Anda di halaman 1dari 2

ELEKTROFORESIS

Untuk mengetahui hasil uji RT-PCR maka dilakukan elektroforesis. Sebelum


dilakukan eletroforesis maka terlebih dahulu dibuat media eletroforesis berupa gel agarose
1% (melarutkan 1 gram agarose dengan 100ml 1X TAE). Larutan kemudian dipanaskan
sampai mendidih dan berwarna bening. Tiga microliter etidium bromide ditambahkan ke
dalam larutan. Larutan kemudian dicetak pada cetakan agar. Setelah mengeras gel agarose di
letakkan ke dalam mesin elektroforesis yang telah mengandung TAE 1X. Produk hasil RTPCR sebanyak 4ul ditambahkan dengan 1 ul 10X BluejuiceTM Gel Loading Buffer
(Invitrogen). Lubang pertama pada gel agarose dimasukkan 100 bp DNA ladder (Invitrogen),
lubang selanjutnya dimasukkan DNA hasil amplifikasi. Mesin elektroforesis kemudian diberi
tegangan 100 V selama 30 menit.Visualisasi DNA dilakukan dengan meletakan gel agarose di
atas UV Transluminator. Hasil positif ditandai dengan adanya pita yang sejajar dengan pita
control positif. Panjang DNA yang teramplifikasi dapat diketahui dengan membandingkan
antara pita yang timbul dan marker berupa 100 bp DNA ladder. Hasil elektroforesis kemudian
didokumentasikan menggunakan kamera digital.

INTERPRETASI
PCR atau RT-PCR adalah teknik yang sangat sensitive. Teoritis, teknik ini
memerlukan satu molekul DNA atau RNA target saja. Praktis, keberhasilan deteksi terendah
biasanya sekitar 103 molekul DNA atau RNA. Karenanya pengerjaanya harus hatihati sekali.
DNA hasil isolasi dan primer bisa saja terdegradasi. Lebih-lebih bekerja dengan RNA. Enzim
penghancur RNA yaitu RNAse ada banyak di alam, dari udara, kulit, nafas, dan lain
sebagainya.

Seperti halnya serologi, pengerjaan PCR harus selalu menyertakan kontrol positif dan
kontrol negatif. Kontrol positif hendaknya sampel positif yang berasal dari bahan yang sama
dengan asal bahan uji, misalnya swab untuk sampel swab. Setidaknya kontrol positif itu
sudah dikonfirmasi mengandung gen atau DNA/RNA virus target. Kontrol negatif juga
sebaiknya berasal dari asal yang sama dengan sampel yang telah dikonfirmasi negatif virus
target.Uji PCR dikatakan valid jika control itu menunjukkan hasil yang diinginkan. Untuk
kendali pengerjaan yang dapat saja terkontaminasi saat pengerjaan, kontrol negatif yang
mengganti DNA dengan aquabidest murni perlu dikerjakan juga.
Jika hasilnya negatif, sementara semua kontrol menunjukkan hasil yang diharapkan,
kemungkinan negatif palsu (false negative) dapat terjadi dari specimen yang sudah
lisis,isolasi DNA yang kurang aseptis, atau konsentrasi DNA/RNA sangat rendah. Dalam hal
yang terkahir, re-PCR produk PCR pertama dapat diulang. Jika specimen sudah lisis dan
pengerjaan penuh kontaminan, specimen harus diusahakan ulang agar lebih segar dan
dikerjakan dengan hati-hati.