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Universidad Nacional de Trujillo. Trujillo. Per

Vol 32, N 1, Enero-Junio, 2012, pp. 48-103

Antgenos del lquido seudocelmico de Ascaris

suum detectados por Western blot utilizando
IgG producidos en Oryctolagus cuniculus
Seudocelomic fluid antigens detected by Western blot technique
using IgG produced in Oryctolagus cuniculus
Deysi M. Leiva Varas1, Juan J. Colina Venegas1, Hermes Escalante2 y
Csar A. Jara2
1Exalumno

de la Escuela AP de Microbiologa y Parasitologa. 2Departamento de Microbiologa y

Parasitologa. Universidad Nacional de Trujillo. Trujillo. Per.

RESUMEN
Las infecciones por Ascaris lumbricoides y A. suum son globalmente prevalentes y deterioran la
salud de la poblacin infantil y disminuyen su capacidad cognitiva, aspecto que requiere de continuas
investigaciones, en particular en lo relacionado con el diagnstico temprano. El presente trabajo tuvo
como objetivo determinar, mediante la tcnica de Western Blot (Wb), los antgenos del liquido
pseudocelmico (LC) de Ascaris suum que inducen la produccin de anticuerpos policlonales IgG
producido en Oryctolagus cuniculus inmunizado experimentalmente. El lquido pseudocelmico fue
obtenido de ejemplares adultos hembras de A. suum extradas del intestino de Sus scrofa parasitada
naturalmente, el cual se utiliz para inmunizar, junto con el adyuvante completo e incompleto de
Freud, a un ejemplar de O. cuniculus, a fin de obtener los anticuerpos. La tcnica de Wb se hizo
siguiendo el protocolo propuesto por Tsang. Utilizando el LC tratado con dithiothreitol se encontr 12
bandas antignicas, cuyos pesos moleculares son: 102.3, 97.4 66.2, 56.2 39.8, 34.9, 28.2, 21.5, 16.9,
15.8, 14.4, y 13.1-10.7 KDa, de las cuales la 102.3, 39.8, 34.9, 28.2, 16.9, 15.8, 14.4, y 13.1-10.7 KDa
son las ms reactivas. Estos resultados permiten concluir que el lquido pseudocelmico es una buena
fuente de antgeno y que por la facilidad en su obtencin respecto de otra fuente de antgeno podra
utilizarse en el diagnstico de la ascariasis.
Palabras clave: Western blot, Ascaris lumbricoides, Ascaris suum, Sus scrofa
ABSTRACT
Infections with Ascaris lumbricoides and A. suum are globally prevalent and impair the health of
children and reduce their cognitive ability, an aspect that requires continuous research, particularly in
relation to early diagnosis. This study aimed to determine, using the technique of Western blotting
(Wb) antigens pseudocelomic fluid (PF) of Ascaris suum to induce the production of polyclonal IgG
produced in Oryctolagus cuniculus experimentally immunized. PF was obtained from adult females of
A. suum intestine naturally parasitized Sus scrofa, which was used to immunize, with complete and
incomplete Freuds adjuvant, a specimen of O. cuniculus, in order to obtain the antibodies. Wb
technique was performed following the protocol proposed by Tsang. Using the PF treated with
dithiothreitol was found 12 antigenic bands, whose molecular weights are 102.3, 97.4 66.2, 56.2 39.8,
34.9, 28.2, 21.5, 16.9, 15.8, 14.4, and 13.1-10.7 kDa, of which 102.3, 39.8 , 34.9, 28.2, 16.9, 15.8,
14.4, and 13.1-10.7 kDa are the most reactive. These results indicate that the PF is a good source of
antigen and the ease in obtaining it related to another source of antigen could be used in the diagnosis
of ascariasis.
Key words: Western blot, Ascaris lumbricoides, Ascaris suum, Sus scrofa

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INTRODUCCIN
La ascariasis es una de las helmintiasis ms frecuentes a nivel mundial y se distribuye
principalmente en regiones hmedas, tropicales y templadas donde imperan las malas condiciones
higinicas, el deficiente saneamiento ambiental, las pobres condiciones socioeconmicas y la
deficiente cultura hignico-sanitaria. Existe dos tipos de Ascariasis: la intestinal producida por los
adultos de Ascaris lumbricoides y la pulmonar ocasionada por los estadios larvales de A. lumbricoides
y A suum1,2,3,4
A. suum presenta un ciclo evolutivo directo, la hembra deposita aproximadamente 200 mil huevos
insegmentados que se eliminan junto con la materia fecal y se dispersan en el medio exterior, donde se
convierten en infectivos y se mantienen como tales por periodos superiores a cinco aos; al ser
ingeridos con agua, vegetales y alimentos contaminados las larvas de segundo estadio (L2) eclosionan
en el intestino estimulados por la temperatura corporal, niveles de anhdrido carbnico, pH y
condiciones reductoras no especificas optimas; luego, penetra la mucosa intestinal, alcanza la
circulacin porta, el hgado donde se establece temporalmente y causa una reaccin tisular
inflamatoria (manchas de leche), y luego a los pulmones donde se transforma en L3 larva de tercer y
cuarto estadio, la cual migra a la trquea y faringe para ser deglutida hacia el tubo digestivo 5,6,7,8,9. Esta
parasitosis tiene frecuencias variables en la poblacin suina y es responsable de prdidas econmicas,
por la reduccin de ganancia en el peso y el decomiso de hgados en los mataderos de cerdos14.15.16.
Las larvas del segundo estadio pueden migrar dentro de un amplio rango de huspedes, entre ellos
cerdos, pollos, conejos y ratones infectados experimentalmente al administrarles huevos con la larva
dos (L2); la penetracin y el establecimiento de un parasito en su hospedador depende de numerosos
factores, entre ellos, los factores bioqumicos y los inmunolgicos, los cuales difieren segn la
localizacin del parasito en el hospedador; ya que al ingresar es reconocido como un agente extrao
activando una serie de mecanismos inmunolgicos entre ellos, los de tipo celular y humoral que varan
considerablemente8,10,11,12.
A. suum es una especie muy parecida morfolgicamente a A. lumbricoides, sin embargo, ambas
especies se diferencian por la configuracin que tienen los dentculos de los tres labios orales y por la
secuencia de 6 nucletidos de su ADN ribosomal1; adems, se ha encontrado similitud entre las bandas
patrones de protenas extradas de la pared del cuerpo y de los rganos reproductivos de ambos
nematodos, lo que refleja su estrecha relacin gentica, apuntando a la naturaleza zoontica de la
infeccin y a la alta probabilidad de infeccin cruzada entre el ser humano y el cerdo17.
Se ha informado que animales de experimentacin inoculados con huevos larvados infectivos de A.
suum presentaron alteraciones clnicas como: respiracin rpida, ronquidos, perdida de peso; y
alteraciones histolgicas como: infiltrado por polimorfonucleares, abolicin del parnquima pulmonar,
esto es debido a la migracin de las larvas desde los capilares sanguneos hacia los alveolos
pulmonares ocasionando microhemorragias y edema16,18. Asimismo, se ha determinado, mediante
hemaglutinacin indirecta (HAI), la prevalencia de anticuerpos contra las larvas L3 y L4 de A. suum
en suero de nios de 6 a 12 aos de la ciudad de Mxico, en el cual se report un 4.6% de
seropositividad, en otro estudio se analizaron 1264 muestras de sangre detectndose el 45% de
individuos con anticuerpos IgG contra A. suum mediante el ELISA, lo que confirma la infeccin por
A. suum19,20,21,22; adems, se ha presentado casos de cuatro estudiantes infectados con las larvas de A.
suum, ocasionndoles infiltrados pulmonares con eosinofilia, asma y niveles elevados de
inmunoglobulinas IgE21; otros casos humano se presentaron en Japn detectndose mediante el Dot
Elisa35-36. Esto significa que el parasitismo por las larvas de este helminto es inespecfico y cuando se
presenta en el hunmano produce cuadro alrgicos, el Sindrome de Loeffler y encelopatas23,24,25,26.
Se ha identificado que los antgenos de excrecin/secrecin de los estadios larvarios L3 y L4 de A.
lumbricoides utilizando la tcnica de inmunoprecipitacin, tienen un peso molecular que van desde 14
a 410 KDa; tambin se ha encontrado que existe homologa entre los antgenos de excrecin/secrecin
(E/S) de los estadios larvarios de A.lumbricoides y A.suum, tanto a nivel molecular como
inmunolgico25, en otros trabajos se ha encontrado similitud antignica entre los antgenos de E/S y
Somticos de los estadios larvarios de A. lumbricoides, A. suum y Toxocara canis, caracterizndose
una reaccin cruzada entre sus componentes, ya que existe una protena de 14KDa homloga en los
tres parsitos26.

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El Western Blot es una tcnica que se est utilizando para detectar antgenos de
excrecin/secrecin (E/S) y somticos (S) de algunas parasitosis como: la equinococosis humana
usando antgenos de fluido hidatidico27, la cisticercosis usando antgenos del fluido vesicular28, la
fasciolosis usando antgenos de E/S, la anquilostomiasis usando antgenos de E/S de las larvas
filariformes de Ancylostoma duodenale30, la teniasis usando antgeno de E/S de Taenia solium31.
Particularmente en A.suum, se ha caracterizado su composicin antignica mediante extractos de la
cutcula, ovarios y tero encontrndose, bandas de 13-16 KDa y de 33-66 KDa comunes en la
mayora de ellos32 y, mediante Western Blot con antgenos de E/S y somticos de las larvas
pulmonares de A.suum, se detectaron 12 bandas antignicas de las cuales 100, 72.4, 16.9, 15.5 y 14.9
KDa fueron las bandas mas reactivas y 5 bandas antignicas poco reactivas en caso de los antgenos
somticos, reconocidas por anticuerpos de tipo IgG33.
El diagnstico de la ascariasis se realiza por examen copropasitolgico por la observacin tanto de
sus huevos fecundados como los huevos infecundos2,3,4; sin embargo, para los casos de A. suum no es
de mucha ayuda, debido a que, no detecta la presencia de los estadios larvarios. En estos casos los
mtodos serolgicos son de especial inters; por un lado, como prueba auxiliar en el diagnstico
clnico de la parasitosis y por otro, al ser utilizados en estudios epidemiolgicos, que nos permita
determinar la prevalencia de la parasitosis, asimismo, debido a la similitud antignica, como se ha
descrito, podra ser de utilidad para detectar los casos de ascariasis por A. lumbricoides en etapa de
migracin que, en algunos casos, puede afectar a los pulmones y derivar en alergias, por lo que, es ms
importante clnicamente que la intestinal.
Al mismo tiempo, como se ha sealado, se ha planteado la posibilidad de usar la tcnica de
Western Blot para el diagnstico serolgico de la ascariasis utilizando antgenos de
excrecin/secrecin de las formas adultas y de las larvas de tercer estadio (pulmonares); sin embargo,
la obtencin de stos antgenos demanda una tarea difcil en su obtencin y gastos por el costo del
medio de cultivo que est compuesto slo por aminocidos, por lo que en este trabajo se pretende usar
otra fuente de antgeno, adems, para obtener una cantidad til para inmunizar a animales de
laboratorio se requiere de miles de larvas o varios adultos ntegros y viables; a esto se adiciona que no
hay trabajos realizados, donde se haya utilizado el liquido pseudocelmico como antgeno.
Teniendo en cuenta dichas premisas, se plante una investigacin orientada a determinar los
antgenos del liquido pseudocelmico de A. suum (que por el tamao del parsito son abundantes,
fciles de obtener, incluso de nematodos recientemente muertos) mediante la tcnica de Western Blot
utilizando anticuerpos producidos en Oryctolagus cuniculus (conejo) inmunizado experimentalmente.
Se espera que debido a la naturaleza proteica y glicoproteica del lquido seudocelmico, ste induzca
la produccin de anticuerpos en el conejo que reconocen a varios antgenos.
MATERIAL Y MTODOS
Material biolgico:
10 Ejemplares adultos de Ascaris suum
1 Ejemplar de Oryctolagus cuniculus del Instituto Nacional de Salud del Per.
Obtencin de los adultos de A.suum
Se obtuvo del intestino de los cerdos infectados del camal Municipal de El Porvenir;
recolectndose 12 ejemplares de hembras adultas de A. suum en un frasco con SSF al 0.85%,
transportndose inmediatamente al laboratorio de helmintologa de la Universidad Nacional de
Trujillo.
Obtencin del lquido seudocelmico.
Los 12 ejemplares de A. suum fueron lavados cuatro veces con SSF y una con SSF ms antibitico
Gentamicina 0.5 ml/100ml y Penicilina G sdica 0.5 ml/100ml de 1.000 000 UI por cinco minutos
cada una; luego en condiciones de esterilidad y con la ayuda de una jeringa de 1ml se obtuvo el
lquido pseudocelmico; el cual fue conservado en refrigeracin a -20 C hasta ser usado.
Determinacin de concentracin de protenas
Al lquido pseudocelmico se centrifugo a 10000 rpm por 10min, luego se elimin el sedimento y
se determin la concentracin de protenas por el mtodo colorimtrico de Bradford 34.
Inmunizacin y obtencin de suero de Oryctolagus cuniculos

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Se utiliz un conejo obtenido del Bioterio del Instituto Nacional de Salud del Per (INS), al cual se
le inmuniz con 1 ml de lquido Pseudocelmico y 1 ml adyuvante completo de Freund la primera
inmunizacin y las tres restantes con adyuvante incompleto; se le inocul va subcutnea en cada una
de las caras externas e internas de las patas posteriores y en el lomo, cada 10 das.
A las cinco semanas de la primera inmunizacin se obtuvo una muestra de sangre de los conejos
por puncin cardiaca, la cual fue centrifugada a 3000 rpm por 15min para obtener el suero inmune que
fue conservado a -20C hasta es momento de su procesamiento. Las IgG fueron purificadas
parcialmente por precipitacin salina con sulfato de amonio al 33% y por dilisis de en membrana de
celulosa35,36
Deteccin de los antgenos del Lquido Pseudocelmico (LP) por la tcnica de Western Blot
La ejecucin de la tcnica y preparacin de los reactivos se realizo siguiendo metodologas
propuestas previamente28,30,33
a) Preparacin: El lquido seudocelmico fue preparado a la concentracin de 0.02 ug/uL, una
parte se trat con dithiothreitol (DDT), 0.1% de dodecil sulfato de sodio (SDS), 6% de glicerol
y 0.025% de azul de Bromofenol y la otra parte sin DDT, luego se calent a 65C por 20 min,
dejndose a temperatura ambiente antes de su uso.
b) SPS-PAGE se realizo los corridos en mini geles de 8 x 7 x 0.05 cm a la concentracin del 15%
de acrilamida del gel separador y al 3% del gel concentrador, colocando 15ul de antgeno en
cada uno de los pocillos del gel concentrador. La electroforesis se llevo a cabo a 60V en el gel
de apilamiento por 10 minutos y a 200Ven el gel separador por 50 minutos, hasta que el
colorante trazador alcance extremo inferior del gel.
c) Transferencia: Los componentes proteicos separados en el gel de poliacrilamida fueron
transferidos al papel de nitrocelulosa en una cmara de electroforesis horizontal a 100V por
espacio de dos horas y a 4C, utilizando un buffer de transferencia constituido por 0.2ml
Tris/HCL Ph 8%; 20% de metanol y agua destilada. Para ello el gel se uni con el papel de
nitrocelulosa, se cubri con papeles de filtro y esponjas que fueron colocadas en un casquete
especial, el cual fue depositado en la cmara de transferencia.
d) Revelado enzimtico de las protenas especificas: Para ello se hidrat el papel de
nitrocelulosa en PBS, luego se le aadi la solucin bloqueadora (leche descremada) con el
suero (1/60) y se incub por una hora en agitacin constante y a temperatura ambiente. Se
realiz tres lavados con PBS Tween 20 por 5 minutos cada uno en agitacin constante. Se
aadi el conjugado (Puried Goad Anti Rabit IgG Conjugate BioRad) 1/1200, se incub por una
hora en agitacin constante y se lav cuatro veces. Finalmente, el revelado se hizo agregando el
sustrato (H2O2 al 0.01% y la diaminobenzidina) por 10 minutos, la reaccin se detuvo al lavarlo
con agua destilada, despus que sec el papel de nitrocelulosa se determin los pesos
moleculares por comparacin con el marcador de bajo peso molecular conocido.
RESULTADOS
Se encontr que el lquido seudocelmico de A. suum presenta una concentracin de 7520 ug/mL;
asimismo, que cuando se utiliz a la concentracin de 0.02 para realizar el corrido electrofortico del
material tratado con Dithiotreithol (DTT) para ejecutar la tcnica de western Blot, aparecieron 12
bandas antignicas, cuyos pesos moleculares son: 102.3, 97.4 66.2, 56.2 39.8, 34.9, 28.2, 21.5, 16.9,
15.8, 14.4, y 13.1-10.7 KDa, de las cuales la 102.3, 39.8, 34.9, 28.2, 16.9, 15.8, 14.4, y 13.1-10.7 KDa
son las ms reactivas; por su parte, cuando se ejecut la tcnica con protenas sin tratar con DTT
tambin se detectaron 12 bandas antignicas, cuyos pesos moleculares son 102.3, 97.4,70.8, 63.1,
28.2-25.7, 21.5, 16.9, 15.8, 14.4, y 13.1-10.7 (Fig. 1)

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C
102.3
97.2
66.2

97.4
66.2

56.2

45.0

39.8
34.9

31.0

28.2

21.5

21.5
16.9
15.8
14.4

14.4

13.5-10.7

Fig. 1. Bandas antignicas del liquido seudocelmico de Ascaris suum detectados mediante la tcnica de
Western Blot por IgG producidos en Oryctolagus cuniculus.
A.
B.
C.

Marcador de peso molecular en Kilodaltons (KDa)

Antgenos del lquido pseudocelmico, sin tratar con dithithritol (DTT) con suero hiperinmuine
Antgenos del lquido pseudocelmico tratado con dithithreitol (DTT) con suero hiperinmune

DISCUSIN
La tcnica de Western blot en el diagnstico de enfermedades parasitarias ha venido siendo usada
con gran xito, debido a su elevada especificidad (100%) y sensibilidad (93% en algunos casos), tanto
as que se dispone de Kits para algunas de ellas, tales como cisticercosis, hidatidosis y fasciolasis 28,29;
sin embargo, hay otras enfermedades cuyas prevalencias son incluso mayores que las nombradas que
estn a la espera de poder contar con un Western blot para el diagnstico confirmativo y con un kit
comercial, como el caso de la ascariasis temprana, siendo uno de los pasos iniciales conar con una
buena fuente de antgenos. Para la obtencin de antgenos del lquido pseudocelmico se necesita
pocos ejemplares adultos de Ascaris suum; esto est en proporcin al tamao del parasito, a
comparacin de las miles de larvas que se usan para obtener antgenos de excrecin/secrecin30,33.
Al mismo tiempo, en trabajos previos se ha verificado que, tal como ha sido utilizado en la presente
investigacin, el protocolo para obtener los anticuerpos especficos, que son indispensables para
ejecutar la tcnica de Western blot, da buenos resultados; es decir, la inoculacin al conejo del liquido
seudocelomico mezclado con adyuvante completo de Freud en la primera vez y con adyuvante
incompleto en las sucesivas, asegura la produccin de suficiente cantidad de anticuerpos como para
obtener buenas lecturas30,31,32 porque en el husped conejo, que es de raza pura y se ha asegurado su

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salubilidad con un buen cuidado, funciona el fenmeno de anamnesis. El conejo, por su parte, ha
demostrado ser un excelente productor de anticuerpos para su uso en el Western blot porque, por su
tamao intermedio entre mamferos que se usan para obtener mayores cantidades de suero tiles para
usarlos como antisueros, como es el caso de cabras o caballos, y otros mamferos pequeos, como
cuyes y ratas, que producen muy poca cantidad de anticuerpos por su tamao pequeo. Adems,
favorece el depsito del antgeno en el sitio de inoculacin, liberndolo gradualmente, lo que permite
un mayor contacto con el sistema inmune originando un aumento de la estimulacin de clulas
presentadoras de antgeno logrando un estmulo persistente; su uso economiza la cantidad de
antgeno, dosis y tiempo; tambin se utiliza por su fcil manejo y por el menor nmero de efectos
adversos28,30,31. Esta inmunizacin se realiz por va subcutnea teniendo en cuenta estudios donde han
comparado la produccin de anticuerpos, inmunizando tanto por va subcutnea e intramuscular, en el
cual, demuestran que no existe diferencias entre estas dos vas de inmunizacin, siendo estas dos las
ms ptimas para producir una adecuada respuesta inmune25.
El tratamiento de los antgenos del lquido pseudocelmico con un agente reductor (DTT) de
puentes bisulfuro, se realiz con la finalidad de desnaturalizar las protenas, tal como ha sido usado en
trabajos anteriores28,29,30,31 y el hecho de haber encontrado bandas ms ntidas en relacin a cuando se
utiliz al lquido sin tratar con DTT, permite afirmar que posee una composicin proteica compleja y
que es preferible hacer el Western blot con DTT; sin embargo, el nmero de bandas fue igual: 12,
hecho que enfatiza que el uso del DTT es para simplificar la complejidad proteica, no para cambiarlas.
De las 12 bandas detectadas, algunas de ellas han sido detectadas en otras investigaciones; por
ejemplo: (i) se detect una protena de 14.4 KDa similar a la encontrada en un trabajo realizado
anteriormente, a partir de antgenos de excrecin-secrecin del estadio larvario tres (L3) de A. suum,
A. lumbricoides y Toxocara canis, mediante la tcnica de radioinmunoprecipitacion26; esto significa
que este componente es comn en los tres nematodos, todos correspondientes a la Familia
Ascarididae, y podra dar lugar a reacciones cruzadas cuando se haga el diagnstico de las parasitosis
causadas por ellos; esta banda tambin se ha encontrado en la larva 225,33, que es la que migra por los
diversos rganos de los huspedes y es, por lo tanto la principal forma patgena, entonces, igualmente,
su deteccin no tiene mucho valor diagnstico. En este mismo sentido, en otras investigaciones se han
encontrado que las bandas responsables de la reaccin cruzada son las que estn en un rango 66-55
KDa17,33. (ii) las bandas cuyo peso molecular son de 25.7, 21.5 KDa coinciden con otro trabajo en donde
se analizaron protenas de los rganos reproductores y cutcula de A. suum y A. lumbricoides25
considerndose que podra tratarse de antgenos de poca utilidad para el diagnstico especfico,
aunque s, como en estos casos para descartar la presencia de anticuerpos en un determinado
individuo, aspecto que tiene gran valor para la interpretacin del diagnstico, aunque de poca utilidad
en pases como el Per en donde el parasitismo por estos organismos es un fenmeno frecuente, (iii)
una protena cuyo peso molecular es de 16 KDa presente en el estadio larvario 3, ya que han creado
un recombinante de esta protena llamada AS 16, el cual fue reportado como protector contra la
migracin larvaria, (iv) las bandas de 39.8, 34.6, 16.9 y 14.4 que coinciden con las bandas encontradas
por Escalante y col. a partir de antgenos de excrecin / secrecin y las bandas de 39.8, 34.6 y 25.2
apartir de antgenos somticos del estadio larvario 3 de A. suum. Las bandas de 39.8 y 34.6 se han
encontrado en antgenos de E/S y S por que los antgenos E/S quedan atrapados en la cutcula y como
los antgenos somticos provienen mayormente de la cutcula, por ello que tambin se encuentran en
los antgenos somticos; esto tambin significara que parte del liquido pseudocelmico se excreta y
conformaran parte de los antgenos E/S33 y (v) Frontera17 estudio la composicin antignica de A.
suum a partir de extractos de la cutcula, ovarios y tero, mediante el SDS PAGE en donde reporto
bandas de 33-66 KDa en la mayora de los extractos, estas bandas tambin coinciden con las
encontradas en este trabajo.
CONCLUSIONES

El lquido pseudocelmico es una buena fuente de antgeno, capaz de producir una respuesta
inmune, reflejada por la deteccin de 12 bandas: 102.3, 97.4 66.2, 56.2 39.8, 34.9, 28.2, 21.5,
16.9, 15.8, 14.4, y 13.1-10.7 KDa
Las bandas ms ntidas (102.3, 39.8, 34.9, 28.2, 16.9, 15.8, 14.4, y 13.1-10.7 KDa) se obtuvo
en condiciones reductoras

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