Sebelum mulai membiakan mikroba, pertama-tama kita harus
mempertimbangkan bagaimana cara menghindari kontaminan. Mikroba terdapat dimana-mana, tersebar di udara atau pada permukaan suatu benda, oleh karena itu kita harus melakukan sterilisasi media segera setelah disiapkan, yang biasa dilakukan dengan pemanasan. Hal ini perlu dilakukan untuk menghilangkan mikroba kontaminan. Maka semua bahan dan alat yang bersentuhan dengan suatu biakan murni harus steril. Teknik yang digunakan dalam pencegahan kontaminasi selama membuat dan mensterilkan medium kultur disebut Teknik aseptik. Penguasaan teknik ini diperlukan dalam keberhasilan laboratorium mikrobiologi dan hal tersebut merupakan salah satu metode permulaan yang dipelajari oleh ahli mikrobiologi pemula.
Kontaminan asal udara sering terdapat dalam medium, karena udara selalu mengandung partikel debu tempat komunitas mikroba. Transfer aseptik suatu biakan dari satu tabung medium ke tabung lainnya biasa dilakukan dengan menggunakan jarum inokulasi atau ose yang disterilkan dengan cara membakar di atas api. Biakan juga dapat dipindahkan dari permukaan lempeng agar, sebagai tempat perkembangan koloni dimana sel mengalami pertumbuhan dan pembelahan. Metode utama yang digunakan untuk memperoleh kultur murni dari komunitas mikroba yang mengandung beberapa mikroba yang berbeda dilakukan dengan memilih kolonikoloni yang terpisah dan menggoreskan pada lempeng agar dengan metode gores, sehingga diperoleh koloni mikroba yang murni. [1]
prosedur kerja aseptis yang harus dikerjakan untuk menanggulangi kontaminasi
adalah: 1. Sterilisasi ruang kerja 2. Sterilisasi medium dan alat-alat Sterilisasi ruang kerja Ruang kerja yang digunakan untuk pekerjaan aseptis adalah ruang steril, ruangan ini harus senantiasa bersih, dinding dan lantai bersihkan setiap pagi dengan zat anti kuman / desinfektan. Udara didalam ruangan disterilisasi dengan lampu Ultra Violet (UV) yang kekuatannya disesuaikan dengan besarnya ruangan yang dipakai, lampu ini hanya dinyalakan jika ruangan tidak dipakai dan harus dimatikan ketika digunakan untuk bekerja. Radiasi UV tidak berbahaya bagi manusia karena tidak mengion, namun demikian harus diwaspadai karena dapat mengubah DNA dengan pembentukan dimer antara dua basa tirnin pada satu rantai DNA. Penetrasi sinar UV utamanya pada bagian superfisial dari jaringan sehingga dapat melukai kulit dan retina mata. Sinar UV dapat menghasilkan ozon sehingga peneliti yang akan bekerja haras menunggu 15-30 menit setelah UV dimatikan, maksudnya supaya ozon tidak terhirup. Peneliti yang akan bekerja didalam ruangan ini haras memakai jas lab. masker dan tutup kepala, juga harus mencuci tangan dengan sabun antiseptik, kalau perlu menggunakan sarung tangan dari karet. Didalam ruangan ini terdapat alatalat yang dapat menciptakan kondisi aseptis yang terkendali, antara lain Laminar Air Flow dan stenl box (entkas). a. Laminar air flow (laf). Alat ini sangat baik dan efisien, namun harganya relatip mahal untuk menciptakan atmosfer yang steril dimana pekerjaan-pekerjaan aseptis haras dilakukan. Prinsip kerja alat ini yaitu dengan hembusan udara yang sudah disaring (lihat gambar 1).
Udara yang dihisap oleh blower dihembuskan melalui HEPA (high efficiency particulate air) filter dengan porositas 0,22 m, spora-spora jamur dan bakteri akan tertahan, sehingga udara yang berhembus keluar sudah suci hama, laf kadang-kadang dilengkapi dengan UV. Sebelum mulai bekerja, permukaan meja kerja laf disemprot dan dilap dengan kain yang telah dibasahi alkohol 70% atau spiritus, semua alat-alat dimasukkan ruang kerja. Alat-alat dan medium harus sudah steril baik permukaan maupun bagian dalamnya, untuk botol kultur yang berisi media, permukaannya disemprot atau dilap dengan alkohol 70%. Untuk laf yang dilengkapi dengan UV, sebelum bekerja lampu UV dinyalakan selama 30-60 menit untuk mematikan kontaminan pada permukaan ruang kerja.
Gambar 4.2. Detail ruang kerja dan Laminar air flow.
Didalam laf juga sering dilengkapi dengan instalasi gas yang diperlukan untuk sterilisasi alat-alat dengan pembakaran, tetapi ini dapat diganti dengan lampu spiritus atau baktisinerator. b. Steril box (entkas) Alat lain untuk dapat menciptakan ruang kerja yang steril dengan harga yang relatip murah adalah steril box (entkas). Alat ini berujud seperti kotak yang terbuat dari bahan kaca (lihat gambar 4.3 ), plywood, papan kayu atau yang lebih sederhana misalnya dari kardus yang didalamnya dilapisi aluminum foil. Steril box atau entkas dapat dibuat dengan ukuran sesuai dengan yang dikehendaki, yang penting untuk diperhatikan adalah tangan kita dapat menjangkau setiap dinding entkas karena akan memudahkan untuk membersihkannya.
Sebelum mulai bekerja, dinding entkas dibersihkan lebih dahulu dengan melap kain yang sudah dibasahi alkohol 70%. Ruang kerja didalam entkas disterilisasi dengan formalin tablet yang ditaruh didalam cawan porselin kecil dan diletakkan disudut-sudut ruangan, setiap cawan berisi satu tablet. Uap formalin ini dapat mensterilkan udara yang terdapat didalam entkas. Alat-alat dan botol kultur yang berisi media disemprot permukaannya satu persatu dengan alkohol 70% kemudian dimasukan kedalam entkas, dibiarkan 30 menit baru mulai bekerja. Pada entkas juga dapat ditambahkan lampu UV, entkas ini seluruh dinding luarnya harus ditutup dengan aluminum foil, hal ini diperlukan untuk menghindari mata dan kulit dari bahaya radiasi UV.
Sterilisasi media dan alat-alat
Media yang mengandung bahan-bahan yang tahan panas sterilisasinya dilakukan dengan pemanasan basah, menggunakan alat yang namanya autoclave, bekerjanya dengan tekanan uap. Standar teknis untuk Sterilisasi ini adalah pada temperatur 121C, tekanan antara 15 - 17 psi dengan waktu antara 15-40 menit tergantung dari banyaknya media yang disterilisasi. Untuk 15 ml media dalam tabung reaksi atau botol kecil berukuran 75 ml, Sterilisasi dilakukan dengan tekanan 15 psi selama 20 menit. Volume yang lebih besar membutuhkan tekanan yang lebih tinggi dengan waktu yang lebih lama. Autoclave yang digunakan ada bermacam-macam, mulai dari yang paling sederhana sampai yang dapat diprogram (programmable). Autoclave sederhana pemanasan airnya menggunakan kompor gas, sedangkan pengaturan suhu tekanan dan waktunya dilakukan secara manual. Pada waktu mengoperasikan autoclave ini, jangan tergesa-gesa menutup klep pembuang sebelum udara yang ada didalam autoclave diganti seluruhnya oleh uap air yang mendidih sehingga akan tercapai temperature 121C ( langkah ini tidak dikerjakan untuk autoclave yang programmable). Setelah waktu Sterilisasi selesai (15-20 menit) klep-klep pembuang dibuka pelan-pelan, tekanan uap didalam autoclave pelan-pelan akan sama dengan tekanan atmosfer, pembukaan klep pembuang yang tergesa-gesa akan mengakibatkan medium yang ada didalam botol kultur mendidih dan meluap.
Alat lain yang mempunyai prinsip kerja mirip dengan autoclave adalah pressure cooker, alat yang biasa digunakan untuk memasak didapur ini kapasitasnya sangat terbatas, sehingga tidak dianjurkan untuk pekerjaan pada skala laboratorium karena tidak efisien. Autoclave yang paling modern adalah yang programmable, dapat diatur waktu, suhu dan tekanannya secara automatis sehingga dapat dijalankan sambi! mengerjakan pekerjaan yang lain. [2]
Daftar pustaka [1] http://file.upi.edu/Direktori/FPMIPA/JUR._PEND._BIOLOGI/196805091994031KUSNADI/BUKU_COMMON_TEXT_MIKROBIOLOGI,_Kusnadi,dkk/BAB_II_metode.pdf [2] http://elisa.ugm.ac.id/user/archive/download/26222/305ef68a209e3fa6c70cc447 e
