-GLUKOSIDASE

EMEN KIMIA
AS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UT PERTANIAN BOGOR

KINETIKA
INHIBISI
SECARA
IN
ENZIM

G44100112
AMIMA AQMARINA
Pembimbing:
Dr Henny Purwaningsih, MSi
Dr Hilman Affandi

2015

EKSTRAK DAUN
Aquilaria
malaccensis
VTRO
OLEH
SEBAGAI ANTIHIPERGLIKEMIK

PENDAHULUAN

171 JUTA Orang

DIABETES
TAHUN 2000

DIABETES

DIAB ETE S
T IPE 2
Terbanyak diderita orang
90%

366 JUTA ORANG

MENINGKAT
TAHUN 2030

(Wild et al. 2004)

dari kasus diabetes yang ada

(Goldstein dan Mller-Wieland 2008)

DIABETES
TIPE
2
adalah sindrom yang disebabkan akibat kekurangan insulin
atau adanya resistensi terhadap insulin pada tingkat sel yang
mengakibatkan munculnya hiperglikemia dan glikosuria.
(Satyanaryana dan Chakrapani 2006)

INSULIN

adalah
hormon
peptida
yang
dihasilkan oleh sel- pada
pankreas yang berfungsi
sebagai pengontrol kadar
gula dalam darah.
(Lipson et al. 2006)

KARBOHIDRAT
ENZIM
-GLUKOSIDASE

Disakarida
Monosakarida
(Glukosa)

SEL

INSULIN

EN
ER
GI
DIABETES

ENZIM
GLUKOSIDASE
berperan sebagai katalis
dalam pemutusan ikatan
glikosidik dalam proses
pencernaan karbohidrat.
(Park et al. 2008)


Kompetitif
INHIBITORUnkompetitif
ZIM -GLUKOSIDASE
(Goldstein dan Mller-Wieland
2008) kompetitif
Non
Campuran

PARAMETER KINETIKA

MICHAELIS-MENTEN
Lineweaver-Burk
Eadie-Hofstee
Hanes-Woolf

INHIBITORDAUN
-GLUKOSIDASE
AQUILARIA
MALACCENSIS

Daun Aquilaria malaccensis mengandung senyawa

aromatic, ekstrak metanolnya mengandung
saponin, alkaloid, fenolik.
(Khalil et al. 2013)

TUJUAN

Tempat dan Waktu

JUAN
PENELITIAN
mengetahui
kinetika
inhibisi

enzim
glukosidase oleh ekstrak daun A. malaccensis
yang
memiliki
potensi
sebagai
antihiperglikemik berdasarkan pengujian yang
dilakukan secara in vitro.

Tempat dan Wakt

Laboratorium Natural Product

SEAMEO BIOTROP, BOGOR

BAHAN DAN ALAT

BAHAN

Ekstrak daun Aquilaria malaccensis

Buffer Fosfat
Etanol PA 96%
Bovin Serum Albumin (BSA)
-Glukosidase
P-nitrofenil--glukopiranosida (PNPG)
Natrium Karbonat

Neraca Analitki Mettler Toledo

Tabung Reaksi
Pipet Mohr
Labu Takar
Erlenmeyer
Inkubator
Spektrofotometer Ultraviolet-Tampak (UV-Vis) Beckman Coulter DU 530

ALAT

PROSEDUR

Preparasi Preparasi
Uji aktivitasEvaluasi
Larutan Larutan Inhibisi Kinetika
ekstrak
uji
enzim
enzim

LARUTAN SAMPEL
250
250
mg
mg
ekstra
ekstra
k
k

50 mL
50 mL
etanol
etanol
10 ml buffer fosfat (pH 7.0)
10 ml buffer fosfat (pH 7.0)
5
ppm
10
ppm
15
ppm
20 ppm

1 mL
1 mL

25 ppm
5000 ppm

500 ppm

LARUTAN uji

Larutan
Enzim
1 mg enzim
glukosidase

100 ml bufer fosfat (pH

7.0) yang mengandung
200 mg BSA
10 ml bufer fosfat (pH
7.0) yang mengandung
20 mg BSA

3.3
ml
Larutan
Stok enzim
0.6 U/ml

Larutan
Enzim 0.2 U/ml

LARUTAN uji
250 mL Aquades

5.30 g
Na22CO33

LARUTAN
P-NPG
10 mL bufer
fosfat (pH
7.0)

0.5
1.6mmg
M p-NPG

PNP
G

0.75
2.4
mmg
M p-NPG
1 mM

Na2CO3

3.2 mg p-NPG

1.25
4m
mg
Mp-NPG

ngujian aktivitas inhibisi

E N Z I M - G LUKOS I DAS E
r a i n v i t r o m o d i fi ka s i S a n c h e t i e t a l . 2 0 0 9

inkubasi

0.5 mL bufer fosfat

(pH 7.0)

0.1 mL sampel

0.25 mL p-NPG
0.75 mM

48 jam, 37 C

Reaksi berhenti
+ 1 mL Na2CO3
0.2 M

403 nm

Larutan

SAMPEL

0.25 mL
enzim

Absorbansi Sampel (As)

ngujian aktivitas inhibisi

E N Z I M - G LUKOS I DAS E
r a i n v i t r o m o d i fi ka s i S a n c h e t i e t a l . 2 0 0 9

inkubasi

1 mL bufer fosfat
(pH 7.0)
0.1 mL Sampel

0.25 mL p-NPG
0.75 mM

48 jam, 37 C

Reaksi berhenti
+ 1 mL Na2CO3
0.2 M

403 nm

L a r u t a n B l a n ko

SAMPEL

ENZIM
A b s o r b a n s i B L A N KO ( A B 1 )

ngujian aktivitas inhibisi

E N Z I M - G LUKOS I DAS E
r a i n v i t r o m o d i fi ka s i S a n c h e t i e t a l . 2 0 0 9

inkubasi

0.5 mL bufer fosfat

(pH 7.0)
0.1 mL Etanol
PA 96%

0.25 mL p-NPG
0.75 mM

48 jam, 37 C

Reaksi berhenti
+ 1 mL Na2CO3
0.2 M
403 nm

Larutan

KON T ROL

0.25 mL
enzim

A b s or b a n si ko n tro l (Ac )

ngujian aktivitas inhibisi

E N Z I M - G LUKOS I DAS E
r a i n v i t r o m o d i fi ka s i S a n c h e t i e t a l . 2 0 0 9

inkubasi

1 mL bufer fosfat
(pH 7.0)
0.1 mL Etanol
PA 96%

0.25 mL p-NPG
0.75 mM

48 jam, 37 C

Reaksi berhenti
+ 1 mL Na2CO3
0.2 M
403 nm

L a r u t a n B l a n ko

KONTROL

ENZIM
Absorbansi blankol (Ab2)

ngujian aktivitas inhibisi

E N Z I M - G LUKOS I DAS E
r a i n v i t r o m o d i fi ka s i S a n c h e t i e t a l . 2 0 0 9

ENGHAMBATAN AKTIVITAS ENZIM -GLUKO

Ac As Ab
100%
Inhibisi (%) =
Ac

LUASI KINETIKA INHIBISI

E N Z I M - G LUKOS I DAS E
a r a i n v i t r o ( M AY U R e t a l . 2 0 0 9 )
0.5 mL bufer fosfat
(pH 7.0)

0.1 mL sampel

0.25 mL p-NPG:
0.5 mM
0.75 mM
1 mM
1.25 mM

inkubasi

48 jam, 37 C

Reaksi berhenti
+ 1 mL Na2CO3
0.2 M

403 nm

Larutan

SAMPEL

0.25 mL
enzim

Absorbansi Sampel (vs)

LUASI KINETIKA INHIBISI

E N Z I M - G LUKOS I DAS E
a r a i n v i t r o ( M AY U R e t a l . 2 0 0 9 )
0.5 mL bufer fosfat
(pH 7.0)
0.1 mL etanol
PA 96%

0.25 mL p-NPG
0.75 mM

inkubasi

48 jam, 37 C

Reaksi berhenti
+ 1 mL Na2CO3
0.2 M

403 nm

Larutan

B L A N KO

0.25 mL
enzim

Absorbansi Sampel (vB)

LUASI KINETIKA INHIBISI

E N Z I M - G LUKOS I DAS E
a r a i n v i t r o ( M AY U R e t a l . 2 0 0 9 )

DATA [S] dan V

Lineweaver-Burk

Eadie-Hofstee

Hanes-Woolf

X: 1/[S]
Y: 1/V

X: V/[S]
Y: V

X: [S]
Y: [S]/V

PEMBAHASAN

PEMBAHASAN

dari Laboratorium Natural Product, SEAMEO BIOTROP

EKSTRAK SAMPEL

Et
Maserasi
n6 %
1, 4, 8 jam PAa 9
ol

Etil
nAsetat Heksana

8
jam
Daya ANTIOKSIDAN
tertinggi dengan IC50 :
10.6258
(Affandippm
et al. 2013)

enzim -glucosidase

EKSTRAK METANOL

Alkaloid
Saponin
Fenolik (Flavonoid, terpenoid, tanin)

(Khalil et al. 2013)

dapat dihambat oleh beberapa

senyawa fitokimia seperti a l k a l o i d (Patel et al. 2012),
t r i t e r p e n a (Lai et al. 2012), dan fl a v o n o i d (Wang et al.

A.
MAL ACCEN
INHIBITOR
-GLUKOSIDASE
SIS
ENZIM

diuji dengan

P-NPG

ABSORBANSI ?

KONSENTRASI

ABSORBANSI

maks: 4 0 3 n m

Persentase
inhibisi

Konsentr
asi
Absorb
ekstrak
ansi
(ppm)

80
f(x) = 2.71x + 4.27
60 R = 0.96
%inhibisi 40
20
0

10

15

20

25

Konsentrasi Ekstrak (ppm)

IC50 = 16.8644

30

Inhibisi
(%)

2.049

0.000

1.711

16.496

10

1.211

40.898

15

1.087

46.950

20

0.971

52.611

25

0.573 72.035

SAMPEL

IC50 (PPM)

Daun Aquilaria malaccensisa

Daun Aquilaria filariab
Gracilaria edulisc
Ulva lactucac
Daun Catharanthus roseus L.
G. Dond
Daun Basella albad
Daun Azadirachta Indica A.
Jussd
Daun Tinospora crispa Miers.d
Kuersetine

16.8644
26
46
53
36.08
493.47
21.94
68.06
10.20

PERBANDI
NGAN IC50
SAMPEL
PERCOBA
AN
DENGAN
SAMPEL

PLOT MICHAELIS-MENTEN
3.0
2.5

PERSAMAAN

2.0

Percobaan

1.5

Teoritis

1.0
0.5
0.0
0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9
[S]

1.0

1.1

1.2

1.3

PLOT
EADIE-HOFSTEE

3.00

f(x)f(x)
= 2.34x
= - 1.3x
- 2.25
+ 4.67
2.50 R R= 0.81
= 0.49

2.00
V 1.50
1.00
0.50
0.00
1.20

1.40

1.60

1.80

2.00

2.20

2.40

2.60

2.80

V/S

Larutan

R2

Km

Vmax

Kontrol

-1.3015

4.6711

0.4940

1.3015

4.6711

Dengan ekstrak 25 ppm

2.3407

-2.2532

0.8063

-2.3407

-2.2532

PLOT
Hanes-Woolf

0.80

f(x) = - 0.27x + 0.89

0.60 R = 0.64
f(x) = 0.14x + 0.34
[S]/V 0.40 R = 0.66
0.20

0.00
0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 1.00 1.10 1.20 1.30
[S]

Larutan

R2

Km

Vmax

Kontrol

0.1407

0.3428

0.6625

2.4364

7.1073

Dengan ekstrak 25 ppm

-0.2739

0.89

0.6376

-3.2494

-3.6510

Larutan

R2

Km

Vmax

Kontrol

0.2992

0.1934

0.9418

1.5470

5.1706

Ekstrak 25 ppm

0.8702

-0.2496

0.9712

-3.4863

-4.0064

2
1 f(x) = 0.87x - 0.25
1 R = 0.97
1
1/V 1
f(x) = 0.3x + 0.19
1
R = 0.94
0
0
0
1
1
1
1
1
1/[S]

PLOT
lineWeaver-BUrk

Lineweaver-Burk
Eadie-Hofstee
Hanes-Woolf

PENDEKATAN
LAINNYA

Ekstrak kasar
masih
mengandung
senyawa
metabolit
sekunder lainnya
PEMURNIAN
Dewiyanti et al. (2012)
menggunakan kuersetin sebagai
inhibitor enzim -glukosidase

SIMPULAN
&
SARAN

SIMPULAN

Ekstrak
etanol
Aquilaria
malaccensis dapat berperan
sebagai
antihiperglikemik
yang cukup baik dengan nilai
IC50 di bawah 100 ppm.
Namun, mekanisme inhibisi
enzim -glukosidase oleh
ekstrak kasar sampel belum
dapat
ditentukan
menggunakan
pendekatan
plot Lineweaver-Burk, HanesWoolf,
ataupun
EadieHofstee.

SARAN
Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk
mengetahui
senyawa
spesifik
yang
memengaruhi daya inhibisi terhadap aktivitas
enzim -glukosidase. Penentuan total fenol juga
perlu dilakukan untuk lebih memastikan adanya
gugus fenolik di dalam ekstrak tersebut.
Pendekatan
kinetika
yang
sesuai
untuk
menjelaskan mekanisme inhibisi enzim glukosidase harus ditelaah kembali dan perlu
ditelusur lebih lanjut senyawa spesifik yang
memengaruhi daya inhibisi ekstrak terhadap
aktivitas enzim -glukosidase, serta tingkat
keamanan penggunaan ekstrak. Selain itu,
dapat pula dilakukan uji lanjutan (in vivo) untuk
melihat pengaruh ekstrak terhadap mekanisme
absorpsi, metabolisme, dan ekskresi dalam

DAFTAR PUSTAKA

[Perkumpulan Endokrinologi Indonesia]. 2006. Konsensus Pengelolaan dan Pencegahan Diabetes Melitus Tipe 2 di Indonesia. Jakarta (ID): PB.
Perkeni.
Adelina N. 2004. Aquilaria malaccensis Lam. Seed Leaflet. 103.
Ahmad M, Razak A, Akowuah GA, Asmawi Z, Zhari I. 2007. HPLC profile and antihyperglycemic effect of ethanol normal and streptozotocininduced diabetic rats. J Nat Med. 61:422-429.
Akter S, Md Tanvir I, Mohd Z, Sirajul IK. 2013. Agarwood production-a multidisciplinary field to be explored in Bangladesh. Int J Pharm Life
Sci. 2(1):22-32.
Atkins PW, Paula J. 2006. Physical Chemistry. Oxford (EN): Oxford University Press.
Berg JM, Tymoczko JL, Stryer L. 2002. Biochemistry. Ed ke-5. New York (US): WH Freeman.
Campbell MK, SO Farrell. 2009. Biochemistry. Ed ke-6. Pacific Grove (CA): Thomson Brooks/ Cole.
Cheng AYY, Josse RG. 2004. Intestinal absorption inhibitors for type 2 diabetes mellitus: prevention and treatment. Drug Discovery Today:
Therapeutic Strategies. 1(2):201206.
Dash M, Jayanta KP, Prasanna PP. 2008. Phytochemical and antimicrobial screening of extracts of Aquilaria agallocha Roxb.. Afr J Biotech.
7(20):3531-3534.
Dewiyanti ID, Euis F, Megawati, Tri Y. 2012. The antidiabetic activity of cocor bebek leaves (Kalanchoe pinnata Lam.Pers.) ethanolic extract
from various areas. J Trop Life Science. 2(2):37-39.
Goldstein BJ, Muller-Weiland D. 2008. Diabetes: Principles and Practice Second Edition. New York (US): Informa HealthCare.
Katzung BG, Masters S, Trevor AJ. 2009. Basic and Clinical Pharmacology. Ed ke-11. New York (US): McGraw-Hill Medical.
Khalil AS, Rahim AA, Taha KK, Abdallah KB. 2013. Characterization of methanolic extracts of Agarwood leaves. J Appl Indust Sci. 1(3):7888.
Kumar PS, S Sudha. 2012. Evaluation of alpha-amylase and alpha-glucosidase inhibitory properties of selected seaweeds from gulf of mannar.
Int Res J Pharm. 3(8):129-130.
Lai YC, Chen CK, Tsai SF, Lee SS. 2012. Triterpenes as -glucosidase inhibitors from Fagus hayatae. Phytochemistry. 74:206-211.

Mayur B, Sancheti S, S Shruti, Seo SY. 2010. Antioxidant and -glucosidase inhibitory prpoperties of Carpesium abrotanoides L. J
Med Plant Res. 4(15):1547-1553.
Meinar, IA. 2015. Kinetika inhibisi enzim -glukosidase secara in vitro oleh ekstrak daun Aquilaria filaria sebagai antihiperglikemik
[skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Mitra R, John O, Morley SM. 2007. Medicinal plants of Malaysia. APBN. 11(2):105-110.
Moussa N et al.. 2007. Effects of oral administration of Moringa oleifera Lam on glucose tolerance in goto-kakizaki and wistar rats. J
Clin Biochem Nutr. 40:229-233.
Munim A, Katrin, Azizahwati, A Andriani, KF Mahmudah, M Mashita. 2013. Screening of -glucosidase inhibitory activity of some
Indonesian medicinal plants. J Med Arom Plants. 2(2):144-150.
Noor H, Hammonds P, Sutton R, Ashcroft SJH. 1989. The hyperglycemic and insulinotropic activity of Tinospora crispa: studies with
human and rat islets and HIT-T15 B cells. Diabetologia. 32:354-359.
Patel MB, Mishra SM. 2012. Magnoflorine from Tinospora cordiofola stem inhibits -glycosidase and is antiglycemic in rats. J Funct
foods. 4:79-86.
Sancheti S, Sandesh S, Sung YS. 2009. Chaenomeles sinensis: A potent -and -glucosidase inhibitor. Am J Pharm Toxicol. 4 (1): 8-11.
Sugiwati S, Setiasih S, Afifah E. 2009. Antihyperglycemic activity of mahkota dewa (Phaleria macrocarpa (Scheff.)Boerl.) leaf
extracts as an alpha-glucosidase inhibitor. Makara kesehatan. 13(2):74-78.
Venable SJ, Aschenbrenner DS. 2005. Drug Therapy in Nursing. Hagerstown: Lippincott Williams & Wilkins.
Wang H, Du YJ, Song HC. 2010. Alpha-glycosidase and -amylase inhibitory activities of guava leaves. Food Chem. 123:6-13.
Wild S, Roglic G, Green A, Sicree R, King H. 2004. Global prevalence of diabetes: estimates for the year 2000 and projections for
2030. Diabetes Care. 27:1047-1053

ERIMA KASIH TERIMA KASIH TERIMA KASIH TERIMA KASIH TERIMA KASIH

TERIMA KASIH
TERIMA KASIH
TERIMA KASIH