Setelah disentrifugasi, supernatan dibuang kembali dan ke dalam tabung

ditambahkan CaCl2 dingin 100l, diresuspensi dan diinkubasi dalam es selama 2

jam. Cacl2 digunakan agar bakteri menjadi sel yang kompeten. Sel yang
kompeten adalah sel yang sudah siap untuk ditransformasi atau didalamnya sudah
tidak ada plasmid lain lagi. pada dasarnya dinding sel berfungsi melindungi sel
dari masuknya benda-benda asing termasuk DNA, tapi dalam kondisi tertentu,
dinding sel ini bisa memiliki semacam celah atau lubang yang bisa dimasuki
DNA. Dinding sel dna yg bermutan positif, cacl2 dingin akan terionisasi menjadi
ca2+ dan cl-. larutan yang mengandung kation bivalen seperti Ca2+ yang
bermuatan positif akan menempel pada dinding sel (fosfolipid) dan membuat
dinding sel menjadi permeable. Tabung hasil inkubasi masing-masing sudah berisi
sel yang kompeten. kemudian setelah didapatkan sel yang kompeten, tabung
ditambahkan dengan pGEMT, yaitu suatu plasmid sebagai vektor rekombinan
yang akan disisipkan dna insert (dna target) yang memiliki marka seleksi
ampisilin serta gen reporter, yaitu -galactosidase. tabung diinkubasi dalam es
selama 20 menit. Hal ini dilakukan agar terjadi penempelan DNA plasmid yang
bermuatan pada permukaan dinding sel untuk memudahkan integrasi DNA ke
dalam sel. kemudian dilakukan proses transformasu dengan metode kejut panas
(heat-shock) selama 90 detik di dalam inkubator dengan suhu 42 oC. Pada saat ini
terjadi terjadi proses lonjakan suhu dari 0 oC ke 42 oC terhadap sel yang telah
diberi perlakuan CaCl2. Suhu 42 merupakan suhu optimum dalam melakukan
transformasi dgn heatshock. Garam CaCl2 akan mempengaruhi porositas
membran sel sehingga pada saat terjadi lonjakan suhu membran menjadi tidak
selektif terhadap molekul asing dan produk ligasi dapat masuk ke dalam sel.
setelah 90 detik, segera dipindahkan ke dalam es untuk diinkubasi 10 menit. Hal
ini dilakukan agar pori yang tadinya terbuka menjadi tertutup kembali.
Praktikum yang kami lakukan hanya sampai tahap transformasi saja.
Setelah tahap transformasi, seharusnya dilakukan seleksi, yaitu untuk mengetahui
sel-sel manakan yang berhasil melakukan proses transformasi atau disebut juga

transforman. Cara seleksi dapat dilakukan dengan seleksi gen resistensi antibiotik
dan atau menggunakan kolon biru-putih.
Sesuai dengan prosedur seharusnya dilakukan, hasil transformasi
diinkubasi selama 10 menit ditambahkan dengan media LB dan diinkubasi pada
suhu 37oc selama 1.5 jam d dengan shaker incubator. Digunakan shaker incubator
karena bakteri E.coli bersifat aerob. Aerob adalah organisme yang melakukan
metabolisme dengan bantuan oksigen. Aerob, dalam proses dikenal sebagai
respirasi sel, menggunakan oksigen untuk mengoksidasi substrat (sebagai contoh
gula dan lemak) untuk memperoleh energi.
untuk memperbanyak jumlah sel dan memberi kesempatan kepada sel
untuk mengekspresikan marka seleksi dari plasmid yang dibawanya. Kemudian
dari hasil transformasi dapat dilihat dengan munculnya koloni putih dan biru
dengan

menyiapkan

media

LB/Ampisilinl/X-Gal/IPTG

dengan

cara

menambahkan xGal dan IPTG ke media cawan lb/ampisilin, lalu diinkubasi suhu
37 30. Pemakaian antibiotik ampislin dikarenakan pgemt mempunya marka
selektif gen resistensi ampisilin, serta lac z. Penambahan IPTG dalam media
seleksi berfungsi sebagai penginduksi atau inducer yang berikatan dengan
repressor sehingga repressor yang emnepati operator akan pergi dan ekspresi gen
akan meningkat. IPTG adalah analog dari laktosa, IPTG digunakan karena
ikatannya lebih kuat dengan repressor. sedangkan X-Gal berfungsi sebagai
substrat.
Vektor pGEM-T Easy memiliki marka seleksi berupa gen resistensi
ampisilin dan marka seleksi tambahan berupa gen Lac Z. Gen pembawa sifat
resistensi terhadap ampisilin ini menyandi enzim b-Laktamase. Enzim bLaktamase akan mendegradasi ampisilin sehingga ketika sel pembawa plasmid
rekombinan ditumbuhkan dalam media yang mengandung ampisilin, maka sel
tersebut akan tumbuh sementara sel yang tidak membawa plasmid rekombinan
akan mati. DNArekombinan biasanya disisipkan di pertengahan gen lacZ yang
merupakan penyandi lacZ- subunit dari enzim -galactosidas. Ekspresi gen LacZ

ditunjukkan dengan terbentuknya enzim -galaktosidase yang dengan adanya

inducer IPTG akan mengurai substrat X-Gal (suatu galaktosa yang dimodifikasi)
menjadi galaktosa dan pre-chromophore 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole, yang
selanjutnya dioksidasi menjadi 5,5-dibromo-4,4-dichloro-indigo yang berwarna
biru. jika gen LacZ ini masih utuh, maka koloni bakteri akan berwarna biru akibat
pengaruh zat warna indigo yang dihasilkan. Tetapi jika DNA rekombinanberhasil
disisipkan (diligasikan) dengan vektor, otomatis gen lacZ-nya akan terdisrupsi
alias rusak dan ujung-ujungnya tidak mampu menghasilkan indigo yang berwarna
biru, sehingga koloni bakteri akan berwarna putih. Jadi hanya koloni putih yang
tumbuh pada media yang mengandung antibiotik dan X-Gal sajalah yang
kemungkinan mengandung gen yang kita transformasikan. Inilah yang dinamakan
seleksi biru-putih.