LAPORAN PRAKTIKUM ENZIMOLOGI

Uji Aktivitas Enzim Amilase bakteri Termofilik D93 hasil isolasi dari pasir
dan air sungai Gendol Merapi

Disusun oleh:
Nur Khotimah
13308141060
Biologi E 2013

JURUSAN PENDIDIKAN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS NEGERI YOGYAKARTA
2015

A. Judul Praktikum
Uji Aktivitas Enzim Amilase bakteri Termofilik D93 hasil isolasi dari pasir dan air
sungai Gendol Merapi.
B. Rumusan Masalah
1. Berapa Suhu Optimal enzim amilase dari bakteri termofilik D93?
2. Berapa pH optimal enzim amilase dari bakteri termofilik D93?
C. Tujuan Praktikum
1. mengetahui Suhu Optimal enzim amilase dari bakteri termofilik D93?
2. mengetahui pH optimal enzim amilase dari bakteri termofilik D93?
D. Desain Praktikum
Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental dengan perlakuan variasi suhu (30
0
C, 40 0C, 50 0C), pH (5,7,9)
E. Objek Praktikum
Objek dari Penelitian ini adalah bakteri termofilik yang diisolasi dari pasir dan air
sungai Gendol Merapi isolat D93.
F. Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah
1. botol sampel steril,
2. termometer,
3. pH meter,
4. Forteks,
5. water bath,
6. Bunsen,
7. pipet ukur,
8. jarum ose,
9. petridish
10. tabung reaksi

11. autoklaf
12. inkubator
13. erlenmeyer
14. hot plate
15. magnetic stirer
16. oven,
17. test tube,
18. spektrofotometer
19. sentrifus

20. Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah

1.
2.
3.
4.
5.
6.

pati,
media NA,
NB,
Nutrient Starch Broth,
sitrat buffer fosfat,
glukosa monohidrat.
7.
G. Langkah praktikum
a. Isolasi enzim amilase kasar
1. Menumbuhakn isolat terpilih sebanyak 5 mL (10% dari medium) pada medium
starch broth dan pada medium NB, selama 18 jam pada suhu 55oC.
2. Menyentrifugasi Kultur bakteri penghasil enzim amilase dengan kecepatan 5000
rpm selama 30 menit.
3. Mengambil supernatan yang dihasilkan.
b. Pengukuran aktivitas enzim amilase kasar

1. Memasukkan aatu milliliter supernatant ke dalam tabung reaksi

2. Menambahkan dengan 1 mL larutan pati 1% dalam sitrat buffer fosfat (pH 5, 7, dan
9)
3. Menginkubasi dalam incubator selama 20 menit untuk setiap perlakuan suhu
(30oC, 40oC, 50oC).
4. Satu unit aktivitas enzim amylase didefinisikan sebagai banyaknya pati yang
terhidrolisis menjadi glukosa selama masa inkubasi 20 menit.
5. Setelah diinkubasi, kemudian menambahkan 0,5 mL campuran pereaksi Nelson A
dan Nelson B dan mengocok dengan vortex.
6. Memanaskan selama 5 menit
7. Mendinginkan selama 15 menit, menambahkan 0,5 mL pereaksi arsenomolibdat,
menambahkan aquades hingga 5 mL.
8. Selanjutnya absorbansi menguji dengan menggunakan spektrofotometer dengan
panjang gelombang 540 nm.
9. Mengeplotkan nilai absorbansinya dengan kurva standar glukosa yang terbuat dari
larutan baku 0,5 mL untuk konsentrasi 1, 2, 3, 4, 5 mg/L.
10. Aktivitas enzim amylase dihitung berdasarkan data kadar glukosa relatif sebagai
mg glukosa yang dihasilakn oleh 1 mL filtrate kasar amylase. Satu unit aktivitas
enzim didefinisikan sebagai banyaknya mol glukosa yang dihasilkan dari
hidrolisa pati oleh 1 mL ekstrak kasar enzim amylase selama masa inkubasi. Untuk
melihat besarnya satu unit aktivitas enzim tersebut digunakan rumus:
21. AE =

MG x 1000
BMg x MI

22. Dimana:
23. AE
= aktivitas enzim (unit/mL filtrate enzim)
24. MG = milligram glukosa
25. BMg = berat molekul glukosa
26. MI
= masa inkubasi
27.
28.
c. Pembuatan kurva baku larutan glukosa
1. Mengisi sepuluh tabung reaksi masing masing dengan larutan baku glukosa 0,5 ml
untuk konsentrasi 1,2,3,4 dan 5 mg/100 ml
2. Menambahkan pada semua tabung dengan 0,5 ml campuran pereaksi Nelson A dan
Nelson
3. Mengocok dan memanaskan selama 5 menit dan mendinginkan pada air mengalir
selama 15 menit

4. menambahkan kedalam masing masing tabung 0,5 ml pereaksi arsenomolidat dan

dikocok.
5. Setelah itu mengencerkan hingga 5 ml dengan akuades dalam labu ukur.
6. Selanjutnya mengukur serapan masing masing konsentrasi larutan baku pada
panjang gelombang 540 nm blangko yang digunakan diperlakukan seperti sampel
tetapi penambahan 0,5 ml larutan baku glukosa diganti dengan o,5 ml akuades.
7. Melakukan uji aktivitas enzim pada pH dan suhu diatas

H. Hasil dan Analisis Data

29. Tabel .1 Nilai Absorbansi Enzim Amilase Pada Media NB Pati
30.
Suhu (oC)
31. PH
37. 5

38. 0,515

39. 0,628

41. 7

42. 0,447

43. 0,310

45. 9

46.

47. 0,248

34. 30

32. Nilai Absorbansi

35. 40

0,257
49.

Tabel 2. Nilai Absorbansi Enzim Amilase Pada Media NB

50.
Suhu (oC)
51. PH
57. 5

69.

36. 5
0
40. 0,
5
7
4
44. 0,
2
1
3
48. 0,
2
9
1

54. 30

52. Nilai Absorbansi

55. 40

56. 5
0
58. 0,488
59. 0,355
60. 0,
3
2
2
61. 7
62. 0,137
63. 0,338
64. 0,
1
8
8
65. 9
66. 0,222
67. 0,158
68. 0,
2
9
9
MENCARI KONSENTRASI GLUKOSA PADA PERLAKUAN

Kurva Standar Glukosa

0.06
0.05
0.04
Nilai Absorbansi (OD) 0.03
0.02
0.01
0

f(x) = 0.01x + 0.01

Linear ()

Konsentrasi

70.
Grafik 1. Grafik Kurva Standar Larutan Glukosa Konsentrasi 1; 2; 3; 4; dan 5
mg/100 ml
71.
72.
73.
74.
75.
76.
77.

Didapat persamaan dari kurva standar glukosa sebagai berikut,

y 0,007
0,0084

78.

Persamaan

y = 0,0084x + 0,007 x =

79.

Keterangan
80. y = nilai absorbansi enzim perlakuan
81. x = konsentrasi glukosa hasil hidrolisis pati.
82.
83. Tabel 3. Konsentrasi Glukosa Pada Media NB Pati (M)
84.
Suhu (oC)
85. PH
91. 5

103.

86. Konsentrasi (M)

89. 40

90. 50

92. 60,47
6

93. 73,929

94. 67,5

95. 7

96. 52,38
1

97. 36,071

98. 24,524

99. 9

100.
2
9,762

88. 30

101.

28,6
91

Tabel 4. Konsentrasi Glukosa Pada Media NB (M)

104.
Suhu (oC)

106.

Konsentrasi (M)

102.

33
,809

111.

112.
5
7,262

113.

41,4
29

114.

37
,5

115.

116.
1
5,476

117.

39,4
05

118.

21
,548

119.

120.
2
5,595

121.

17,9
76

122.

34
,762

123.

MENCARI MASSA GLUKOSA (mg) PADA PERLAKUAN

124.

Rumus :

125.

Maka

126.
127.

Keterangan
gr
: Massa glukosa (g)
128. M
: Konsentrasi glukosa (M)
Mr
: Berat molekul glukosa = 180
P
: Volume pelarut (ml) = 5 ml
131. Massa Glukosa Pada Media NB Pati (mg)

129.
130.

132.
Suhu (oC)
133.
PH
139. 5

M=

gr
Mr X
gr =

1000
P
M x Mr x P
1000

134.
136.

Massa (mg)
137. 40

138.

50
60
750

0
140.
5
4428,
57

141.

66535,
71

142.

143.

144.
4
7142,
86

145.

32464,
29

146.
22
071,43

147.

148.
2
6785,
71

149.

25821,
43

150.
30
428,57

151.
152.
153.
Suhu (oC)
154.
PH
160. 5

Massa Glukosa Pada Media NB (mg)

157.

155. Massa (mg)

158. 40

159.

50
33
570

0
161.
5
1535,
71

162.

37285,
71

163.

164.

165.
1
3928,
57

166.

35464,
29

167.
19
392,86

168.

169.

170.

16178,

171.

31

3035,
71

172.

285,71

MENCARI AKTIVITAS ENZIM

173.

179.

57

AE =

MG x 1000
BMg x MI

174. Keterangan:
175. AE
: Aktivitas enzim (unit/mL filtrat enzim)
176. MG : massa glukosa
177. BMg : berat molekul glukosa = 180
178. MI
: masa inkubasi = 20 menit
Aktivitas Enzim Amilase Pada Media NB Pati (unit/mL filtrat enzim)

180.
Suhu (oC)
181.
PH
187. 5

182. Aktivitas Enzim (unit/mL filtrat enzim)

184. 3
185. 40
186. 50
0
188.
1
5119,
05

189.

18482,
14

190.

16
875

191.

192.
1
3095,
24

193.

9017,8
6

194.

61
30,86

195.

196.
7
440,4
8

197.

7172,6
2

198.

84
52,38

199.

Aktivitas Enzim Amilase Pada Media NB (unit/mL filtrat enzim)

200.
Suhu (oC)
201.
PH
207. 5

202. Aktivitas Enzim (unit/mL filtrat enzim)

204. 30
205. 40
206. 50
208.
14
315,48

209.

1035
7,14

210.

93
75

211.

212.

38
69,05

213.

9851
,19

214.

53
86,91

215.

216.

63
98,81

217.

4494
,05

218.

86
90,48

219.
I. Pembahasan
220.

Praktikum yang berjudul Uji Aktivitas Enzim Amilase bakteri

Termofilik D93 hasil isolasi dari pasir dan air sungai Gendol Merapi mempunyai
tujuan Mengetahui suhu dan pH optimal aktivitas enzim amilase dari bakteri
Termofilik D93, praktikum ini dilaksanakan pada bulan oktober 2015.

221.

Bakteri yang digunakan dalam praktikum ini yaitu Bakteri termofilik

penghasil enzim amilase yang dapat menghidrolisis subtrat amilum menjadi glukosa.
media yang digunakan untuk menguji aktivitas enzim ini adalah NB (nutrien broth)
pati, dimana pati sebagai substrat, dan untuk kontrolnya yaitu media NB tanpa pati
,aktivitas enzim ini dilihat dari nilai absorbansi yang dapat kita ketahui dari alat yang
disebut spektrofotometer, nilai absorbansi yaitu kemampuan glukosa menyerap sinar
pada panjang gelombang tertentu, dalam praktikum ini panjang geombangnya yaitu
540 nm, menggunakan larutan sitrat buffer fosfat.
222. Larutan buffer adalah larutan yang tahan terhadap perubahan pH
dengan penambahan asam atau basa. Larutan seperti itu digunakan dalam berbagai
percobaan biokimia dimana dibutuhkan pH yang terkontrol dan tepat ( Fardiaz,
1992 ). Larutan buffer bermanfaat untuk melarutkan kotoran yang masih terikut di
dalam endapan enzim tersebut sekaligus bisa mencegah enzim dari denaturasi dan
kehilangan fungsi biologisnya ( Fox, 1991 ). Buffer dapat mempertahankan kondisi
enzim presipitat agar tidak terjadi perubahan pH dan mencegah agar enzim tidak
mengalami inaktivasi.
223. Menurut Girinda (1986) Aktivitas enzim dapat diartikan sebagai
kemampuan suatu enzim untuk mengkatalis suatu reaksi biokimia dalam pengubahan
substrat menjadi produk. Aktivitas suatu enzim dipengaruhi oleh kondisi lingkungan,
seperti suhu ,konsentrasi substrat, inhibitor, pH terutama pH dari media dan sifat
protein enzim itu sendiri. pH juga sangat berpengaruh terhadap aktivitas enzim,
karena sifat ionik gugus karboksil dan gugus amino mudah dipengaruhi oleh ph. Hal
ini menyebabkan daerah katalitik dan konformasi enzim menjadi berubah. Selain itu
perubahan pH juga menyebabkan denaturasi enzim dan menyebabkan hilangnya
aktivitas enzim. Aktivitas konsentrasi enzim yang dapat tercapai tertinggi disebut pH
optimum. Pada umumnya pH optimum untuk beberapa enzim terdapat antara larutan
netral atau asam lemah.
224.

Berdasarkan hal tersebut dalam praktikum ini perlakuan yang

digunakan yaitu berbagai variasi suhu (30 0C, 40 0C, 50 0C) dan variasi pH(5,7,9)
diawali dengan mencari nilai absorbansi enzim amilase terhadap substrat NB pati,
dan NB saja, didapatkan hasil nilai absorbansi tertinggi yang menunjukan suhu dan
pH optimal yaitu pada suhu 40 0C pH 5 pada media NB Pati dan suhu 30 0C pH 5
pada NB. Nilai absorbansi tersebut digunakan untuk mengetahui konsentrasi glukosa
yang dihasilkan namun harus dicari dulu kurva standar glukosa untuk mencari

persamaan kurva standar glukosa. Didapat persamaan dari kurva standar glukosa
sebagai berikut.
225. Persamaan

y = 0,0084x + 0,007 x =

y 0,007
0,0084

226. Keterangan
227. y = nilai absorbansi enzim perlakuan
228. x = konsentrasi glukosa hasil hidrolisis pati
229. konsentrasi glukosa pada suhu 40 0C pH 5 yaitu pada media NB Pati yaitu
73,929mg, sedangkan untuk media NB suhu 30 0C pH 5 yaitu 57,262 mg, dari hasil

tersebut dapat diketahui aktivitas enzim amilase dengan rumus:

230.
231.
232.
233.
234.
235.
236.

AE =

MG x 1000
BMg x MI

Keterangan:
AE
: Aktivitas enzim (unit/mL filtrat enzim)
MG : massa glukosa
BMg : berat molekul glukosa = 180
MI
: masa inkubasi = 20 menit

didapatkan hasil bahwa pada suhu 40 0C dan pH 5 nilai aktivitas enzim

amilase sebesar 3,068 unit/mL filtrat enzim sedangkan pada media NB tanpa pati
aktivitas tertinggi pada suhu 30 0C pH 5 dengan besar aktivitasnya 2,775 unit/mL
filtrat enzim,
237.

Salah satu enzim yang diperlukan untuk pertumbuhan adalah amilase.

Amilase dapat diartikan sebagai segolongan enzim yang merombak pati, glikogen,
dan polisakarida yang lain. Aktivitas enzim dapat diartikan sebagai kemampuan suatu
enzim untuk mengkatalis suatu reaksi biokimia dalam pengubahan substrat menjadi
produk. Aktivitas suatu enzim dipengaruhi oleh kondisi lingkungan seperti pH, suhu,
konsentrasi substrat, inhibitor. pH sangat berpengaruh terhadap aktivitas enzim,
karena sifat ionik gugus karboksil dan gugus amino mudah dipengaruhi oleh ph. Hal
ini menyebabkan daerah katalitik dan konformasi enzim menjadi berubah. Selain itu
perubahan pH juga menyebabkan denaturasi enzim dan menyebabkan hilangnya
aktivitas enzim. Aktivitas konsentrasi enzim yang dapat tercapai tertinggi disebut pH
optimum. Pada umumnya pH optimum untuk beberapa enzim terdapat antara larutan
netral atau asam lemah

238.

Suhu dan pH optimal bisa diketahui dari tingginya aktivitas enzim

tersebut, dari hasil praktikum ini aktivitas tertinggi yaitu 3,068 unit/mL filtrat enzim
yang diperoleh pada suhu 40 0C dan pH 5, dalam hal ini berarti enzim amilase dari
bakteri termofilik ini memiliki aktivitas optimal pada suhu 40 0C dan pH 5 pada
media NB pati . Sedangkan jika kita bandingkan dengan media NB tanpa pati, yang
berarti tidak ada substrat berupa pati , aktivitas enzimnya lebih rendah yaitu 2,775
unit/mL filtrat enzim, karena aktivitas enzim akan meningkat pada penambahan
konsentrasi substrat, namun enzim ini juga bisa mengalami kejenuhan jika
penambahan sustrat berlebih. Jenuh berarti semua sisi aktif enzim telah mengikat
substrat.
239.

Bakteri Termofilik secara umum diartikan sebagai organisme

yang

hidup

pada

suhu di atas 45 0C.isolat bakteri yang digunakan pada praktiku ini habitat aslinya

yaitu pada sungai Gendol gunung merapi namun dalam praktikum ini suhu optimum
bakteri ini adalah 400C hal ini mungkin dikarenakan isolat yang digunakan adalah
isolat yang telah disimpan selama 5 tahun
J. Kesimpulan dan saran
240. Berdasarkan analisis dan pembahasan diatas dapat ditarik kesimpulan :
1. Suhu optimal enzim amilase dari bakteri termofilik D93 adalah suhu 40 0C.
2. pH optimal enzim amilase dari bakteri termofilik D93 adalah pH 5.
241.
242.

Saran

Sebaiknya untuk penelitian selanjutnya dilakukan pengulangan untuk setiap

perlkuan agar hasil yang diperoleh lebih valid, dan sebaiknya isolat bakteri yang
digunakan adalah isolat yang baru diisolasi dari habitat aslinya
K. Daftar Pustaka
243.
244.

Fardiaz, S. (1992). Mikrobiologi Pangan 1. Gramedia Pustaka. Jakarta.

245.

Fox, P.F. (1991). Food Enzymology Vol 2. Elsevier Applied Science. London

246.

Girindra, Aisyah. 1986. Biokimia 1. Jakarta: PT. Gramedia

247.
248.
249.

Lehninger , Albert L. 1982. Dasar dasar Biokimia. Jakarta : Erlangga.

250.