Sel Inang

Sel inang E. coli JM109 digunakan pada kloning NS1 adalah karena
:
1. Mudah dilakukan modifikasi untuk gen NS1
2. Tumbuh baik dan efisien apabila ditransformasikan dengan
menggunakan berbagai metode
3. Ada mutasi pada bagian endonuklease sehingga meningkatkan
kualitas dari isolasi plasmidnya
4. Ada mutasi pada aktivitas -galaktosidase sehingga koloni ini
akan berwarna putih pada proses seleksi
5. Bisa digunakan untuk kloning (www.promega.com)

Pada kloning Gen NS1 yang akan digunakan sebagai

bahan vaksin Chimera adalah isolat virus dengue yang
diperoleh dari Laboratorium Dengue Infectious Tropical
Disease (ITD) Universitas Airlangga. Isolat ini berasal
dari pasien dengue Rumah Sakit DR. Soetomo Surabaya.
Alasan adalah karena virus ini memiliki genom RNA
positive sense yang terdiri atas 3 gen pengkode protein
struktural yaitu :
1. Protein C (lipid)
2. Protein E

Alasan DNA diambil dari virus ini karena memiliki genom

RNA positive sense yang terdiri atas 3 gen pengkode
protein struktural yaitu :
1. Protein C (lipid)
2. Protein E
3. Protein M/prM (glikoprotein)
Serta memiliki 7 gen pengkode protein non struktural
yaitu NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b dan NS5 (Alcon
et al, 2002).

Vektor
Vektor yang digunakan adalah pGEM-T Easy Vector
System (Promega) dengan gen NS1 dengue. Alasannya
adalah :
1. High copy number
2. Mudah untuk kloning
3. Bisa diidentifikasi dengan menggunakan blue/white
screening
4. Sangant efisien pada saat PCR karena proses ligasi ke
plasmid sangat mudah dengan cara mencegah
resirkulasi vektornya (www.promega .com)

Peta Vektor pGEM-T Easy Vector

System

Proses
Ekspresi
Setelah selesai proses PCR,
sampel gen NS1 dengue
berhasil disisipkan ke vektor
pGEM-T Easy Vector System
ditandai dengan munculnya
pita DNA gen NSI dengue
berukuran 435 bp hasil
elektroforesis.
Saat sequencing dan analisis
stabilitas genetik
menggunakan BioEdit

Hasil dari multiple alignment posisi nukleotida 1-436.

Tanda titik adalah identik dengan paling atas;
warna kuning adalah variable sites, yaitu daerah
yang mengalami perubahan.

Berdasarkan hasil sequencing dari fragmen gen

pengkode protein NS1 virus DENV-1 isolat ITD terdapat
variasi nukleotida pada posisi 1-30 awal dan posisi 425
ditandai dengan adanya insersi, delesi dan penggantian
susunan nukleotida hasil kloning dibandingkan dengan
isolat original fragmen gen pengkode protein NS1 virus
Dengue serotipe 1 pada posisi 1-30 awal dan 425 tetapi
pada posisi 31-424 dan 426-436 susunan nukleotida
kembali stabil
Hasil sequencing ditranslasi menggunakan bantuan
software MEGA 5 sehingga diperoleh fragmen gen
pengkode protein NS1 virus dengue. Satu asam amino
dikode oleh 3 nukleotida, panjang nukleotida adalah 436
nukleotida sehingga ketika ditranslasi menjadi 145 asam

Untuk melihat similaritas sekuen-sekuen antar blind passage

dengan harapan sekuen-sekuen tersebut merupakan sekuen yang
homolog (memiliki kemiripan yang signifikan dalam biologi) adalah
analisa dengan software BLAST on line di NCBI
Hasil penelitian ini menunjukkan tingkat stabilitas tinggi untuk
protein NS1. Adanya varian atau perbedaan nukleotida karena ada
mutasi dan delesi di daerah yang kemungkinan hipervariabel. Hal
ini ditemukan terutama didaerah ini dipilih sebagai kandidat
bahan pengembangan vaksin chimera. Semakin tinggi tingkat
homologi antara penyebab penyakit dan imunogen maka
kemampuan netralisasi semakin tinggi.
Hal ini penting untuk mendukung stabilitas dari kekerabatan virus
karena nukleotida yang mengalami maka protein yang dikode
akan mengalami perubahan sifat

Hasil BLAST

Hasil Translasi

Urutan asam amino hasil translasi protein dari kloning fragmen

gen pengkode protein NS1 virus dengue subtipe 1 (DENV-1),
daerah kuning adalah variable sites