BAB II

METODOLOGI PENELITIAN
2.1 Waktu dan tempat penelitian
Penelitian dilakukan di Laboratorium Penelitian Fakultas Farmasi
Universitas Sumatera Utara Medan pada tanggal 20 Oktober 2010 sampai tanggal
15 Nopember 2010.
2.2 Alat-alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah satu unit alat
KCKT lengkap (Hitachi) dengan pompa (L-2130), degasser (DGU 20 AS),
injektor Autosampler L-2200, kolom C18 (250 mm x 4,60 mm), detektor UV-Vis
L-2420, wadah fase gerak, vial Autosampler, Sonifikator (Branson 1510), pompa
vakum (Gast DOA - P604 BN), neraca analitik (mettler Toledo), membran filter
PTFE 0,5 m dan 0,2, cellulose nitrat membran filter 0,45 m, Spektrofotometer
UV-Vis (Shimadzu Mini 1240). Spektrofotometer FTIR (Shimadzu IR Prestige21) DRS 8000 ( Diffuse Reflecttance measuring).
2.3 Bahan-bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian yaitu metanol untuk
HPLC(Baker

Analyzed),

aquabidestilata

(PT.

Ikapharmindo

Putramas),

Propranolol HCl BPFI (Badan POM RI), Propranolol HCl baku pabrik (PT. Kimia
Farma), Tablet generik Propranolol HCl (PT. Kimia Farma), Propranolol HCl
(PT. Dexamedica), tablet Farmadral (PT. Fahrenheit).

Universitas Sumatera Utara

2.4 Pengambilan sampel

Pengambilan sampel secara purposif yaitu tanpa membandingkan antara
satu tempat dengan tempat yang lain, karena tempat pengambilan sampel
dianggap homogen. Menurut Sudjana (1989), Sampling purposif dikenal juga
sebagai sampling pertimbangan, terjadi apabila pengambilan sampel berdasarkan
atas pertimbangan peneliti. Sampel yang digunakan adalah

tablet generik

(PT.Kimia Farma dan PT. Dexamedica), tablet Farmadral (PT. Fahrenheit).

2.5 Prosedur Penelitian
2.5.1 Uji Identifikasi Baku Propranolol HCl Menggunakan FTIR
Uji

identifikasi baku

Propranolol HCl dapat

dilakukan dengan

menggunakan spektrofotometer FTIR, yaitu dengan cara dicampur 1 mg serbuk

Propranolol HCl dengan 100 mg serbuk KBr dalam lumpang, digerus hingga
halus dan homogen, campuran tersebut diletakkan pada sampel pan kemudian
dipasangkan pada DRS 8000 dan dianalisa pada bilangan gelombang 4000-500
cm-1.
2.5.2 Penentuan Panjang Gelombang Maksimum
Sejumlah lebih kurang 50 mg Baku Pembanding Propranolol HCl
ditimbang seksama, dimasukkan kedalam labu tentukur 100 ml, dilarutkan dengan
metanol lalu dicukupkan sampai garis tanda dengan metanol dan dikocok
homogen, sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 500 mcg/ml, larutan
induk baku I (LIB I). Dipipet sebanyak 5 ml LIB I, dimasukkan ke dalam labu
tentukur 25 ml, dilarutkan dengan metanol lalu dicukupkan sampai garis tanda
dengan metanol dan dikocok homogen, sehingga diperoleh larutan dengan
konsentrasi 100 mcg/ml, larutan induk baku II (LIB II).

Universitas Sumatera Utara

Kemudian dipipet sebanyak 0,2 ml LIB II, dimasukkan ke dalam labu

tentukur 10 ml, dilarutkan dengan metanol lalu dicukupkan sampai garis tanda
dengan metanol dan dikocok homogen, sehingga diperoleh larutan dengan
konsentrasi 20 mcg/ml.
2.5.3 Pembuatan fase gerak Metanol Air
Metanol 500 ml disaring dengan menggunakan membran filter PTFE 0,5
m dan diawaudarakan selama 20 menit.
Aquabidestilata 500 ml disaring dengan menggunakan sellulosa nitrat
membran filter 0,45 m dan diawaudarakan selama 20 menit.
2.5.4 Pembuatan pelarut
Pelarut dibuat secara kuantitatif dari larutan metanol dan akuabidestilata
dengan perbandingan yang sama seperti perbandingan fase gerak hasil optimasi.
Pelarut lalu disaring dengan penyaring membran sellulosa nitrat 0,45 m dan
diawaudarakan selama 20 menit.
2.5.5 Pembuatan Larutan Induk Baku Propranolol HCl BPFI
Menurut Farmakope Indonesia (1995), Sejumlah 50 mg Baku Pembanding
Propranolol HCl ditimbang seksama, dimasukkan kedalam labu tentukur 100 ml,
ditambah pelarut aduk hingga homogen, lalu dicukupkan sampai garis tanda,
maka diperoleh larutan dengan konsentrasi 500 mcg/ml (LIB )
2.5.6 Penyiapan alat Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Masing-masing unit diatur, kolom yang digunakan kolom C18 (250 x 4,60
mm), detektor UV-Vis L-2420, dengan laju alir 1 ml/menit, sensitifitas 1.000
AUFS dan dideteksi pada panjang gelombang 290 nm.

Universitas Sumatera Utara

Setelah alat KCKT dihidupkan, maka pompa dijalankan dan fase gerak
dibiarkan mengalir selama 30 menit sampai diperoleh garis alas yang datar,
menandakan sistem tersebut telah stabil.
2.6 Penentuan Kualitatif dan Kuantitatif Propranolol HCl menggunakan
KCKT
2.6.1 Uji Kualitatif Propranolol HCl menggunakan KCKT
2.6.1.1 Penentuan perbandingan fase gerak
Dipipet 2 ml Larutan Induk Baku Propranolol HCl dan masukkan dalam
labu tentukur 50 ml, dicukupkan dengan pelarut hingga garis tanda, kocok
sehingga diperoleh larutan Propranolol HCl dengan konsentrasi 20 mcg/ml,
disaring dengan membran filter PTFE 0,2 l dan diawaudarakan selama 20 menit,
kemudian diinjeksikan ke dalam sistem KCKT menggunakan vial autosampler
sebanyak 10 l, menggunakan fase gerak metanol - air dengan perbandingan
(60:40), (70:30), dan (75:25), laju alir 1 ml/menit dan dideteksi pada panjang
gelombang 290 nm. Kemudian dipilih perbandingan fase gerak yang memberikan
data yang terbaik.
2.6.1.2 Menentukan waktu tambat Propranolol HCl BPFI
Larutan Induk Baku Propranolol HCl dipipet 2 ml masukkan dalam labu
50 ml, ditambah dengan pelarut dan dikocok hingga homogen lalu dicukupkan
sampai garis tanda. Maka diperoleh larutan Propranolol HCl dengan konsentrasi
20 mcg/ml.
Larutan disaring dengan membran filter PTFE 0,2 l dan diawaudarakan
selama 20 menit, diinjeksikan ke dalam sistem KCKT menggunakan vial
autosampler sebanyak 10 l menggunakan perbandingan fase gerak dan laju alir

Universitas Sumatera Utara

yang memberikan pemisahan yang terbaik, kemudian dicatat masing-masing

waktu tambatnya.
2.6.1.3 Identifikasi sampel
Larutan sampel Propranolol HCl sediaan tablet dengan konsentrasi 20
mcg/ml, disuntikkan kesistem KCKT menggunakan vial autosampler sebanyak 10
l pada kondisi kromatogafi yang sama dengan BPFI. Kemudian waktu tambat
masing-masing tablet dibandingkan dengan waktu tambat Propranolol HCl BPFI.
Apabila waktu tambat sampel hampir sama dengan waktu tambat BPFI, maka
sampel tablet mengandung Propranolol HCl.
2.6.2 Penentuan Kuantitatif Propranolol HCl menggunakan KCKT
2.6.2.1 Pembuatan Kurva Kalibras Propranolol HCl BPFI
Larutan Induk Baku Propranolol HCl dipipet sebanyak 1 ml, 1,5 ml, 2 ml,
2,5 ml dan 3 ml, dimasukkan dalam labu tentukur 50 ml, ditambah pelarut, kocok
hingga homogen dan dicukupkan sampai garis tanda. Maka diperoleh konsentrasi
10 mcg/ml, 15 mcg/ml, 20 mcg/ml, 25 mcg/ml, 30 mcg/ml. Kemudian masingmasing larutan disaring dengan membran filter PTFE 0,2 m dan diawaudarakan
selama 20 menit, diinjeksikan kesistem KCKT menggunakan vial autosampler
sebanyak 10 l pada kondisi kromatogafi yang sama dengan BPFI, dengan laju
alir 1 ml/menit dan dideteksi pada panjang gelombang 290 nm. Selanjutnya dari
luas area yang diperoleh dibuat kurva kalibrasi, dihitung persamaan regresi dan
faktor korelasinya.
2.6.2.2 Penetapan kadar sampel
Menurut Rohman (2007), penetapan kadar sampel dilakukan dengan cara
menimbang 20 tablet yang mengandung Propranolol HCl kemudian digerus,

Universitas Sumatera Utara

ditimbang sejumlah serbuk tablet setara dengan 50 mg Propranolol HCl (sebanyak

6 kali perlakuan). Masing-masing dimasukkan kedalam labu tentukur 100 ml,
dilarutkan dengan pelarut sampai garis tanda. Maka diperoleh larutan dengan
konsentrasi 500 mcg/ml Propranolol HCl, kemudian saring dengan kertas saring
10 % filtrat pertama dibuang. Dari keenam larutan masing-masing dipipet 2 ml
dimasukkan kedalam labu tentukur 50 ml, kocok hingga homogen dan
dicukupkan sampai garis tanda. Maka diperoleh larutan dengan konsentrasi 20
mcg/ml Propranolol HCl. Masing-masing larutan tersebut disaring dengan
membran filter PTFE 0,2 l dan diawaudarakan selama 20 menit, kemudian
diinjeksikan ke sistem KCKT menggunakan vial autosampler sebanyak 10 l.
dideteksi pada panjang gelombang 290 nm dengan laju aliran 1 ml/menit dan
dihitung kadarnya.
Kadar dapat dihitung dengan mensubtitusikan luas area sampel pada Y dari
persamaan regresi : Y = aX + b.
2.6.3 Penentuan Uji Validasi dengan Parameter Akurasi dan Presisi
2.6.3.1 Uji akurasi dengan persen perolehan kembali (% Recovery)
Menurut Meyer (2004), Uji akurasi dengan parameter persen perolehan
kembali (% Recovery) dilakukan secara Standard Addition Method dengan
membuat 3 konsentrasi analit Propranolol HCl dan baku pembanding dengan
rentang spesifik 80%, 100%, 120%, setiap rentang mengandung 70% analit
sampel dan 30% bahan baku, pada perlakuan yang sama dengan perlakuan
sampel.
Persen perolehan kembali dapat dihitung dengan rumus:
% Perolehan kembali =

A B
x 100%
C

Universitas Sumatera Utara

Keterangan :
A = Konsentrasi sampel yang diperoleh setelah penambahan bahan baku
B = Konsentrasi sampel sebelum penambahan bahan baku
C = Konsentrasi baku yang ditambahkan.
2.6.3.2 Uji Presisi
Menurut Rohman (2009), Uji presisi ditentukan dengan parameter Relatif
Standar Deviasi (RSD) merupakan ukuran ketepatan relatif dan umumnya
dinyatakan dalam persen. RSD dirumuskan dengan persamaan :

RSD =

SD
x 100%
X

Keterangan:
RSD

= Standar Deviasi Relatif (%)

SD

= Standar deviasi

= Kadar rata-rata sampel.

2.6.3.3 Penentuan Batas Deteksi (LOD) dan Batas Kuantitasi (LOQ)

Menurut Miller (2005), Batas deteksi didefenisikan sebagai konsentrasi
analit terendah dalam sampel yang masih dapat dideteksi, meskipun tidak selalu
dapat dikuantifikasi. Batas kuantifikasi didefenisikan sebagai konsentrasi analit
terendah dalam sampel yang dapat ditentukan dengan presisi dan akurasi yang
dapat diterima pada kondisi metode yang digunakan. Untuk menentukan batas
deteksi (LOD) dan batas kuantitasi (LOQ) digunakan rumus:

SB =

(Y Yi) 2
n 2

LOD =

3 x SB
Slope

Universitas Sumatera Utara

LOQ =

10 x SB
Slope

Keterangan:
SB

= Simpangan baku

LOD = Batas Deteksi

LOQ = Batas Kuantitasi.
2.6.3.4 Analisis Data Secara Statistik
Menurut Jones, S.D (2002), Untuk menghitung Standar Deviasi (SD)
digunakan rumus:

SD =

(X X )
n 1

Keterangan :
SD

= Standar deviasi

= Kadar sampel

= Kadar rata-rata sampel

= Jumlah perlakuan

Kadar dapat dihitung dengan persamaan garis regresi dan untuk

menentukan data diterima atau ditolak digunakan rumus:
t hitung =

XX
SD / n

Dengan dasar penolakan apabila t hitung t tabel

Untuk mencari kadar sebenarnya dengan = 0,01, dk = n - 1, dapat digunakan
rumus:

= X t (11 / 2 ) dk x

SD
n

Universitas Sumatera Utara

Keterangan:
= Kadar sebenarnya
X = Kadar sampel
n = Jumlah perlakuan
t = Suatu harga tergantung pada derajat kebebasan dan tingkat kepercayaan
dk= Derajat kebebasan.

Universitas Sumatera Utara