dibakar, untuk bahan yang tidak
dapat dan atau berbahaya untuk dibakar maka akan dilakukan penguburan.
4.8 Alat dan Bahan
a. Pembuatan ekstrak Etanol
Pada tahan ini diperlukan alat dan bahan berupa :
1. Tabung reaksi
2. Mortir
3. Stamper
4. Timbangan
5. Laruta Etanol
6. Larutan Metanol analisis
7. Alumunium Foil
8. Erlenmeyer
9. Vakum
10. Kertas saring
11. Evaporator
12. Timbangan
13. Termometer ruangan

b. Penentuan aktivitas antioksidan dengan metode DPPH

Pada tahan ini diperlukan alat dan bahan berupa :

Tabung reaksi

Vortex

Stopwatch

Spektrofotometer

Ektrak Etanol

Larutan DPPH

Larutan vitamin C (kontrol)

4.9 Prosedur Kerja

4.9.1. DeterminasiTumbuhan
Tumbuhan mambung yang diteliti dideterminasi di Laboratorium Lembaga Ilmu
Pengetahuan Indonesia di Bogor.
4.9.2 Pengambilan Sampel
Akar yang diambil dari tumbuhan mambung yang tidak terlalu tua namun tidak
terlalu muda, setelah dicuci daun akan dikeringkan dengan cara diangin-anginkan
dengan tanpa terkena sinar matahari langsung, kemudian akar akan dihaluskan
menjadi serbuk dan disimpan di wadah kering.
4.9.3. Pembuatan Ekstrak Tumbuhan Mambung
Akar tumbuhan Mambung (Blumea balsamifera) yang telah dikeringkan
kemudian ditimbang sebanyak 50 gram kemudian diekstraksi dengan cara dimaserasi
dengan menggunakan pelarut etanol 96% sampai akar terendam semuanya selama 24
jam dengan tiga kali pengulangan, setiap 24 jam filtrat etanol dipisahkan dengan
menggunakan kertas saring kemudian dipekatkan dengan vakum evaporator.
Kemudian ekstrak ditimbang bobotnya.
4.9.4. Penentuan Aktivitas Antioksidan
a. Pembuatan larutan DPPH 0,4 mM

Sebanyak 7,9 mg DPPH ditimbang, kemudian dilarutkan dengan methanol

analisis hingga 50 mL. kemudian ditempatkan kedalam botol gelap yang telah
dibungkus dengan alumunium foil. Untuk setiap pengujian, larutan dibuat
baru.
b. Pembuatan larutan blanko
Sebanyak 1 mL larutan DPPH 1mM dipipetkan ke dalam tabung reaksi yang
telah ditandai di strip 5 mL kemudian ditambahkan methanol pro analisis
hingga tanda yang telah dibuat dan dihomogenkan. Mulut tabung ditutup
dengan alumunium foil.
c. Pembuatan larutan uji
Sebanyak 5 mg ekstrak ditimbang, kemudian dilarutkan ke dalam 10 mL
metanol pro analisis, larutan ini merupakan larutan induk. Sebanyak
50,100,250,500 dan 1000 uL larutan induk dipipetkan kedalam tabung reaksi
yang telah ditandai pada strip 5 mL untuk mendapatkan konsentrasi
5,10,25,50 dan 100 ug/mL. kedalammasing-masing tabung ditambahkan 1 mL
larutan DPPH 1mM dan ditambahkan dengan methanol pro analisisampai 5
mL kemudian dihomogenkan. Mulut tabung ditutup dengan alumunium foil.
d. Pembuatan larutan vitamin C sebagai kontrol positif
Sebanyak 3 mg vitamin C ditimbang kemudian dilarutkan dengan methanol
pro analisis hingga 5 mL. pipet 250,200,150 dan 50 uL dimasukkan masingmasing kedalam labu yang telah diukur 5 mL dengan ditambahkan larutan
DPPH 1mM, kemudian tambahkan methanol pro analisis hingga tanda
sehingga diperoleh konsentrasi 3,6,9,12 dan 15 ug/mL.
e. Pengukuran serapan radikal bebas DPPH
Larutan uji dengan beberapa konsentrasi yang telah dibuat d inkubasi dalam
penangas air 37o C selama 30 menit. Serapan larutan diukur pada panjang
gelombang serapan maksimum 515 nm menggunakan spektrofotometer
cahaya tampak.
f. Cara perhitungan
Aktivitas penangkal radikal bebas dihitung sebagai presentase berkurangnya
warna DPPH dengan menggunakan persamaan
absorbansi sampel +absorbansi kontrol
1
100
absorbansi kontrol

Aktivitas ant ioksidan=

Dari harga persen penangkal radikal bebas yang diperoleh, kemudian dibuat
kurva antara persen penangkal radikal bebas terhadap konsentrasi larutan
uji. Dari persamaan regresi linear tersebut dapat ditentukan nilai IC 50, yaitu

konsentrasi inhibisi larutan uji yang mampu menangkal 50% radikal

bebas.23,24,25
4.10 AlurPenelitian

Pengambilan sampel
Identifikasi sampel
Pembuatan ekstraksi
Penentuan aktivitas antioksidan ekstrak

Penentuan aktivitas antioksidan Vitamin C

Etanol daun mambung dengan metode

(kontrol) dengan metode DPPH

DPPH

Gambar 4.1 Alur Penelitian.

Analisis data
4.11 Cara Pengolahan dan Analisis Data
Proses manajemen data dimulai dari verifikasi dan editing data (untuk
mengecek kelengkapan dan konsistensi data yang dikumpulkan), entri data,
pembersihan data (data cleaning) sampai data siap untuk diolah dan dianalisis
menggunakan sistem komputerisasi dengan menjaga keutuhan data tersebut.26,27
Data akan diolah menggunakan komputer dengan perangkat lunak SPSS 17.
Dengan teknik analisis regresi linear sederhana untuk menentukan nilai IC 50
yaitu nilai inhibisi yang dapat menangkal 50% radikal bebas dibandingkan
kontrol vitamin C, apabila data tidak memenuhi persyaratan untuk dilakukan
teknik analisis regresi linear sederhana, maka data akan di analisis dengan
teknik analisis probit.24,25,30,31

BAB V
HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN
1. PROSES EKSTRAKSI
Cara kerja :
Ditimbang masing-masing +/- 300 gram contoh kemudian di ekstraksi dengan cara
maserasi (tanpa panas) dengan menggunakan pelarut etanol 96% selama 24 jam dengan 3
kali ulangan (3 x 24 jam). Setiap 24 jam filtrat etanol dipisahkan kemudian dipekatkan
dengan vakum evaporator. Ekstrak pekat etanol kemudian di timbang bobotnya.
Hasil :
Jenis contoh Bobot
Akar

Ekstrak (gram)
9,06

Rendemen (%)
3,02

2. UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DENGAN METODE DPPH

Cara kerja :
1. Pembuatan larutan DPPH 0,4 mM
Sebanyak 7,9 mg DPPH (BM 394,32) ditimbang, kemudian dilarutkan dengan metanol pro
analisis hingga 50,0 mL. ditempatkan dalam botol gelap. Untuk setiap pengujian larutan
dibuat baru.
2. Pembuatan larutan blanko
Sebanyak 1 mL larutan DPPH 0,4 mM dipipet ke dalam tabung reaksi yang telah ditara 5 mL,
kemudian ditambahkan metanol pro analisis hingga tanda dan dihomogenkan. Mulut tabung
ditutup dengan aluminium foil.
3. Pembuatan larutan uji

Sebanyak 5 mg ekstrak ditimbang kemudian dilarutkan ke dalam 10,0 mL metanol pro

analisis (500 bpj), larutan ini merupakan larutan induk. Sebanyak 50, 100, 250, 500, dan
1000L larutan induk dipipet ke dalam tabung reaksi yang telah ditara 5,0 mL untuk
mendapatkan konsentrasi 5, 10, 25, 50, dan 100 g/mL.
Ke dalam masing-masing tabung ditambahkan 1,0 mL larutan DPPH 1mM dan tambahkan
dengan metanol pro analisis sampai 5,0 ml kemudian dihomogenkan. Mulut tabung ditutup
dengan aluminium foil.
4. Pembuatan larutan vitamin C sebagai kontrol positif
Sebanyak 3 mg vitamin C ditimbang kemudian dilarutkan dengan metanol pro analisis hingga
5,0 mL. Pipet 250, 200, 150, 100, dan 50 L masukkan masing-masing ke dalam labu
tentukur 5-mL dengan ditambahkan 1 mL larutan DPPH 1mM kemudian tambahkan metanol
pro analisis hingga tanda sehingga diperoleh konsentrasi 3, 6, 9, 12, 15 g/mL.
5. Pengukuran serapan peredaman radikal bebas DPPH
Larutan uji dengan beberapa konsentrasi diinkubasi dalam penangas air 37oC selama 30
menit. Serapan larutan diukur pada panjang gelombang serapan maksimum 515 nm
menggunakan Spektrofotometer cahaya tampak.
6. Cara perhitungan
Persentase inhibisi dihitung dengan rumus sebagai berikut :
Hambatan (inhibisi) = Serapan blanko Serapan sampel X 100%
Serapan blanko
Nilai IC50 (Inhibition Concetration 50) adalah konsentrasi antioksidan (g/mL) yang mampu
menghambat 50 % radikal bebas. Nilai IC50 diperoleh dari perpotongan garis antara 50%
daya hambatan dengan sumbu konsentrasi, kemudian dimasukkan ke dalam persamaan
Y=a+bX dimana Y=50 dan nilai X menunjukkan IC50. Ekstrak yang dinyatakan aktif bila
nilai IC50 kurang dari 100 g/mL.

Hasil :
Nama

Sampel
Akar

(ppm)
5
10
25
50
100
3

0.775
0.687
0.493
0.267
0.060
0.487

6
9
14
15

0.285
0.040
0.030
0.027

Vitamin

A1

A2

Inhibisi

IC50

0.735
0.685
0.495
0.267
0.064
0.487

0.755
0.686
0.494
0.267
0.062
0.487

Blanko
0.819
0.819
0.819
0.819
0.819
0.819

(%)
7.814
16.239
39.683
67.399
92.430
40.537

(ppm)
44.001

0.295
0.050
0.030
0.029

0.290
0.045
0.030
0.028

0.819
0.819
0.819
0.819

64.591
94.505
96.337
96.581

Keterangan :
K (ppm) : konsentrasi (ppm)
A1 : absorbansi simplo
A2 : absorbansi duplo
: absorbansi rata-rata
IC50 : Inhibition concentration 50

3.053

Grafik 5.1 Garis Linear Ekstrak Akar Mambung terhadap Persen Inhibisi

Grafik 5.2 Garis Linear Vitamin C terhadap Persen Inhibisi

5.2 Pembahasan
Penangkapan radikal bebas merupakan salah satu metode uji untuk menentukan
aktivitas antioksidan 28. Kemampuan suatu senyawa atau sampel uji untuk menangkap radikal
DPPH merupakan suatu indikasi bahwa senyawa/sampel uji tersebut memiliki beraktivitas
antioksidan. Penggunaan DPPH untuk metode penangkapan radikal mempunyai keuntungan,
yaitu mudah digunakan, mempunyai tingkat sensitivitas yang tinggi dan dapat menganalisis
sejumlah besar sampel dalam jangka waktu singkat.29

Parameter yang digunakan untuk uji penangkapan radikal DPPH ini adalah nilai IC 50,
yaitu konsentrasi ekstrak/ fraksi uji yang dibutuhkan untuk menangkap radikal DPPH sebesar
50%. Nilai ini diperoleh dari suatu persamaan regresi linear yang menyatakan hubungan
antara konsentrasi ekstrak/ fraksi uji dan persen penangkapan radikal bebas. Semakin kecil
nilai IC50maka semakin efektif ektrak/fraksi tersebut sebagai penangkap radikal bebas.
DPPH (1,1-diphenil-2-pikrylhydrazil)merupakan radikal bebas yang stabil pada suhu
kamar dan sering digunakan untuk mengevaluasi aktivitas antioksidan beberapa senyawa atau
ekstrak bahan alam. DPPH (1,1-diphenil-2-pikrylhydrazil)menerima elektron atau radikal
hidrogen akan membentuk molekul diamagnetik yang stabil. Interaksi antioksidan dengan
DPPH (1,1-diphenil-2-pikrylhydrazil) baik secara transfer elektron atau radikal hidrogen pada
DPPH (1,1-diphenil-2-pikrylhydrazil)akan menetralkan karakter radikal bebas dari DPPH
(1,1-diphenil-2-pikrylhydrazil)dan

membentuk

DPPH

(1,1-diphenil-2-

pikrylhydrazil)tereduksi. Jika semua elektron pada radikal bebas DPPH (1,1-diphenil-2pikrylhydrazil) menjadi berpasangan, maka warna larutan berubah dari ungu tua menjadi
kuning terang dan absorbansi pada panjang gelombang 517 nm akan hilang. Perubahan ini
dapat diukur secara stoikiometri sesuai dengan jumlah elektron atau atom hidrogen yang
ditangkap oleh molekul DPPH (1,1-diphenil-2-pikrylhydrazil)akibat adanya zat antioksidan.
Pada penelitian ini digunakan methanol sebagai pelarut DPPH. Hal ini dikarenakan
methanol dapat melarutkan Kristal DPPH dan memiliki sifat yang dapat melarutkan senyawa
yang non polar, mengingat DPPH sendiri merupakan senyawa yang non polar.
Aktivitas penangkal radikal bebas dihitung sebagai presentase berkurangnya warna
DPPH dengan menggunakan persamaan Aktivitas antioksidan=
absorbansi sampel +absorbansi kontrol
1
100
absorbansi kontrol
Dari harga persen penangkal radikal bebas yang diperoleh, kemudian dibuat kurva
antara persen penangkal radikal bebas terhadap konsentrasi larutan uji. Dari persamaan
regresi linear tersebut dapat ditentukan nilai IC50
Dari grafik 5.1 dan grafik 5.2 dapat dilihat perbedaan nilai konsentrasi minimal antara
ekstrak daun mambung (Blumea balsamifera [L.] DC) dan Vitamin C dalam menghambat
50% radikal bebas. Suatu ekstrak/fraksi dinyatakan aktiv untuk menyerap radikal bebas
apabila memiliki nilai IC50kurang dari 100 ppm. Sangat jelas terlihat bahwa daun tanaman

mambung (Blumea balsamifera [L.] DC) memiliki aktivitas yang aktiv terhadap penyerapan
radikal bebas.
Apabila dilihat dari Grafik 5.2, dimana vitamin C memiliki konsentrasi yang lebih
rendah untuk mencapai IC50, ada pertimbangan lain, dimana ekstrak etanol tumbuhan
mambung (Blumea balsamifera [L.] DC) merupakan ektrak kotor yang mana senyawa
fitokimi murni belum dipisahkan. Hal ini dapat menjadi pertimbangan terhadap hasil
penelitian ini.
5.3 Keterbatasan Penelitian
Berbagai keterbatasan selama penelitian ini diataranya adalah keterbatasan dalam
pengumpulan sampel dikarenakan akses yang sangat jauh untuk mengumpulkan sampel,
selain itu keterbatasan penyediaan peralatan dan bahan reagen penelitian juga dirasakan
peneliti sangat mempengaruhi penyusunan penelitian ini.

BAB VI
SIMPULAN DAN SARAN
6.1 Kesimpulan
1. Akar tumbuhan mambung (Blumea balsamifera) terbukti memiliki aktivitas
antioksidan .
2. Kemampuan penangkapan terhadap radikal bebas oleh akar Mambung (Blumea
balsamifera) masih lebih lemah dibandingkan vitamin C.

6.2 Saran
1. Setelah dilakukannya penelitian Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Etanol Akar
Mambung (Blumea Balsamifera) Dengan Metode DPPH ( 1,1 Diphenil-2Pikrylhydrazin) peneliti menyarankan adanya penelitian yang lebih lanjut untuk
mengetahui apakah tumbuhan ini memiliki manfaat sebagai anti malaria.
2. Perlunya sosialisasi lebih terbuka kepada masyarakat tentang manfaat tumbuhan ini.
3. Perlunya budidaya tumbuhan ini agar dapat menjadi sumber tanaman obat herbal.

BAB III
LANDASAN TEORI DAN HIPOTESIS
3.1 LandasanTeori
Pada kondisi terstetu seperti stress, hiperkolesterolemia peningkatan exercise dan
infeksi malaria, memberikan respon, dimana terjadi peningkatan radikal bebas endogen
akibat proses autooksidasi, reaksi enzimatik, fagositosis, transport electron dan oksidasi ionion logam transisi, kodisi ini akan mengakibatkan reaksi berantai. Radikal bebas yang
kekurangan electron akan mengambil pasangan electron disekitarnya sehingga proses ini
mengakibatkan injuri yang terus-menerus. Dalam kondisi ini diperlukan donor electron baik
dari endogen maupun eksogen yang disebut dengan antioksidan, pada kondisi normal tubuh
akan memproduksi antioksidan endogen seperti bilirubin,melatonin, glutation dan koenzim
Q, namun apabila terjadi peningkatan yang massive, antioksidan tubuh tidak lagi dapat
mengimbangi peningkatan radikal bebas ini sehingga dibutuhkanlah antioksidan eksogen
yang dapat berasal dari Vitamin C, Vitamin E dan flavonoid yang berasal dari tumbuhan.

Stress

Malaria

Hiperkolesterolemia

exercise
Endogen
-

Autoksidasi

Oksidasi

Enzimatik

Fagositosis

Transport elektron
dimitokondria dan

Oksidasiion-ion
logam transisi

Akar Tumbuhan
Mambung
Memil
iki
Mengakiba
tkan
terbentukn

Senyawa fenol

Radikal Bebas

Eksogen

Mencari
kekuran
gan
elektron

Sinar UV

Radiasi

Rokok

Pestisida

Memberikan donor
elektron

Antioksidan

Endogen
Peningkatan
metabolisme
Berefek
pada

Peningkatan Suhu
tubuh dan
pengeluaran H2O

Meningkatk
an
terbentukya

Kerusakan Sel

Gambar 3.1 Kerangka Teori

Eksogen

- Bilirubin

Vitamin C

- Melatonin

Vitamin E

- Glutathion

Flavonoid

3.2 KerangkaKonsep
Efek dari fagositosis parasite malaria dalah peningkatan radikal bebas yang dapat
mengakibatkan kerusakan sel, keberadaan radikal bebas ini akan dihambat oleh hadirnya
antioksidan eksogen seperti halnya flavonoid, dalam penelitian ini ekstrak etanol dari daun
mambung akan memberikan donor electron atau bersifat antioksidan sehingga dapat
menghambat kerusakan sel akibat reaksi berantai oleh radikal bebas.
Tumbuhan
Mambung (Blumea
balsamifera [L.] DC)
Batang
Malaria

Fagositosis

Radikal bebas

Daun

Akar

Ekstrak Etanol

Senyawa fenol
Antioksidan
Gambar 3.2. Kerangka Konsep Penelitian

Keterangan
= Variabel yang diteliti
= Variabel yang tidak diteliti

3.3 Hipotesis
Akar tumbuhan mambung (Blumea balsamifera [L.] DC) memiliki aktivitas
antioksidan .