Anda di halaman 1dari 8

PRAKTIKUM VI

A. JUDUL PRAKTIKUM
Perhitungan Bakteri Coliform Pada Air Degan Metode Most Probable Number
(Mpn)
B. TUJUAN PRAKTIKUM
Untuk mengetahui jumlah bakteri coliform bakteri air dengan
mrnggunakan uji penduga metode most probable
C. DASAR TEORI
Perhitungan secara tidak langsung ada beberapa cara yaitu : perhitungan
pada cawan petri (total plate count) TPC, perhitungan melalui pengenceran,
perhitungan jumlah terkecil atau terdekat (MPN metode), dan kalorimeter (cara
kekeruhan atau turbidimetri). Metode MPN terdiri dari tiga tahap, yaitu uji
pendugaan (presumtive test), uji konfirmasi (confirmed test), dan uji
kelengkapan (completed test). Dalam uji tahap pertama, keberadaan coliform
masih dalam tingkat probabilitas rendah; masih dalam dugaan. Uji ini
mendeteksi sifat fermentatif coliform dalam sampel. Metode perhitungan MPN
sering digunakan dalam pengamatan untuk menghitung jumlah bakteri yang
terdapat di dalam tanah seperti Nitrosomonas dan Nitrobacter. Kedua jenis
bakteri ini memegang peranan penting dalam meningkatkan pertumbuhan dan
produksi tanaman, sehubungan dengan kemampuannya dalam mengikat N2 dari
udara dan mengubah amonium menjadi nitrat (Dwidjoseputro, 1994).
Output metode MPN adalah nilai MPN. Nilai MPN adalah perkiraan jumlah unit
tumbuh (growth unit) atau unit pembentuk koloni (colony forming unit) dalam
sampel. Namun pada umumnya, nilai MPN juga diartikan sebagai perkiraan
jumlah individu bakteri. Satuan yang digunakan, umumnya per 100 mL atau per
gram. Metode MPN memiliki limit kepercayaan 95 persen sehingga pada setiap
nilai MPN, terdapat jangkauan nilai MPN terendah dan nilai MPN tertinggi
(Dwidjoseputro, 1994).
Bakteri coliform adalah golongan bakteri intestinal, yaitu hidup dalam
saluran pencernaan manusia. Bakteri coliform adalah bakteri indikator
keberadaan bakteri patogenik lain. Lebih tepatnya, sebenarnya, bakteri coliform
fecal adalah bakteri indikator adanya pencemaran bakteri patogen. Penentuan
coliform fecal menjadi indikator pencemaran dikarenakan jumlah koloninya

pasti berkorelasi positif dengan keberadaan bakteri patogen. Selain itu,


mendeteksi coliform jauh lebih murah, cepat, dan sederhana daripada
mendeteksi bakteri patogenik lain (Dwidjoseputro, 1994).
Salah
satu
anggota
kelompok
coliform

adalah E.coli.

Karena E.coli adalah bakteri coliform yang ada pada kotoran manusia,
maka E.coli sering disebut sebagai coliform fekal. Pengujian coliform jauh lebih
cepat jika dibandingkan dengan uji E.coli karena hanya memerlukan uji penduga
yang merupakan tahap pertama uji E.coli (Dwidjoseputro, 1994).
Istilah bakteri indikator sanitasi dikenal dalam bidang mikrobiologi
pangan. Bakteri indikator sanitasi adalah bakteri yang keberadannya dalam
pangan menunjukkan bahwa air atau makanan tersebut pernah tercemar oleh
kotoran manusia yang mengingat banyaknya jumlah mikroorganisme ini, maka
perlu dilakukan suatu uji pemeriksaan terhadap bahan pangan tersebut agar
aman dikonsumsi. Bakteri-bakteri indikator sanitasi umumnya adalah bakteri
yang lazim terdapat dan hidup pada usus manusia sehingga dengan adanya
bakteri tersebut pada air atau makanan dapat menunjukkan bahwa dalam satu
atau lebih tahap pengolahan air atau makanan pernah mengalami kontak dengan
kotoran yang berasal dari usus manusia dan oleh sebab itu kemungkinan terdapat
bakteri patogen lain yang berbahaya. Ada tiga jenis bakteri yang dapat
digunakan untuk menunjukkan adanya masalah sanitasi, yaitu Escherichia coli,
kelompok Streptococcus (Enterococcus) fecal, dan Clostridium perfringens
(Hastowo, 1992).
Pengukuran kuantitatif populasi mikroorganisme sangat diperlukan untuk
berbagai macam penelaahan mikrobiologis. Terdapat berbagai macam cara untuk
menghitung jumlah mikroorganisme, akan tetapi secara mendasar, ada dua cara
yaitu secara langsung dan secara tidak langsung. Ada beberapa cara perhitungan
secara langsung, antara lain adalah dengan membuat preparat dari suatu bahan
(preparat sederhana diwarnai atau tidak diwarnai) dan penggunaan ruang hitung
(counting chamber). Sedangkan perhitungan cara tidak langsung hanya untuk
mengetahui jumlah mikroorganisme pada suatu bahan yang masih hidup saja
(viabel count). Dalam pelaksanaannya, ada beberapa cara yaitu : perhitungan
pada cawan petri (total plate count/TPC), perhitungan melalui pengenceran,

perhitungan jumlah terkecil atau terdekat (MPN methode), dan kalorimeter (cara
kekeruhan atau turbidimetri) (Hastowo, 1992).
Berbagai macam uji mokrobiologis dapat dilakukan terhadap bahan
pangan, meliputi uji kuantitatif mikroba untuk menentukan daya tahan suatu
makanan, uji kualitatif bakteri patogen untuk menenetukan tingkat keamanan
dan uji indikator untuk menentukan tingkat sanitasi makanan tersebut. Pengujian
yang dilakukan terhadap tiap bahan pangan tidak sama tergantung berbagai
faktor, seperti jenis dan komposisi bahan pangan (Hastowo, 1992).
Metode MPN (Most Probable Number) untuk uji kualitas mikrobiologi
air dalam praktikum digunakan kelompok Coliform sebagai indikator.
Kelompok Coliform mencakup bakteri yang bersifat aerobik dan anaeorobik
fakultatif, batang gram negatif dan tidak membentuk spora. Coliform
memfermentasikan laktosa dengan pembentukkan asam dan gas dalam waktu 48
jam pada suhu 35C (Hastowo, 1992).
Dalam metode MPN digunakan medium cair, berbeda dengan metode
cawan yang menggunakan medium padat (Agar). Perhitungan dilakukan
berdasarkan jumlah tabung yang positif, yaitu yang ditumbuhi oleh mikroba
setelah inkubasi pada suhu dan waktu tertentu. Pengamatan tabung positif dapat
dilihat dengan timbulnya kekeruhan atau terbentuk gas dalam tabung durham
(Lay, 1992).
Pendekatan lain untuk enumerasi bakteri hidup adalah dengan metode
MPN. Metode MPN didasarkan pada metode statistik (teori kemungkinan).
Metode MPN ini umumnya digunakan untuk menghitung jumlah bakteri pada
air khususnya untuk mendeteksi adanya bakteri koliform yang merupakan
kontaminan utama sumber air minum. Ciri-ciri utamanya yaitu bakteri gram
negatif, batang pendek, tidak membentuk spora, memfermentasi laktosa
menjadi asam dan gas yang dideteksi dalam waktu 24 jam inkubasi pada 37 C.
Sampel ditumbuhkan pada seri tabung sebanyak 3 atau 5 buah tabung reaksi
untuk setiap kelompok. Apabila dipakai 3 tabung maka disebut seri 3, dan jika
dipakai 5 tabung maka disebut 5 seri. Media pada tabung adalah Lactose Broth
yang diberi indikator perubahan pH dan ditambah tabung durham. Pemberian
sampel pada tiap seri tabung berbeda-beda. Untuk sampel sebanyak 10 ml

ditumbuhkan pada media LBDS (Lactose Broth Double Stegth) yang memiliki
komposisi Beef extract (3 gr), peptone (5 gr), lactose (10 gr) dan
Bromthymol Blue (0,2 %) per liternya. Untuk sampel 1 ml dan 0,1 ml
dimasukkan pada media LBSS (Lactose Broth Single Stegth) yang berkomposisi
sama tapi hanya kadar laktosa setengah dari LBDS yaitu 5 gr (Lay, 1992).
MPN (most Probable Number). Metode hitungan cawan dengan
menggunakan medium padat, tetapi pada metode MPN dengan menggunakan
medium cair di dalam tabung reaksi. Perhitungan MPN berdasarkan pada jumlah
tabung reaksi yang positif, yakni yang ditumbuhi oleh mikroba setelah inkubasi
pada suhu dan waktu tertentu. Pengamatan tabung yang positif dapat dilihat
dengan mengamati timbulnya kekeruhan atau terbentuknya gas di dalam tabung
kecil (tabung durham) yang diletakkan pada posisi terbalik, yaitu untuk jasad
renik yang membentuk gas. Untuk setiap pengenceran pada umumnya dengan
menggunakan 3 atau 5 seri tabung. Lebih banyak tabung yang digunakan
menunjukkan ketelitian yang lebih tinggi, tetapi alat gelas (tabung reaksi) yang
digunakan juga lebih banyak (Dwidjosepuutro, 2005).
Perhitungan bakteri hidup dilakukan dengan cara seri pengenceran. Cara
ini secara luas digunakan untuk menghitung bakteri hidup dalam berbagai cairan
seperti air, susu, biakan cair dan sebagainya. Serentetan pengenceran dibuat
untuk kemudian ditanam dalam medium pembiakan bulyon agar dan setelah
inkubasi

jumlah

koloni

dihitung.

Setelah

dikonversi

sesuai

dengan

pengencerannya, akan diketahui jumlah bakteri per milliliter. Karena


pengenceran dikerjakan secara lipat ganda atau secara desimal, maka angka
yang diperoleh hanya angka perkiraan, yang biasa disebut Most Probable
Number (MPN) (Irianto, 2006).
Prinsip untama dari metode MPN ini adalah mengencerkan sampel
sampai tingkat tertentu sehingga didapatkan konsentrasi mikroorganisme yang
pas/sesuai dan jika ditanam dalam tabung menghasilkan frekuensi pertumbuhan
tabung positif kadang-kadang tetapi tidak selalu. Semakin besar jumlah
sampel yang dimasukkan (semakin rendah pengenceran yang dilakukan) maka
semakin sering tabung positif yang muncul. Semakin kecil jumlah sampel yang
dimasukkan (semakin tinggi pengenceran yang dilakukan) maka semakin jarang

tabung reaksi positif yang muncul. Jumlah sampel/pengenceran yang baik adalah
yang menghasilkan tabung positif kadang-kadang tetapi tidak selalu. Semua
tabung positif yang dihasilkan sangat tergantung dari probabilitas sel yang
terambil oleh pipet saat memasukkannya kedalam media. Oleh karena itu
homogenisasi sangat mempengaruhi metode ini. Frekuensi positif (ya) atau
negative (tidak) ini menggambarkan konsentrasi mikroorganisme pada sampel
sebelum diencerkan (Dwidjoseputro, 2005).
Dalam metode MPN pengenceran sampel harus lebih tinggi daripada
pengenceran pada hitungan cawan, sehingga beberapa tabung yang berisi
medium cair yang diinokulasikan dengan larutan hasil pengenceran tersebut
mengandung 1 jasad renik, beberapa tabung mungkin mengandung lebih dari 1
sel, sedangkan tabung yang lain mengandung sel sama sekali. Dengan demikian
setelah inkubasi diharapkan terjadi pertumbuhan pada beberapa tabung, yang
dinyatakan sebagai tabung positifm sedangkan tabung lainnya negatif (Waluyo,
2004).
Metode MPN biasanya digunakan untuk menghitung jumlah mikroba di
dalam sampel yang berbentuk cair, meskipun dapat juga digunakan untuk
sampel yang berbentuk padat dengan terlebih dahulu membuat suspense 1:10
dari sampel tersebut. Kelompok jasad renik yang dapat dihitung dengan metode
MPN juga bervariasi tergantung dari medium yang digunakan untuk
pertumbuhan (Dwidjoseputro, 2005).
Lebih lanjut mengenai metode MPN, dari setiap pengenceran masingmasing dimasukkan 1 ml masing-masing ke dalam tabung yang berisi medium,
dimana untuk setiap pengenceran digunakan 3 atau 5 seri tabung. Setelah
inkubasi pada suhu dan waktu tertentu, dihitung jumlah tabung yang positif.
Kriteria tabung positif atau tidak ditandai dengan timbulnya kekeruhan atau gas
pada tabung durham. Misalnya pada pengnceran pertama, 3 tabung
menghasilkan pertumbuhan positif, pada pengenceran ke 2 tabung positif, pada
pengenceran ke 3 satu tabung positif, dan pada pengenceran teakhir tidak ada
tabung yang positif. Kombinasinya menjadi 3,2,1,0 dan jika diambil 3
pengenceran pertama kombinasinya menjadi 3,2,1. Angka kombinasi ini

kemudian dicocokkan dengan table MPN, kemudian nilai MPN sampel dapat
dihitung sebagai berikut :
MPN sampel = Nilai MPN tabel

1
faktor pengenceran ditengah

D. ALAT DAN BAHAN


1. Tabung reaksi
2. Tabung durham
3. Pipet volume
4. Cawan petri
5. Aquades
6. Kaldu nutrisi agar
7. Kapas
8. Sampel air aquades
9. Laktosa broth
E. PROSEDUR KERJA
1. Buatlah pengenceran dari sampel yang akan diperiksa mulai dari
pengenceran 10-1 , 10-2, 10-3, atau 10-4, 10-5, 10-6
2. Sediakan 12 tabung reaksi, 3 tabung berisi 9 mL aqudest steril, 9 tabung
berisi 9 mL Laktosa broth (LB)
3. Masukan 1 mL sampel kedalam tabung pertama (isi aquadest), kocok sampi
homogen hingga konsentrasi larutan dalam tabung pertama menjadi 10-1
4. Ambil 1 mL dari tabung pertama masukan kedalam tabung kedua, kocok
sampai homogen, hingga konsentrasi larutan didalam tabung kedua menjadi
10-2 dan buat juga pengenceran 10-3
5. Ambil larutan dari tabung 10-1 , sebanyak masing-masing 1 mL untuk 3
tabung (isi LB 9 mL) 10-1 , kemudian ambil larutan dari tabung 10-2
sebanyak masing-masing 1 mL untuk 3 tabung 10-2 , juga untuk pengenceran
10-3.
6. Inkubasi dengan suhu 22-37o C selama 224 jam.
7. Hitung jumlah tabung reaksi yang positif kemudian hitung nilai MPN
dengan menggunakan rumus sebagai berikut :
MPN sampel = Nilai MPN tabel
F. HASIL DAN PEMBAHASAN
1. Hasil pengamatan

1
faktor pengenceran ditengah

Hasil pengamatan dari praktikum perhitungan bakteri pada air dengan


metode MPN yaitu :

2. Pembahasan
Berbeda dengan metode cawan dimana digunakan media padat (agar),
dalam metode MPN digunakan medium cair didalam tabung reaksi, dimana
perhitungan dilakukan berdasarkan jumlah tabung yang positif, yaitu yang
di tumbuhi oleh mikroba setelah diinkubasikan

pada suhu 37 0C dan

waktu 2 x 24 jam. Pengamatan tabung yang positif dapat dilihat dengan


mengamati timbulnya kekeruhan ( hijau orange) atau terbentuknya gas
didalam tabung durham untuk mikroba pembentuk gas.
Bahan pangan yang diperkirakan mengandung lebih dari 300 sel
mikroba per ml, per g atau per cm permukaan, memerlukam perlakuan
pengenceran sebelum ditumbuhkan pada medium agar pada cawan petri,
sehingga setelah inkubasi akan terbentuk koloni tersebut dalam jumlah yang
terbaik adalah diantara 30 dan 300.
Dalam praktikum ini sampel yang digunakan adalah ikan kaleng yang
sudah mendekati masa kadaluarsa, ikan kaleng tersebut dibuat suspensi,
kemudian

dibuat

pengenceran

secara

desimal.

untuk

melakukan

pengenceran dari masing-masing pengenceran dimasukan 1 ml suspensi


ikan kaleng kedalam tabung yang berisi Lactosa Broth dan tabung durham.
Untuk setiap pengenceran digunakan 3 seri tabung. Setelah inkubasi pada
suhu dan waktu tertentu dilihat tabung yang positif, yaitu tabung yang

ditumbuhi mikroba yang dapat ditandai dengan terbentuknya gas didalam


tabung durham dan juga terdapat perubahan warna.
Pada pengenceran 10-1 ketiga tabung menghasilkan pertumbuhan negatif
Pada pengenceran 10-2 ketiga tabung menghasilkan pertumbuhan negatif
Pada pengenceran 10-3 ketiga tabung menghasilkan pertumbuhan negatif
G. KESIMPULAN
Dalam praktikum ini tidak terjadi perubahan warna dari hijau ke orange,
yang berarti tidak terdapat bakteri E.coli dalam sampel ikan kaleng tersebu. Hal
ini disebabkan karena ikan kaleng tersebut masih dalam keadaan steril.

DAFTAR PUSTAKA

Dwijoseputro,D . 1994 . Dasar - Dasar Mikrobiologi . jakarta : djambatan

Hastowo, sugyo . 1992 . Mikrobiologi . jakarta : rajawali

Lay,bibiana.W . 1992 . Analisis Mikroba Di Laboratrium . jakarta : rajawali