Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi,

struktur dan sifat-sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri
yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana
sel-sel

bakteri

tersebut

disuspensikan.

Salah

satu

cara

untuk

mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi

ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga
berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui
reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan (Jimmo,
2008).
Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum,
dan sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna
sederhana. Istilah pewarna sederhana dapat diartikan dalam
mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja
(Gupte, 1990). Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarnapewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka
akan

basa)

pewarnaan

sedangkan
sederhana

zat-zat

warna

umumnya

yang

bersifat

digunakan
alkalin

untuk

(komponen

kromoforiknya bermuatan positif). Faktor-faktor yang mempengaruhi

pewarnaan

bakteri

yaitu

fiksasi,

peluntur

warna

substrat,

intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Suatu

preparat yang sudah meresap suatu zat warna, kemudian dicuci
dengan asam encer maka semua zat warna terhapus. sebaliknya
terdapat juga preparat yang tahan terhadap asam encer. Bakteribakteri seperti ini dinamakan bakteri tahan asam, dan hal ini
merupakan ciri yang khas bagi suatu spesies (Dwidjoseputro, 1994).

Mikroba sulit dilihat dengan cahaya karena tidak mengadsorbsi

atau membiaskan cahaya. Alasan inilah yang menyebabkan zat warna
digunakan untuk mewarnai mikroorganisme. Zat warna mengadsorbsi
dan

membiaskan

cahaya

sehingga

kontras

mikroba

dengan

sekelilingnya

dapat

ditingkatkan.

Penggunaan

zat

warna

memungkinkan pengamatan strukur seperti spora, flagela, dan bahan

inklusi yng mengandung zat pati dan granula fosfat (Entjang, 2003).
Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat
sulit, kerena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan
sangat kecil. Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan
suatu teknik pewarnaan sel bekteri, sehingga sel dapat terlihat jelas
dan mudah diamati. Olek karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini
merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitianpenelitian mikrobiologi (Rizki, 2008).
Tujuan pewarnaan terhadap mikroorganisme ialah untuk :
1. Mempermudah melihat bentuk jasad, baik bakteri, ragi, maupun
fungi.
2. Memperjelas ukuran dan bentuk jasad
3. Melihat struktur luar dan kalau memungkinkan struktur dalam
jasad.
4. Melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang diberikan sehingga
sifat-sifat fisik dan kimia dapat diketahui.
Langkah-langkah utama teknik pewarnaan :
1. Pembuatan olesan bakteri, olesan bakteri tidak boleh terlalu tebal
atau tipis
2. Fiksasi, dapat dilakukan secara pemanasan atau dengan aplikasi
bahan kimia seperti sabun, formalin, fenol.
3. Aplikasi zat warna : tunggal, atau lebih dari 1 zat warna.
Teknik

pewarnaan

dikelompokkan

menjadi

beberapa

tipe,

berdasarkan respon sel bakteri terhadap zat pewarna dan sistem

pewarnaan yang digunakan untuk pemisahan kelompok bakteri
digunakan pewarnaan Gram, dan pewarnaan acid-fast(tahan asam)
untuk genus Mycobacterium.
Untuk melihat struktur digunakan pewarnaan flagela, pewarnaan
kapsul, pewarnaan spora, dan pewarnaan nukleus. Pewarnaan Neisser

atau Albert digunakan untuk melihat granula metakromatik (volutin

bodies) pada Corynebacterium diphtheriae. Untuk semua prosedur
pewarnaan mikrobiologi dibutuhkan pembuatan apusan lebih dahulu
sebelum melaksanakan beberapa teknik pewarnaan yang spesifik
(Pelezar,2008).

Teknik pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan menjadi

empat macam yaitu :

A. PEWARNAAN SEDERHANA
Menggunakan satu macam zat warna (biru metilen/air fukhsin)
tujuan untuk mempelajari kegunaan pewarnaan untuk mempertinggi
kontras antara sel dan sekelilingnya dan mengamati ciri ciri bakteri.
Pewarnaan sederhana, merupakan pewarna yang paling umum
digunakan. Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil,
spirilum, dan sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan
pewarna sederhana, yaitu mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan
satu macam zat warna saja. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi
dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat
basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan
untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen
kromoforiknya bermuatan positif).
Zat warna yang dipakai hanya terdiri dari satu zat yang dilarutkan
dalam bahan pelarut. Pewarnaan Sederhana merupakan satu cara
yang cepat untuk melihat morfologi bakteri secara umum. Beberapa
contoh zat warna yang banyak digunakan adalah biru metilen (30-60
detik), ungu kristal (10 detik) dan fukhsin-karbol (5 detik).

Prinsip

Preparat

bakteri

akan

menyerap

zat

warna

yang

digunakan.

Pengamatan mikroskopik 100X (objektif) akan teramati bentuk dan

susunan bakteri.

Prosedur Kerja :
1 Preparat yang telah difiksasi, diletakkan pada rak pewarnaan.
2 Preparat lalu ditetesi dengan Karbol Gentian Violet. Lalu
didiamkan selama 2-3 menit.
3 Cat dibuang, lalu preparat dibilas dengan air mengalir.
4 Preparat diletakkan dengan posisi vertikal dan
mengering sendiri.
5 Setelah kering, preparat

diamati

dibawah

dibiarkan

Mikroskop

100X

(objektif).
Contoh Bakteri pada Pewarnaan Sederhana : Staphylococcus aureus

B. PEWARNAAN NEGATIF
Pewarnaan ini merupakan pewarnaan yang tidak langsung. Kita
hanya mewarnai latar belakang dari bakteri tersebut, sedangkan
bakterinya sendiri tidak mengambil zat-zat warna. Pada negatif
staining pada umumnya tidak dilakukan fiksasi, maka praktis
bakteri tidak mengalami perubahan-perubahan, tidak mengerut.
Dengan demikian pewarnaan negatif berguna untuk melihat bentuk-

bentuk sel yang sesungguhnya serta berguna untuk pengukuranpengukuran bakteri.

Pada pewarnaan bakteri ini sel-sel kuman kelihatan transparan
(terang jernih) sedangkan latar belakangnya kelihatan gelap (dengan
tinta-cina).

Prinsip

Zat warna akan diserap oleh latar belakang dari bakteri sehingga latar
belakang berwarna gelap sedangkan sel-sel bakteri tidak mengambil
zat warna dan kelihatan tidak berwarna (transparan). Pengamatan
mikroskopik 100X (objektif) akan teramati bentuk, susunan dan
ukuran bakteri.

Prosedur Kerja :
1. Pada pinggir sebelah kanan objek gelas yang bersih, diteteskan
1 tetes tinta-cina.
2. Disamping tetesan tinta-cina tersebut, diteteskan 1 tetes bahan
yang diperiksa.
3. Dengan objek gelas yang lain, campuran itu diratakan pada
objek gelas hingga merupakan lapisan tipis dengan jalan seperti
membuat preparat hapus pada pemeriksaan malaria.
4. Keringkan pada suhu kamar.
5. Kemudian dilihat dengan mikroskop. Dengan pewarnaan ini
latar belakang preparat kelihatan agak gelap dan abu-abu,
sedangkan spirochaetanya sendiri tidak mengambil zat warna
dan kelihatan tidak berwarna (transparan), berkilat putih.
Contoh Bakteri pada Pewarnaan Negatif :

C. PEWARNAAN DIFERENSIAL

Pewarnaan bakteri yang menggunakan lebih dari satu zat warna

seperti pewarnaan gram dan pewarnaan tahan asam.

Pewarnaan Gram

Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode

untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok

besar, yakni gram-positif dan gram-negatif, berdasarkan sifat
kimia dan fisik dinding sel mereka.
Dalam pewarnaan gram diperlukan empat reagen yaitu :

Zat warna utama (violet kristal)

Mordan (larutan Iodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk

mengintensifkan warna utama.

Pencuci / peluntur zat warna (alcohol / aseton) yaitu solven

organic yang digunakan uantuk melunturkan zat warna
utama.

Zat warna kedua / cat penutup (safranin) digunakan untuk

mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan cat utama
setelah perlakuan denga alcohol.
Bakteri

Gram-negatif

mempertahankan

zat

adalah

warna

metil

bakteri
ungu

yang
pada

tidak
metode

pewarnaan Gram. Bakteri gram-positif akan mempertahankan

zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol,
sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada uji pewarnaan
Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan
setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gramnegatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian
ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini
berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka.

Prinsip

Preparat bakteri akan menyerap zat warna berdasarkan

struktur

dinding

sel

bakteri.

Bakteri

gram

positif

akan

menyerap zat warna ungu (Karbol Gentian Violet), sedangkan

bakteri gram negatif akan menyerap zat warna merah (Air
Fuksin).

Prosedur Kerja:
1 Preparat

yang

telah

difiksasi

diletakkan

pada

rak

pewarnaan.
2 Preparat ditetesi Karbol Gentian Violet, didiamkan selama
2-3 menit.
3 Lalu dibilas dengan air mengalir.
4 Preparat ditetesi lagi dengan Lugol, didiamkan selama 4560 detik sebagai penguat.
5 Lalu Lugol dibuang.
6 Kemudian ditambahkan Etanol 70 % , didiamkan selama 1
menit sebagai pambilas dari Lugol.
7 Ditetesi lagi dengan Air Fuksin, didiamkan selama 2-3
menit.
8 Lalu dibilas dengan air mengalir.
9 Preparat diletakkan dengan posisi vertikal dan dibiarkan
mengering sendiri.
10 Setelah kering, preparat diamati dibawah Mikroskop 100X
(objektif).

Contoh Bakteri Gram Posittif :

Contoh Bakteri Gram Negatif :

Pewarnaan BTA (Basil Tahan Asam)

Pewarnaan ini ditujukan terhadap bakteri yang mengandung
lemak dalam konsentrasi tinggi sehingga sukar menyerap zat
warna, namun jika bakteri diberi zat warna khusus misalnya
karbolfukhsin

melalui

proses

pemanasan,

maka

akan

menyerap zat warna dan akan tahan diikat tanpa mampu

dilunturkan oleh peluntur yang kuat sekalipun seperti asamalkohol. Karena itu bakteri ini disebut bakteri tahan asam
(BTA).
Teknik pewarnaan ini dapat digunakan untuk mendiagnosa
keberadaan

bakteri

yaitu Mycobacterium

penyebab

tuberculosis .

Ada

tuberkulosis
beberapa

cara

pewarnaan tahan asam, namun yang paling banyak adalah

cara menurut Ziehl-Neelsen.(anonymous,2009)

Metode

1 Ziehl-Neesen

Prinsip :

Pemanasan lampu spiritus akan membuka lapisan lilin

(pori-pori) BTA sehingga Karbol Fuksin dapat terserap
sehingga

berwarna

merah.

Bakteri

selain

BTA

akan

menyerap Menthilen Blue dan berwarna biru.

Prosedur Kerja

1 Dibuat sediaan dari sputum dengan cara, bersihkan kaca

benda hingga bebas dari lemak, bakar ose hingga pijar
dan tunggu dingin sejenak, ambil sputum dengan ose
kemudian oleskan diatas kaca benda hingga didapat

usapan yang rata dan tipis, tunggu dan keringkan dan

difiksasi diatas api. Ose setelah digunakan dibakar lagi
hingga pijar.
2 Sediaan ditetesi dengan Karbol Fuksin hingga tergenang,
kemudian panaskan diatas api kecil sampai keluar asap
3
4
5
6

lalu tunggu selama 5 menit.

Sediaan dibilas dengan air mengalir.
Sediaan lalu ditetsi dengan HCl 3 %, selama 1 menit.
Lalu dibilas dengan air mengalir.
Sediaan lalu ditetesi dengan Menthilen Blue hingga

tergenang, didiamkan selama 2-3 menit.

7 Lalu dibilas dengan air mengalir.
8 Preparat diletakkan dengan posisi vertikal dan dibiarkan
mengering sendiri.
9 Setelah kering, preparat diamati dibawah Mikroskop
100X (objektif).
2 Kinyoun Gabbet

Prinsip :

Pemanasan lampu spiritus akan membuka lapisan lilin

(pori-pori) BTA sehingga larutan Kinyoun dapat terserap

sehingga

berwarna

merah.

Bakteri

selain

BTA

akan

menyerap Larutan Gabbet dan berwarna biru.

Prosedur Kerja

1 Dibuat sediaan dari sputum dengan cara, bersihkan kaca

benda hingga bebas dari lemak, bakar ose hingga pijar
dan tunggu dingin sejenak, ambil sputum dengan ose
kemudian oleskan diatas kaca benda hingga didapat
usapan yang rata dan tipis, tunggu dan keringkan dan
difiksasi diatas api. Ose setelah digunakan dibakar lagi
hingga pijar.
2 Sediaan dituangi larutan Kinyoun dan dibiarkan selama
3-5 menit.
3 Lalu dibilas dengan air mengalir
4 Preparat dituangi larutan Gabbet dan dibiarkan selama 1
menit
5 Lalu dibilas dengan air mengalir

6 Preparat diletakkan dengan posisi vertikal dan dibiarkan

mengering sendiri.
7 Setelah kering, preparat diamati dibawah Mikroskop
100X (objektif).
Bakteri Tahan Asam (Merah) Dan Bakteri Tidak Tahan Asam
(Biru)

D.PEWARNAAN STRUKTURAL

Pewarnaan Flagella
Pewarnaan flagel dengan memberi suspense koloid garam
asam tanat yang tidak stabil, sehingga terbentuk presipitat
tebal pada dinding sel dan flagel.

Metode

1 Gry

Larutan-larutan yang diperlukan :

Kalium aluin 10% dalam air

Sublimat 20% dalam air
Asam tanine 20% dalam air
Basic-fuchsin 3% dalam

Prosedur Kerja

:
:
:
:

5 ml.
2 ml.
2 ml.
0,1 ml.

1 Di dalam sebuah tabung reaksi dibuatlah suspensi

kuman dari tanaman (lebih baik diambil dari media

zwerm agar yaitu media untuk bulu cambuk), 1 ose

penuh disuspensikan dengan 1 ml air garam faal steril.
2 Simpan dalam inkubator 37C selama 2 jam (lebih).
3 Satu ose dari suspensi ini diapuskan di atas objek gelas
yang bersih, keringkan dan fiksasi di atas api 3x.
4 Pulas dengan larutan pewarnaan Gray : 10 detik.
5 Cuci bersih dengan aquadest, kemudian dipulas dengan
larutan carbolfuchsin selama 10 detik.
6 Cuci dengan aquadest, keringkan dengan kertas saring
atau pada suhu kamar.
7 Lihat dengan mikroskop

Interpretasi Hasil :
Flagella (bulu cambuk) berwarna : merah jambu.
2 Leifson (Leifson : J. Bact, 20: 203, 1930)
Larutan pulas Leifson, terdiri dari

Basic fuchsin : 1 gram.

NaCl
: 1 gram.
Asam tanine : 2 gram.
Ketiga zat ini dicampur baik-baik, kemudian 1,7 gram

campuran dilarutkan dalam 35 ml alkohol 95% + 65 ml

aquadest. Larutan pulas ini disimpan beberapa minggu
dalam botol bertutup rapat, baru dipakai.

Prosedur Kerja :
1

Sediakan suspensi bakteri dalam air sampai sedikit

keruh, yang diambil dari tanaman agar atau sediment

dari bouillon.
2 Satu tetes dari suspensi diteteskan pada objek gelas
sedemikian rupa sehinggga tetesan mengalir pada objek.
3 Keringkan (biarkan) kering pada suhu kamar, kemudian
bubuhi larutan pulas, biarkan 10 menit.

4 Cuci dengan air, bubuhi dengan borax-methylen biru

yang encer (1,0 g borax + 0,1 g methylen biru dalam
100 ml aquadest), biarkan 5-10 menit.
5 Cuci dengan air dan keringkan dengan kertas saring,
lihat dengan mikroskop.

Interpretasi Hasil :
Flagella

: merah jambu

Badan bakteri

: agak kebiru-biruan

Pewarnaan Kapsul
Pewarnaan ini menggunakan larutan Kristal violet panas,
lalu larutan tembaga sulfat sebagai pembilasan menghasilkan
warna biru pucat pada kapsul, karena jika pembilasan dengan
air dapat melarutkan kapsul. Garam tembaga juga memberi
warna pada latar belakang. Yang berwana biru gelap.

Metode

1 Hiss

Prosedur Kerja

1 Bersihkan gelas benda dengan alkohol agar bebas dari

2
3
4
5

lemak.
Buat sediaan dari biakan yang ada secara aseptik.
Preparat tersebut dikering uadarakan.
Lakukan fiksasi di atas lampu spirtus.
Letakkan preparat smear pada rak pengecatan lalu tetesi
dengan 2-3 tets basic fuchin dan lalu dipanaskan di atas
nyala lampu spirtus sampai timbul uap, jaga jangan

sampai mendidih atau menjadi kering, lalu dinginkan.

6 Cuci dengan larutan CuSO4 .5H2O 20%.
7 Preparat dikering udarakan dan tiriskan atau serap air
yang tersisa pada permukaan preparat dengan kertas
serap.

8 Amati preparat dengan perbesaran kuat (pakai minyak

imersi)menggunakan mikroskop.

Interpretasi Hasil
Sel vegetative
Kapsul

: ungu merah tua

: biru pucat.

2 Buri

Prosedur Kerja

1 Bersihkan gelas benda dengan alkohol agar bebas dari

lemak.
2 Buat pengecatan negatif dari biakan yang tersedia.
3 Tetesi dengan cat blue metilen atau kristal violet selama
2 menit.
4 Cuci dengan air mengalir dan tiriskan.
5 Preparat dikering udarakan dan tiriskan atau serap
dengan kertas serap.
6 Amatai preparat dengan perbesaran kuat (memakai
minyak imersi).

Interpretasi Hasil :
Sel

: biru/ungu

Kapsul

: transparan

Background : hitam

Pewarnaan Spora
Spora bakteri (endospora) tidak dapat diwarnai dengan
pewarnaan

biasa,

diperlukan

teknik

pewarnaan

khusus.

Pewarnaan Klein adalah pewarnaan spora yang paling banyak

digunakan.

Endospora sulit diwarnai dengan metode Gram. Untuk

pewarnaan endspores, perlu dilakukan pemanasan supaya cat
malachite hijau bisa masuk ke dalam spora , seperti halnya
pada pewarnaan

Basil Tahan Asam dimana cat

carbol

fuschsin harus dipanaskan untuk bisa menembus lapisan lilin

asam mycolic dari Mycobacterium .

Prinsip

Pemanasan akan mengembangkan lapisan luar spora sehingga

zat warna utama dapat masuk masuk ke dalam spora sehingga
berwarna

hijau.melalui

pendinginan

warna

utama

akan

terperangkap di dalam spora,dengan pencucian zat warna

utama yang ada pada sel vegetatif akan terlepas sehingga
pada saat pewarnaan kedua (safranin), sel vegetatif akan
berwarna merah.

Metode

1) KLEIN

Prosedur kerja

1 1 ml suspensi bakteri yang umurnya 24 jam dalam

bouillon atau suspensi kuman yang dibUAT dari tanaman
pada agar-miring yang telah berumur 48 jam, dicampur
dengan

Carbolfuchsin

Ziehl

Neelsen

yang

sama

banyaknya di dalam tabung reaksi.

2 Campuran ini dimasak (direndam) pada penangas air
80C kira-kira 10 menit, gunanya untuk membunuh
bakteri-bakteri yang tidak membentuk spora.
3 Satu ose dari campuran dibuat sediaan pada satu objek
gelas yang bersih dan bebas dari lemak, keringkan dan
fiksasi 3x di atas api Bunsen.
4 Celupkan dalam Asam Sulfat 1% selama 1-2 detik.

5 Cuci dengan air kran dan

diwarnai dengan Methylen

Blue 1%, kira-kira selama 2-3 menit.

6 Cuci dengan air kran, keringkan dan lihat dengan
mikroskop.

Intarpretasi Hasil :
Spora
Bakteri

: berwarna merah
: berwarna biru

2) MULLER

Prosedur Kerja

1 Buat sediaan dari biakan kuman yang umurnya 2 hari

dalam bouillon (dari agar miring), sesudah dilidah apikan
(rekatkan) 3x, tetesi dengan Chloroform selama 2 detik.
2 Cuci dengan air, tetesi dengan Asam Chromat 5%
selama 2 detik.
3 Cuci dengan air kran, bubuhi dengan Carbol fuchsin Z.
Neelsen, uapkan (jangan mendidih) biarkan menguap
selama 5 menit.
4 Cuci dengan Asam Asetat 5%, kemudian dengan air.
5 Bubuhi dengan Methylen Blue 1% kira-kira 2 detik.
6 Methylen Blue dibuang dan keringkan dengan kertas
saring, periksa dengan mikroskop.

Interpretasi Hasil :
Spora : berwarna merah.
Bakteri : berwarna biru.

3) FLEMING

Prosedur kerja

1 Buat sediaan, keringkan, kemudian fiksasi 3x di atas api

Bunsen.
2 Warnai dengan Carbol-Fuchsin Z. Neelsen, panaskan
sampai menguap dan biarkan menguap selama 5 menit.

3 Cuci dengan air kran sampai warna Fuchsin tidak luntur

lagi, bubuhi Natrium-sulfit 5% selama 20-30 detik.
4 Cuci dengan air, tetesi dengan larutan Methylen Blue 1%
(dengan larutan Nigrosin 10%), kemudian apuskan di
atas objek gelas.
5 Keringkan pada temperatur kamar dan lihat dengan
mikroskop.

Interpretasi Hasil :
Spora
Bakteri

: berwarna merah
: berwarna biru

4) SCHAEFFER DAN FULTON

Prosedur Kerja

1 Buat sediaan dari suspensi kuman yang akan diperiksa,

keringkan, kemudian fiksasi di atas api 3x.
2 Tetesi dengan larutan Malachiet hijau 5%, uapkan
perlahan-lahan, biarkan menguap 1 menit.
3 Cuci dengan air kran, kemudian bubuhi dengan larutan
Safranin 0,5% selama 1 menit.
4 Cuci lagi dengan air, kemudian keringkan dengan kertas
saring, periksa dengan mikroskop.

Interpretasi Hasil :
Spora : berwarna hijau
Bakteri : berwarna merah