Anda di halaman 1dari 26

LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI

ISOLASI DNA

Disusun Oleh :

Disusun Oleh :
Nama

: Frelyta A. Z.

NIM

: 115040213111290

Kelompok

: Selasa, (06.00 WIB)

Asisten

: Dita Pahlevi

PROGRAM STUDI AGROEKOTEKNOLOGI


FAKULTAS PERTANIAN
UNIVERSITAS BRAWIJAYA
MALANG
2012

BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
DNA merupakan suatu materi genetik yang terbentuk dari dua
kelompok basa yang berbeda yang mengandung nitrogen, yaitu purin
dan pirimdin. Dua purin yang paling banyak terdapat dalam DNA
adalah adenin dan guanin, dan pirimidin yang umum adalah sitosin
dan timin. Purin dan pirimidin berisi beberapa ikatan ganda yang
berhubungan. Molekul molekul yang berisi ikatan demikian itu
mempunyai potensi untuk hadir dalam sejumlah struktur kimia yang
berbeda, karena atom hidrogennya mempunyai kebebasan tertentu.
Misalnya saja satu atom hidrogen dapat berpindah dari suatu
gugusan asam amino ( -NH2 ), dengan meninggalkan gugusan asam
amino ( -NH ) dan muatan negatif netto yang diserap oleh sistem
cincin molekul yang berkonjugasi. Fluktuasi kimia semacam itu
disebut pergeseran tautomer, dan struktur struktur molekul berbeda
yang dihasilkannya disebut tautomer
DNA adalah polimer bukleotida biasa bila dua nukleotida
digabungkan,molekul resultannya disebut dinukleotida bila tiga
menjadi trinukleotida bila beberapa membentuk polinukleotida.
Hanya satu gugusan fosfat dari setiap trifosfat pelopor termasuk
dalam polimer. Gugusan fosfat ini, yang terikat pada 5- karbon gula
pentosa pada satu nukleotida, juga terikata secara kimiawi pada 3karbon gula nukleotida kedua, sehingga suatu deret 5-3 pautan
fosfat mengikat nukleotida nukleotida itu menjadi satu sejauh
panjangnya polimer. Ikatan ikatan fosfat itu sangat kuat dan dikenal
sebagai ikatan ikatan ester kovalen, atau ikatan fosfodiester.
1.2 Tujuan
Untuk Mengetahui pengertian isolasi DNA dan PCR
Untuk Mengetahui Uji Kualitas DNA

Untuk Mengetahui Komponen serta Tahapan-tahapan


Isolasi DNA
Untuk Mengetahui Manfaat dari Isolasi DNA dan PCR
Untuk Memahami Tata Cara Pembuatan Isolasi DNA

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Pengertian Isolasi DNA dan PCR
Isolasi DNA merupakan proses untuk mendapatkan DNA
murni dari makhluk hidup untukkeperluan bioteknologi. Secara
spesifik untuk mengisolasi DNA yang mencangkup gen tertentu
dapat dilakukan dengan beberapa teknik, yaitu:
Isolasi DNA genom dan dilanjutkan pemotongan DNA genom
menggunakan enzim endonuklease retriksi.
Mengisolasi mRNA yang merupakan hasil transkripsi gen
yang dimaksud kemudian dilanjut dengan membuat turunan
(Complementery DNA/cDNA),
Menyintesis nukleotida yang menyusun gen tersebut
(membuat gen sintetik) dengan teknik sintesis kimiawi.
Melakukan implifikasi DNA dengan teknik (Polimerase Chain
Reaction).
(Yuwono, 2008)
Isolasi Dna merupakan suatu proses untuk mendapatkan
DNA murni yang dapat digunakan untuk keperluan pemeriksaan
atau diagnose
(Chawla,2000)
Isolasi Dna merupakan suatu proses untuk mendapatkan
DNA murni yang dapat digunakan untuk keperluan pemeriksaan
atau diagnosa. DNa dapat di isolasi dari bergabai sal yang
memiliki inti sel, karena DNA terletak di dalam inti sel. beberapa
sumber DNA yang dapat dipergunakan dalam isolasi DNA adalah
urine, darah, biopsi,rambut, gigi kuku dan lainya.
(Adityawarman, 2010)

Polymerase Chain Reaction (PCR) atau reaksi berantai


polimerase adalah metode enzimatis untuk melipatgandakan
(amplification) secara eksponensial suatu sekuen nukleotida
tertentu secara in vitro
(Anonymous,a,2012)
PCR (Polymeracse Chain Reaction) merupakan teknik untuk
meniru urutan nukleotida suatu gen dengan cara melakukan
amplifikasi DNA. Amplifikasi DNA dilakukan secara in vitro (di
dalam tabung) dengan menggunakan:

Enzim DNA polymerase


dNTP (dinukleotida triphospat)
oligonukeotida primer
molekul DNA cetakan (DNA template)

(Yuwono, 2008)

Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah metode untuk


amplifikasi (perbanyakan) primer oligonukleotida diarahkan secara
enzimatik urutan DNA spesifik. Teknik ini mampu memperbanyak
sebuah urutan 105-106-kali lipat dari jumlah nanogram DNA
template dalam latar belakang besar pada sequence yang tidak
relevan (misalnya dari total DNA genomik). (Mahmuddin, 2010)
2.2 Uji Kualitas DNA
Uji kuantitatif DNA dapat dilakukan dengan beberapa cara antara
lain :
1. Spektrofotometri Vis (Visible)
Pada spektrofotometri ini yang digunakan sebagai sumber
sinar/energi adalah cahaya tampak (visible). Cahaya visible
termasuk spektrum elektromagnetik yang dapat ditangkap oleh
mata manusia. Panjang gelombang cahaya tampak adalah 380
sampai 750 nm. Sehingga semua cahaya yang dapat dilihat oleh
kita, entah itu putih, merah, biru, hijau, atau warna apapun selama
ia dapat dilihat oleh mata, maka cahaya tersebut termasuk ke
dalam cahaya tampak (visible).

Sumber cahaya tampak yang umumnya dipakai pada spektro


visible adalah lampu Tungsten. Tungsten yang dikenal juga
dengan nama Wolfram merupakan unsur kimia dengan simbol W
dan no atom 74. Tungsten mempunyai titik didih yang tertinggi
(3422 C) dibanding logam lainnya. karena sifat inilah maka ia
digunakan sebagai sumber lampu.
(Fatimah)
2. Spektrofotometri UV- Vis (Ultraviolet Visible)
Spektrofotometri ini merupakan gabungan antara
spektrofotometri UV dan Visible. Sinar UV memiliki panjang
gelombang 190-380 nm. Karena sinar UV tidak dapat dideteksi
oleh mata kita, maka senyawa yang dapat menyerap sinar ini
terkadang merupakan senyawa yang tidak memiliki warna.
Bening dan transparan.
Oleh karena itu, sample tidak berwarna tidak perlu dibuat
berwarna dengan penambahan reagent tertentu. Bahkan sample
dapat langsung dianalisa meskipun tanpa preparasi. Namun perlu
diingat, sampel keruh tetap harus dibuat jernih dengan filtrasi atau
centrifugasi. Prinsip dasar pada spektrofotometri adalah sampel
harus jernih dan larut sempurna. Tidak ada partikel koloid apalagi
suspensi.
(Fatimah)
3. Elektroforesis
Metode elektroforesis merupakan teknik
yang dapat
digunakan untuk menggambarkan pergerakan molekul-molekul
bermuatan dalam medan listrik ke arah elektroda dengan muatan
berlawanan atau teknik yang didasarkan pada pergerakan molekul
bermuatan dalam media penyangga di bawah pengaruh medan
listrik. Media yang umum digunakan dalam elektroforesis
adalah gel agarosa, suatu polisakarida yang diekstraksi dari
berbagai jenis ganggang merah, atau poliakrilamid yang mampu
melakukan separasi DNA dengan kisaran ukuran yang luas.
Elektroforesis gel agarosa digunakan untuk memisahkan fragmen
DNA yang berukuran lebih besar dari 100 basepairs dan
dijalankan
secara
horizontal,
sedangkan
elektroforesispoliakrilamid dapat memisahkan 1 basepairs dan

dijalankan secara vertikal. Elektroforesis poliakrilamid biasanya


digunakan untuk menentukan urutan 2 DNA (sekuensing).
(Windiyastika)
Kuantifikasi dan analisa kualitas DNA/RNA diperlukan
untuk mengetahui kemurnian dan jumlah konsentrasi
DNA/RNA yang diisolasi. Kualitas DNA/RNA terbaik
menunjukkan keadaan DNA/RNA bebas dari kontaminasi
seperti kontaminasi protein dan garam yang terdapat pada
DNA/RNA yang diisolasi. Kuantitas DNA/RNA menunjukkan
konsentrasi DNA/RNA. Uji kualitas DNA dapat dilakukan
dengan cara :
1. Elektroforesis
Elektoforesis adalah teknik pemisahan komponen
atau molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat
migrasinya dalam sebuah medan listrik . Medan listrik
dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel
yang akan dipisahkan. Teknik ini dapat digunakan
dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada
makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif.
Jika molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui
suatu medium, kemudian dialiri arus listrik dari suatu
kutub ke kutub yang berlawanan muatannya maka
molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke
kutub positif. Kecepatan gerak molekul tersebut
tergantung pada nisbah muatan terhadap massanya serta
tergantung pula pada bentuk molekulnya. Pergerakan ini
dapat dijelaskan dengan gaya Lorentz, yang terkait
dengan sifat-sifat dasar elektris bahan yang diamati dan
kondisi elektris lingkungan
Secara umum, elektroforesis digunakan untuk
memisahkan, mengidentifikasi, dan memurnikan
fragmen DNA. Ada dua jenis elektroforesis yaitu :

a. Elektroforesis kertas
Elektoforesis
kertas
adalah
jenis
elektroforesis yang terdiri dari kertas sebagai
fase diam dan partikel bermuatan yang terlarut
sebagai fase gerak, terutama ialah ion-ion
kompleks. [4] Pemisahan ini terjadi akibat adanya
gradasi konsentrasi sepanjang sistem pemisahan.
[4]
Pergerakan partikel dalam kertas tergantung
pada muatan atau valensi zat terlarut, luas
penampang,
tegangan
yang
digunakan,
konsentrasi elektrolit, kekuatan ion, pH,
viskositas, dan adsorpsivitas zat terlarut.
b. Elektroforesis gel
Elektroforesis gel ialah elektroforesis yang
menggunakan gel sebagai fase diam untuk
memisahkan
molekul-molekul.
Awalnya
elektoforesis gel dilakukan dengan medium gel
kanji (sebagai fase diam) untuk memisahkan
biomolekul yang lebih besar seperti proteinprotein.
Kemudian
elektroforesis
gel
berkembang dengan menjadikan agarosa dan
poliakrilamida
sebagai
gel
media
(Anonymous,b,2012)
2. Spektrofotometer
Spektrofotometer merupakan alat yang digunakan
untuk mengukur absorbansi dengan cara melewatkan
cahaya dengan panjang gelombang tertentu pada suatu
obyek kaca atau kuarsa yang disebut kuvet. Sebagian
dari cahaya tersebut akan diserap dan sisanya akan
dilewatkan. Nilai absorbansi dari cahaya yang
dilewatkan akan sebanding dengan konsentrasi larutan di
dalam kuvet(Harahap,2007)

2.3 Komponen dan Tahapan PCR


a. Komponen PCR
Penggunaan urutan basa nukleotida berlangsung
melalui reaksi polimerisasi yang dilakukan berulang-ulang
secara berantai selama beberapa putaran (siklus). Tiap
reaksi polimerisasi membutuhkan komponen-komponen
sintesis DNA seperti untai DNA yang akan digunakan
sebagai cetakan (template), molekul oligonukleotida untai
tunggal ujung 3-OH bebas yang berfungsi sebagai
precursor (primer), sumber basa nukleotida berupa empat
macam dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), enzim
polimerase, serta larutan penyangga berupa buffer.
1. DNA template adalah DNA untai ganda yang
membawa urutan basa fragmen atau gen yang akan
digandakan. Urutan basa ini disebut juga urutan target
(target sequence). Penggandaan urutan target pada
dasarnya merupakan akumulasi hasil polimerisasi
molekul primer. Jumlah yang digunakan dalam proses
PCR tidak terlalu berpengaruh terhadap kualitas hasil
PCR, tetapi jumlah dalam ukuran pikogram sudah
cukup. Apabila target yang digunakan berupa total
DNA genome, ada baiknya kalau DNA tersebut
dipotong terlebih dahulu dengan enzim tertentu
sehingga potongan DNA yang dihasilkan masih
berukuran cukup besar, misalnya enzim SalI atau NotI
yang mempunyai sedikit situs pemotongan di dalam
total DNA genome.
2. Primer adalah molekul oligonukleotida untai tunggal
yang terdiri atas sekitar 30 basa. Polimerisasi primer
dapat berlangsung karena adanya penambahan basa
demi basa dari dNTP yang dikatalisasi oleh enzim
DNA polimerase. Namun, pada PCR enzim DNA
polimerase yang digunakan harus termostabil karena
salah satu tahap reaksinya adalah denaturasi untai
ganda DNA yang membutuhkan suhu sangat tinggi (

95C). Salah satu enzim DNA polimerase yang umum


digunakan adalah Taq DNA polimerase, yang berasal
dari bakteri termofilik Thermus aquaticus. Ada
beberapa catatan terkait dengan jumlah basa yang
digunakan dalam urutan primer apabila PCR
digunakan dalam analisis RAPD (Randomly
Amplified Polymorphic DNA), ukuran primer tidak
boleh lebih panjang dari 10 basa nukleotida. Dalam
hal ini, kita memang tidak membutuhkan penempelan
primer ke DNA target secara spesifik tetapi secara
acak (random). Biasanya, konsentrasi primer yang
dibutuhkan dalam proses PCR sekitar 1M yang
sudah cukup digunakan untuk sedikitnya 30 siklus.
Primer yang diberikan dalam konsentrasi tinggi dapat
menyebabkan penempelan pada sekuen DNA yang
salah sehingga hasil PCR yang didapatkan tidak
seperti yang diharapkan. Sebaliknya apabila primer
berkonsentrasi rendah, proses PCR tidak dapat
berjalan secara efisien, karena hasil amplifikasi yang
diperoleh akan sangat sedikit. Penentuan konsentrasi
primer secara tepat kadang-kadang harus melalui uji
coba dengan menggunakan primer pada konsentrasi
sangat rendah sampai konsentrasi sangat tinggi.
3. Enzim Taq Polymerase yang beredar saat ini terdiri
atas dua macam, yaitu enzim alami (native) yang
diisolasi dari sel bakteri Thermus aquaticus dan enzim
rekombinan yang disintesis di dalam sel bakteri E.
coli. Pada dasarnya tidak ada perbedaan di antara
keduanya sehingga kita dapat menggunakan keduanya.
Konsentrasi enzim yang dibutuhkan tidak lebih dari 1
unit. Penggunaan 0,3 unit enzim masih memberikan
hasil PCR yang berkualitas baik. Namun demikian,
konsentrasi
enzim
yang
berlebihan
dapat
menyebabkan amplifikasi DNA pada sekuen yang
bukan target.
4. Deoxyribonucleoside
Triphosphate
(dNTPs)
merupakan material utama yang dibutuhkan untuk

sintesis DNA baru dalam proses PCR. Konsentrasi


yang dibutuhkan sebanyak 200M untuk tiap dNTP
yang terdiri atas dATP, dGTP, dCTP, dTTP. Material
ini tersedia dalam bentuk campuran keempat dNTP
tersebut atau dalam bentuk terpisah satu sama lain.
5. Larutan penyangga (buffer) yang biasa digunakan
untuk reaksi PCR mengandung 10 mM Tris-HCl pH
8,3 50 mM KCl dan 1,5mM MgCl2. Keberadaan ion
Mg sangat penting dan perlu disesuaikan
konsentrasinya apabila ada perubahan konsentrasi
pada DNA target atau primer atau dNTP.
b. Tahapan PCR
Tiap putaran reaksi PCR terdiri atas tiga tahap, yaitu
denaturasi template, penempelan primer (annealing) dan
polimerisasi primer yang masing-masing berlangsung pada
suhu lebih kurang 95C, 50C dan 70C. Pada tahap
denaturasi, pasangan untai DNA template terpisah satu
sama lain karena terputusnya ikatan hidrogen antar basabasanya
sehingga
menjadi
untai
tunggal.
Pada tahap selanjutnya, masing-masing untai tunggal akan
ditempeli primer. Jadi, ada dua buah primer yang masingmasing menempel pada untai tunggal DNA template.
Biasanya, kedua primer tersebut dinamakan primer maju
(forward primer) dan primer mundur (reverse primer).
Sepasang primer tersebut akan berhibridisasi menjadi
sekuen komplementer pada untai tunggal DNA. Pasangan
primer tersebut dipilih sedemikian rupa agar satu primer
bersifat komplementer terhadap salah satu ujung gen yang
diinginkan pada salah satu rantai. Sementara itu, primer
kedua bersifat komplementer dengan ujung yang lainnya
pada untai DNA yang satu lagi.
Primer akan membentuk ikatan hidrogen dengan
sekuen komplementernya sehingga terbentuklah molekul
untai
ganda
yang
stabil.
Setelah menempel pada untai DNA template, primer
mengalami polimerisasi mulai dari tempat penempelannya
hingga ujung 5 DNA template (ingat: polimerisasi DNA

selalu berjalan dari ujung 5 ke ujung 3 atau berarti dari


ujung 3 ke ujung 5 untai template nya). Dengan demikian,
pada akhir putaran reaksi pertama akan diperoleh dua
pasang untai DNA jika DNA template awalnya berupa
sepasang untai DNA.
Pasangan-pasangan untai DNA yang diperoleh pada
suatu akhir putaran reaksi akan menjadi template pada
putaran reaksi berikutnya. Begitu seterusnya hingga pada
putaran yang ke n diharapkan akan diperoleh fragmen DNA
pendek sebanyak 2n-2n. Fragmen DNA pendek yang
dimaksudkan adalah fragmen yang ukurannya sama dengan
jarak antara kedua tempat penempelan primer. Fragmen
pendek inilah yang merupakan ukuran target yang memang
dikehendaki untuk digandakan (diamplifikasi).(Heldt,2005)
Berikut susunan struktur kimia komponen penyusun DNA:
Baik purin ataupun pirimidin yang berkaitan dengan deoksiribosa
membentuk suatu molekul yang dinamakan nukleosida atau
deoksiribonukleosida yang merupakan prekursor elementer untuk
sintesis DNA.Prekursor merupakan suatu unsur awal
pembentukan senyawa deoksiribonukleosida yang berkaitan
dengan gugus fosfat.DNA tersusun dari empat jenis monomer
nukleotida.
Keempat basa nitrogen nukleotida di dalam DNA tidak
berjumlah sama rata.Akan tetapi, pada setiap molekul DNA,
jumlah adenin (A) selalu sama dengan jumlah timin (T).Demikian
pula jumlah guanin (G) dengan sitisin(C) selalu sama.Fenomena
ini dinamakan ketentuan Chargaff.Adenin (A) selalu berpasangan
dengan timin (T) dan membentuk dua ikatan hidrogen (A=T),
sedagkan sitosin (C) selalu berpasangan dengan guanin (G) dan
membentuk 3 ikatan hirogen (C = G).
Stabilitas DNA heliks ganda ditentukan oleh susunan basa
dan ikatan hidrogen yang terbentuk sepanjang rantai
tersebut.karean perubahan jumlah hidrogen ini, tidak
mengherankan bahwa ikatan C=G memerlikan tenaga yang lebih

besar untuk memisahkan. DNA merupakan makromolekul yang


struktur primernya adalah polinukleotida rantai rangkap
berpilin.Sturktur ini diibaratkan sebagai sebuah tangga.Anak
tangganya adalah susunan basa nitrogen, dengan ikatan A-T dan
G-C.Kedua tulang punggung tangganya adalah gula
ribosa.Antara mononukleotida satu dengan yang lainnya
berhubungan secara kimia melalui ikatan fosfodiester.
(Anonimous, 2012)
Deoxyribonucleic acid (DNA) merupakan senyawa kimia
yang paling penting dalam makhluk hidup. DNA merupakan
senyawa yang mengandung informasi genetik makhluk hidup dari
satu generasi ke generasi selanjutnya (Suryo 2004: 57).
Keseluruhan DNA dalam suatu sel akan membentuk genom.
Genom meliputi bagian gen yang fungsional maupun non-fungsional
dalam

sel

organisme.

DNA

genom

meliputi

gen

danintergen(Campbell dkk.2004:221).
DNA organisme prokariot dan eukariot mempunyai perbedaan
bentuk. Organisme prokariot memiliki DNA berbentuk sirkular,
sedangkan organisme eukariotik mempunyai DNA berbentuk linier.
DNA eukariot terletak dalam inti sel, sedangkan DNA prokariot
terletak dalam sitoplasma (Jusuf 2001:7).
Struktur DNA pertama kali dijelaskan oleh James Watson dan
Francis Crick. Mereka memperoleh model DNA dari hasil foto
difraksi sinar X yang dibuat oleh Rosalind Franklin dan Maurice
Wilkins. Watson dan Crick menyimpulkan bahwa struktur DNA
merupakan rantai ganda (double helix). Untai ganda tersusun dari

dua rantai polinukelotida yang terpilin. Kedua rantai memiliki


susunan antiparalel, yaitu satu rantai berorientasi dari ujung 5 ke
3sedangkan yang lain berorientasi ujung 3 ke 5. Ujung 5
merupakan ujung yang berakhir dengan gugus 5-fosfat dan ujung 3
berakhir dengan gugus OH. Kedua rantai dihubungkan dengan ikatan
hidrogen yang memghubungkan kedua basa nitrogen (Sadava
dkk.2004:218--220).
Komponen nukleotida DNA adalah gula, fosfat, dan basa
nitrogen. Komponen gula pada DNA adalah gula deoksiribosa, yaitu
gula ribose yang kehilangan satu atom oksigen. Basa yang ada pada
DNA ada dua macam, yaitu purin dan pirimidin. Purin terbagi lagi
menjadi dua macam, yaitu adenin dan guanin. Pirimidin terdiri dari
dua jenis, yaitu timin dansitosin (Sadava dkk.2004:219).
2.4 Manfaat PCR
Manfaat dari PCR yaitu, keragaman genetik tanaman
(kekerabatan), seleksi :
1. Isolasi Gen
Untuk mengisolasi gen, diperlukan DNA pencari
atau dikenal dengan nama probe yang memiliki urutan basa
nukleotida sama dengan gen yang kita inginkan. Probe ini
bisa dibuat dengan teknik PCR menggunakan primer yang
sesuai dengan gen tersebut.
2. DNA Sequencing
Urutan basa suatu DNA dapat ditentukan dengan
teknik DNA Sequencing, metode yang umum digunakan saat
ini adalah metode Sanger (chain termination method) yang
sudah dimodifikasi menggunakan dye-dideoxy terminator,

dimana proses awalnya adalah reaksi PCR dengan pereaksi


yang agak berbeda, yaitu hanya menggunakan satu primer
(PCR biasa menggunakan 2 primer) dan adanya tambahan
dideoxynucleotide yang dilabel fluorescent. Karena warna
fluorescent untuk setiap basa berbeda, maka urutan basa
suatu DNA yang tidak diketahui bisa ditentukan.
3. Forensik
Jika identifikasi secara fisik sulit atau tidak mungkin lagi
dilakukan, maka pengujian DNA adalah pilihan yang tepat. DNA
dapat diambil dari bagian tubuh manapun, kemudian dilakukan
analisa PCR untuk mengamplifikasi bagian-bagian tertentu DNA
yang disebut fingerprints alias DNA sidik jari, yaitu bagian yang
unik bagi setiap orang.
4. Diagnosa Penyakit
PCR merupakan teknik yang sering digunakan. Teknologi
saat ini memungkinkan diagnosa dalam hitungan jam dengan
hasil akurat. Disebut akurat karena PCR mengamplifikasi daerah
tertentu DNA yang merupakan ciri khas virus Influenza A
(H1N1) yang tidak dimiliki oleh virus atau makhluk
lainnya(Clark,2008)
PCR (Polymerase Chain Reaction) merupakan suatu teknik
perbanyakan (amplifikasi) potongan DNA secara in vitro pada
daerah spesifik yang dibatasi oleh dua buah primer
oligonukleotida. Primer yang digunakan sebagai pembatas daerah
yang diperbanyak adalah DNA untai tunggal yang urutannya
komplemen dengan DNA templatnya. Proses tersebut mirip
dengan proses replikasi DNA secara in vivo yang bersifat semi
konservatif.
PCR memungkinkan adanya perbanyakan DNA antara dua
primer, hanya di dalam tabung reaksi, tanpa perlu
memasukkannya ke dalam sel (in vivo). Pada proses PCR
dibutuhkan DNA untai ganda yang berfungsi sebagai cetakan

(templat) yang mengandung DNA-target (yang akan


diamplifikasi) untuk pembentukan molekul DNA baru, enzim
DNA polimerase, deoksinukleosida trifosfat (dNTP), dan
sepasang primer oligonukleotida. Pada kondisi tertentu, kedua
primer akan mengenali dan berikatan dengan untaian DNA
komplemennya yang terletak pada awal dan akhir fragmen DNA
target, sehingga kedua primer tersebut akan menyediakan gugus
hidroksil bebas pada karbon 3. Setelah kedua primer menempel
pada DNA templat, DNA polimerase mengkatalisis proses
pemanjangan kedua primer dengan menambahkan nukleotida
yang komplemen dengan urutan nukleotida templat. DNA
polimerase mengkatalisis pembentukan ikatan fosfodiester antara
OH pada karbon 3 dengan gugus 5 fosfat dNTP yang
ditambahkan. Sehingga proses penambahan dNTP yang
dikatalisis oleh enzim DNA polimerase ini berlangsung dengan
arah 53 dan disebut reaksi polimerisasi. Enzim DNA
polimerase hanya akan menambahkan dNTP yang komplemen
dengan nukleotida yang terdapat pada rantai DNA templat.
(Mahmuddin,2010)
1. Untuk mengetahui keragaman genetik; Hal ini penting diketahui
untuk proses persilangan, sehingga di dapat varietas unggul, jika
keragaman tinggi maka kekerabatannya akan semakin tinggi, begitu
pula sebaliknya.
2. Seleksi; Untuk memilih tanaman yang sifatnya sesuai dengan yang
diinginkan. Mas (Marker Assisted Selection) : penanda pembantu
seleksi. Keuntungan seleksi dengan PCR yaitu mampu menyeleksi
dalam waktu cepat, tidak perlu menunggu hingga tanaman dewasa.
3. Uji kemurnian benih; Uji perlindungan varietas tanaman agar hak
paten benih tidak dibajak oleh orang lain (Puspita, 2010).

BAB III
METODOLOGI
3.1 Alat dan Bahan + Fungsi
a. Alat
Mikropipet
:Untuk mengambil larutan bufer
Oven
:Untuk proses inkubasi
Sentrifuge
:Untuk memisahkan partikel ringan
dan partikel padat berdasarkan berat molekul.
Vortex
:Untuk menghomogenkan larutan
Pistil dan Mortar
:digunakan untuk menghaluskan
bahan
Tabung eppendorf
:untuk meletakan larutan bahan
sebagai analisa DNA
Lemari Es
:Untuk meletakan alkohol
Timbangan Analitik
:Menimbang bahan
Camera
:Dokumentasi praktikum
Alat Tulis
:Mencatat hasil praktikum
Spatula
:Memasukkan bahan ke tabung
eppendorf
Tissue
:Membersihkan alat

b.

Bahan
Nitrogen cair
Alkohol
Isopropanol
PVP
Buffer CATB
B-mercaptoetanol
Chisam
Buffer TE
Wash buffer
Kubis
Rnase

: Melisiskan dinding sel


: Sterilisasi alat
: Membantu presipitasi DNA
: menghilangkan fenol
: menjaga agar DNA tidak rusak
: menjaga agar DNA tidak rusak
: Menghilangkan kontam protein
: Untuk melarutkan DNA
: Mencuci DNA
: sebagai bahan untuk diamati DNA
: Menjaga DNA agar tidak rusak

3.2 Langkah Kerja + Dokumentasi


3.2.1 Langkah Kerja (Diagram Alir)

Tambahkan 500 mikrolit chisam

Sentrifuge 10.000 rpm selama 10 menit

Ambil supernatan
(bagian atas pada bagian tabung eppendorf)

Tambahkan 500 mikrolit chisam

Sentrifuge 10.000 rpm kembali selama 10 menit

Isopropanol 0,45 x volume


supernatan lalu inkubasi frezzer selama 30 menit

Sentrifuge 10.000 rpm selama 10 menit

Berikan wash buffer 200 mikrolit sebanyak 2 kali lalu


dikeringanginkan

Berikan buffer TE sebanyak 10-50 mikrolit (resuspensi DNA)

Tambahkan Rnase 1 mikrolit inkunasi pada suhu 370 C

Simpan

3.2.2 Dokumentasi

3.3 Analisa Perlakuan


Dalam praktikum bioteknologi dengan materi Isolasi DNA
ada beberapa langkah yang dilakukan . Langkah pertama yaitu
timbang sampel 0,3 g kemudian tambahkan PEP(Polifinil
pirolida) dimana senyawa ini merupakan agen pengikat
polifenol. Kemudian tambahkan N2 cair yang berguna untuk
proses lisis dinding sel . Haluskan jika sudah halus masukkan
dalam tabung ependof. Tambahkan buffer CATB ( Cettil
Trimettil Amonium Bromida) 1000 l untuk menjaga DNA agar
tidak rusak.
Kemudian
tambahkan
-mercophoethanol
untuk
mengaktifkan kerja dari CTAB selain itu juga dapat
menghilangkan kontam dari polisakarida . Lakukan vorteks yang
berfungsi untuk menghomogenkan. Kemudian lakukan inkubasi
dengan menggunakan waterbatt. Lalu tambahkan 500 ml chisam
yang terbuat dari kloroform dan isoamil alcohol dengan
pebandingan 4:1 . Kemudian sentrifuge 1000 rpm sehingga akan
didapatkan supenatan(fase yang paling atas), DNA dan fase
organik(pecahan organel sel). dan ambil supernatan.
Tambahkan 500 ml chisam kemudian sentrifuge 1000 rpm
Kemudian tambahkan iso propanol dingin 0,45 vol kemudian
dilakukan intesifitasi dan lakukan inkubasi pada freezer 30.
Sentrifuge 1000 rpm 1o menit dan akan didapatkan
DNA,Debrish, dan Chisam.
Wash buffer 200 ml selama 2 kali dan dikeringanginkan dan
tambahkan buffer TE 10,50 ml untuk resuspensi DNA atau
melarutkan DNA , Tambahkan R.Nase 1 ml dan lakukan
inkubasi dengan suhu 37C selama 30 menit dan simpan. Namun
untuk perlakuan ini kami tidak melakukan karena waktunya yang
relatif panjang.

BAB IV
PENUTUP
4.1 Kesimpulan
Isolasi DNA merupakan serangkaian proses yang
dilakukan untuk mendapatkan DNA murni dari suatu
tanaman. Untuk langkah kerja nya terdiri dari beberpa
langkah .
Dalam praktium yang dilakukan dapat disimpulkan
bahwa isolasi DNA murni yang digunakan sebagai bahan
untuk bioteknologi memerlukan biaya yang sangat besar.
Sehingga sangat tidak memungkinkan jika dilakukan
praktikum untuk setiap mahasiswa langsung praktik
mengisolasi secara sendiri-sendiri. Selain itu juga untuk
menghindari
kegagalan dalam isolasi agar
tak
mengakibatkan isolasi mubazir sehingga terjadi kerugian.
Untuk itu dalam praktikum didampingi dengan asisten.
Hasil praktikum isolasi DNA secara murni ini
walaupun menghabiskan dana yang sangat besar namun
didapatkan hasil yang sangat baik dalam pengisolasian
DNAnya. Sehingga untuk peneliti dalam bidang
bioteknologi tidak merasa dirugikan dengan hasil yang
maksimal.
4.2 Saran
Perlu adanya perlengkapan alat lagi atau fasilitas
untuk praktikum sehingga praktikum dapat berjalan dengan
efektif
Semangat terus !!!

DAFTAR PUSTAKA
Aditya.2010.
Definisi
Isolasi
DNA.http://sharkestaditya.blogspot.com/2010/03/isolasidna.html#!/2010/03/isolas
i-dna.html.
Fatimah, Nur. Tanpa Tahun. Uji Kuantitatif DNA. PBT ahli pertama.
Heldt, H. W. 2005. Plant Biochemistry. Third Edition. Elsevier
Academic Press. California.
Mahmuddin,
2010.
Polymerase
Chain
Reaction (PCR).
http://mahmuddin.wordpress.com/2010/08/31/polymerasechain-reaction-pcr/. Diakses tanggal 30 November 2012.
Puspita, 2010. Isolasi DNA. http:// puspitt.multiply.com/
journal/item/14/ISOLASI_DNA?&show_interstitial=1&u=%2
Fjournal%2Fitem.
Windiastika, gati. Tanpa Tahun. Metode Uji Kualitatif DNA Dengan
Elektroforesis Gel Agarosa. Balai Besar Perbenihan dan Proteksi
Tanaman Perkebunan Surabaya. Surabaya
Anonymous,a,2012.DefinisiPCR(http://arifin.blogspot.com/definisiP
CR/09/10/2010) Diakses 29 November 2012
Anonymous,b,2012.UjiKualitasDNA(http://Junesblogspot.com/17/0
5/2008)Diakses 29 November 2012
Chawla,H.S.2003.Plant Biotechnology : A Practical Approach.
Science publisher.Inc Plymouth
Clark, W. dan K. Christopher. 2008. An Introduction to DNA :
Spechtrophotometry, Degradation, and the Frangekel
Eksperimen http://www. zoo. utoronto. ca/ able/ volumes/ vol22/5-clark. pdf. Tanggal akses 20 Oktober 2007.

Harahap. 2007. spektrofotometer panjang gelombang 230.


jurnal.farmasi.ui.ac.id/pdf/2006/v03n02/hayun0302.pdf. tanggal
akses 26 Maret 2008.

LAMPIRAN
Ini merupakan hasil pengujian kuantitas dari hasil