LAPORAN PRAKTIKUM ENZIMOLOGI

Uji Aktivitas Enzim Amilase dari Bakteri Termofilik D93 yang Diisolasi dari
Pasir dan Air Sungai Gendol Merapi

Oleh:
Vella Liani
13308141051
Biologi E 2013

JURUSAN PENDIDIKAN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS NEGERI YOGYAKARTA
2015

A. Judul Penelitian
Uji Aktivitas Enzim Amilase dari Bakteri Termofilik D93 yang Diisolasi dari
Pasir dan Air Sungai Gendol Merapi
B. Rumusan Masalah
Berdasarkan latar beakang maka dirumuskan permasalah sebagai berikut:
1. Berapa suhu optimum aktivitas enzim amilase dari bakteri Termofilik
D93?
2. Berapa pH optimum aktivitas enzim amilase dari bakteri Termofilik D93?
C. Tujuan
Tujuan yang ingin dicapai pada penelitian ini yaitu:
1. Mengetahui suhu optimum aktivitas enzim amilase dari bakteri Termofilik
D93.
2. Mengetahui pH optimum aktivitas enzim amilase dari bakteri Termofilik
D93.
D. Desain Praktikum
Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental dengan perlakuan variasi
suhu (30 0C, 40 0C, 50 0C) dan pH (5,7,9).
E. Objek Praktikum
Objek dari Penelitian ini adalah bakteri termofilik yang diisolasi dari pasir dan
air sungai Gendol Merapi isolat D93.
F. Alat dan Bahan
1. Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah:
a.
b.
c.
d.
e.
f.
g.
h.
i.
j.

Botol sampel steril,

Termometer,
pH meter,
Vortex,
Water bath,
Bunsen,
Pipet ukur,
Jarum ose,
Petridish
Tabung reaksi

k.
l.
m.
n.
o.
p.
q.
r.
s.

Autoklav
Inkubator
Erlenmeyer
Hot plate
Magnetic stirer
Oven,
Test tube,
Spektrofotometer
Sentrifu

t.
2. Bahan
u. Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah:
a. Pati,
2

b.
c.
d.
e.
f.

Media NA,
NB,
Nutrient starch broth,
Sitrat buffer fosfat,
Glukosa monohidrat.
v.

G. Cara Kerja
a. Isolasi enzim amilase kasar
1. Perbandingan media : kultur = 45 mL : 5 mL.
2. Menumbuhkan isolat terpilih sebanyak 1 mL (10% dari medium) pada
medium starch broth dan pada medium NB, selama 18 jam pada suhu
55oC.
3. Mensentrifugasi kultur bakteri penghasil enzim amilase dengan
kecepatan 5000 rpm selama 30 menit.
4. Mengambil supernatan yang dihasilkan.
b. Pengukuran aktivitas enzim amilase kasar
1. Memasukkan satu milliliter supernatant ke dalam tabung reaksi.
2. Menambahkan dengan 1 mL larutan pati 1% dalam 2 mL sitrat buffer
fosfat (pH 5, 7, dan 9).
3. Menginkubasi dalam incubator selama 20 menit untuk setiap perlakuan
suhu (30oC, 40oC, 50oC).
4. Satu unit aktivitas enzim amylase didefinisikan sebagai banyaknya pati
yang terhidrolisis menjadi glukosa selama masa inkubasi 20 menit.
5. Setelah diinkubasi, kemudian menambahkan 0,5 mL campuran
pereaksi Nelson A dan Nelson B dan mengocok dengan vortex.
6. Memanaskan selama 5 menit
7. Mendinginkan selama 15 menit, menambahkan 0,5 mL pereaksi
arsenomolibdat, menambahkan aquades hingga 5 mL.
8. Selanjutnya
absorbansi
menguji
dengan
menggunakan
spektrofotometer dengan panjang gelombang 540 nm.
9. Mengeplotkan nilai absorbansinya dengan kurva standar glukosa yang
terbuat dari larutan baku 0,5 mL untuk konsentrasi 1,2,3,4, dan 5
mg/100 ml.
10. Aktivitas enzim amylase dihitung berdasarkan data kadar glukosa
relatif sebagai mg glukosa yang dihasilkan oleh 1 mL filtrate kasar
amylase. Satu unit aktivitas enzim didefinisikan sebagai banyaknya
mol glukosa yang dihasilkan dari hidrolisa pati oleh 1 mL ekstrak
kasar enzim amylase selama masa inkubasi. Untuk melihat besarnya
satu unit aktivitas enzim tersebut digunakan rumus:
MG x 1000
w.
AE =
BMg x MI
3

x.
Dimana:
y.
AE
= aktivitas enzim (unit/mL filtrate enzim)
z.
MG = milligram glukosa
aa.
BMg = berat molekul glukosa
ab.
MI
= masa inkubasi
c. Pembuatan kurva baku larutan glukosa
1. Mengisi sepuluh tabung reaksi masing masing dengan larutan baku
glukosa 0,5 ml untuk konsentrasi 1,2,3,4, dan 5 mg/100 ml.
2. Menambahkan pada semua tabung dengan 0,5 ml campuran pereaksi
Nelson A dan Nelson.
3. Mengocok dan memanaskan selama 5 menit dan mendinginkan pada
air mengalir selama 15 menit.
4. menambahkan kedalam masing masing tabung 0,5 ml pereaksi
arsenomolidat dan dikocok.
5. Setelah itu mengencerkan hingga 5 ml dengan akuades dalam labu
ukur.
6. Selanjutnya mengukur serapan masing masing konsentrasi larutan
baku pada panjang gelombang 540 nm blangko yang digunakan
diperlakukan seperti sampel tetapi penambahan 0,5 ml larutan baku
glukosa diganti dengan 0,5 ml akuades.
7. Melakukan uji aktivitas enzim pada pH dan suhu di atas.

H. Hasil dan Analisis Data

A. Hasil dan Perhitungan
ac. Tabel .1 Nilai Absorbansi Enzim Amilase Pada Media NB Pati
ad.

S
uhu ( C)
ae. PH
ak. 5
o

af. Nilai Absorbansi

ah. 30
ai. 40
al. 0,5
15

am.
0,628

ao. 7

ap. 0,4
47

aq. 0,3
10

as. 9

at. 0,2
57

au. 0,2
48

aj. 5
0
an. 0
,
5
7
4
ar. 0
,
2
1
3
av. 0
,
2
9
1

aw.
ax. Tabel 2. Nilai Absorbansi Enzim Amilase Pada Media NB
ay.
Suhu (oC)
az. PH
bf. 5

ba. Nilai Absorbansi

bc. 30
bd. 40
bg. 0,4
88

bh. 0,3
55

bj. 7

bk. 0,1
37

bl. 0,3
38

bn. 9

bo. 0,2
22

bp. 0,1
58

be. 5
0
bi. 0
,
3
2
2
bm.
0,1
8
8
bq. 0
,
2
9
9

br.
1. Mencari Konsentrasi Glukosa Pada Perlakuan
bs.

Kurva Standar Glukosa

0.06
0.05
0.04
Nilai Absorbansi (OD) 0.03
0.02
0.01
0

f(x) = 0.01x + 0.01

Linear ()

Konsentrasi

Grafik 1. Grafik Kurva Standar Larutan Glukosa Konsentrasi 1; 2; 3;

4; dan 5 mg/100 mL
bt.
bu.
bv.
bw.
bx.
by.
bz.
ca.
cb.
Berdasarkan kurva standar glukosa di atas, untuk
mengetahui besarnya konsentrasi glukosa yaitu dengan memasukkan pada
persamaan berikut:
cc.
cd.
ce.
cf.

Persamaan
x=

y 0,007
0,0084

Keterangan
x = konsentrasi glukosa hasil hidrolisis pati

cg.
ch.

y = nilai absorbansi enzim perlakuan

ci. Tabel 3. Konsentrasi Glukosa Pada Media NB Pati (M)
cj.

Su
hu ( C)
ck. PH
cq. 5
o

cn. 30
cr. 60,
47
6

cu. 7

cv. 52,
38
1

cy. 9

cz. 29,
76
2

cl. Konsentrasi (M)

co. 4
0
cs. 7
3,
9
2
9
cw. 3
6,
0
7
1
da. 2
8,
6
9
1

cp. 5
0
ct. 6
7
,
5
cx. 2
4
,
5
2
4
db. 3
3
,
8
0
9

dc.
dd. Tabel 4. Konsentrasi Glukosa Pada Media NB (M)
de.

S
uhu ( C)
df. PH
dl. 5
o

di. 30
dm.
57,262

dp. 7

dq. 15,
47
6

dt. 9

du. 25,
59

dg. Konsentrasi (M)

dj. 4
0
dn. 4
1,
4
2
9
dr. 3
9,
4
0
5
dv. 1
7,

dk. 5
0
do. 3
7
,
5
ds. 2
1
,
5
4
8
dw.3
4

9
7
6

,
7
6
2

dx.
2. Mencari Massa Glukosa (mg) Pada Perlakuan
dy. Rumus

:
gr =

dz. Maka,

M=

gr
Mr X

1000
P

M x Mr x P
1000

ea.
eb.
ec.
ed.
ee.
ef.
eg.

Keterangan
gr
: Massa glukosa (g)
M
: Konsentrasi glukosa (M)
Mr
: Berat molekul glukosa = 180
P
: Volume pelarut (ml) = 5 ml

eh. Tabel 5. Massa Glukosa Pada Media NB Pati (mg)

ei.

Su
hu ( C)
ej.
PH
ep. 5
o

et. 7

ex. 9

em.3
0
eq. 5
4
4
2
8
,
5
7
eu. 4
7
1
4
2
,
8
6
ey. 2
6
7

ek. Massa (mg)

en. 40

eo. 50

er. 665
35,
71

es. 60
75
0,0
0

ev. 324
64,
29

ew. 22
07
1,4
3

ez. 258
21,
43

fa. 30
42
8,5

8
5
,
7
1
fb.
fc.

fd. Tabel 6. Massa Glukosa Pada Media NB (mg)

fe.

Su
hu ( C)
ff.
PH
fl. 5

fi. 30

fm.51
53
5,
71

fp. 7

fq. 13
92
8,
57

ft. 9

fu. 23
03
5,
71

fg. Massa (mg)

fj. 4
0
fn. 3
7
2
8
5,
7
1
fr. 3
5
4
6
4,
2
9
fv. 1
6
1
7
8,
5
7

fk. 50
fo. 335
70,
00

fs. 193
92,
86

fw. 312
85,
71

fx.
3. Mencari Aktivitas Enzim
fy. Rumus :
fz.
ga.
gb.
gc.

AE =

MG x 1000
BMg x MI

Keterangan:
AE
: Aktivitas enzim (unit/mL filtrat enzim)
MG : massa glukosa

gd.
BMg : berat molekul glukosa = 180
ge.
MI
: masa inkubasi = 20 menit
gf.
gg. Tabel 7. Aktivitas Enzim Amilase Pada Media NB Pati (unit/mL filtrat
enzim)
gh.

Suhu
( C)
PH
o

gi.

go. 5

gs. 7

gw.9

gj. Aktivitas Enzim (unit/mL filtrat

enzim)
gl. 3
gm. 4
gn. 50
0
0
gp. 1
gq. 184
gr. 1687
5
82,
5,00
1
14
1
9
,
0
5
gt. 1
gu. 901
gv. 6130,
3
7,8
86
0
6
9
5
,
2
4
gx. 7
gy. 717
gz. 8452,
4
2,6
38
4
2
0
,
4
8
ha.

hb. Tabel 8. Aktivitas Enzim Amilase Pada Media NB (unit/mL filtrat

enzim)
hc.

Suh
u ( C)
PH
o

hd.

hj. 5

he. Aktivitas Enzim (unit/mL filtrat

enzim)
hg. 3
hh. 40
hi. 50
0
hk. 1
hl. 103
hm. 9
4
57,
375,0

hn. 7

hr. 9

3
1
5
,
4
8
ho. 3
8
6
9
,
0
5
hs. 6
3
9
8
,
8
1

14

hp. 985
1,1
9

hq. 5386,
91

ht. 449
4,0
5

hu. 8690,
48

hv.
I. Pembahasan
hw.Praktikum yang kami lakukan berjudul uji aktivitas enzim amilase
dari bakteri termofilik D93 yang diisolasi dari pasir dan air Sungai Gendol
Merapi. Praktikum ini kami lakukan untuk mengetahui suhu dan pH optimum
aktivitas enzim amilase dari bakteri Termofilik D93. Praktikum ini kami
lakukan selama 1 bulan yaitu pada Oktober 2015 di Laboratorium
Mikrobiologi FMIPA UNY.
hx. Bakteri yang kami gunakan pada praktikum kali ini yaitu bakteri
termofilik D93. Termofilik secara umum diartikan sebagai organisme yang
hidup pada suhu di atas 450C. Organisme ini telah memberikan pengetahuan
baru selama beberapa tahun terakhir. Minat para ilmuwan terhadap organisme
termofil semakin tinggi terutama adanya penemuan bakteri-bakteri yang dapat
hidup pada suhu didih air atau bahkan lebih tinggi.
hy. Bakteri termofilik yang kami gunakan adalah bakteri penghasil
enzim amylase. Enzim amylase dapat menghidrolisis amilum menjadi
glukosa. Kebanyakan enzim membutuhkan medium cair untuk mendukung
aktivitas katalisasi air penting untuk menyusun struktur enzim. Media tumbuh
yang kami gunakan pada praktikum yaitu nutrient broth (NB) dan amilum.
Amilum yang kami gunakan pada praktikum ini yaitu pati, karena pada pati

tersusun oleh polisakarida yang dapat dipecah oleh enzim amylase menjadi
monosakarida berupa glukosa. Menurut Fox (1991) amilase dapat diartikan
sebagai segolongan enzim yang merombak pati, glikogen dan polisakarida
yang lain. Amilase memotong rantai polisakarida yang panjang, menghasilkan
campuran glukosa dan maltosa. Amilosa merupakan polisakarida yang terdiri
dari 100-1000 molekul glukosa yang saling berikatan membentuk rantai lurus.
hz. Enzim adalah senyawa organik yang dihasilkan oleh sel-sel hidup.
Bekerja dengan urut-urutan yang teratur, enzim mengkatalis ratusan reaksi
bertahap yang menguraikan molekul nutrien, reaksi yang menyimpan dan
mengubah energi kimiawi, dan yang membuat makromolekul sel dari
prekursor sederhana. Spesifitas enzim amat tinggi terhadap substratnya, enzim
mempercepat reaksi kimiawi spesifik tanpa pembentukan produk samping,
dan molekul ini berfungsi di dalam larutan encer pada keadaan suhu dan pH
normal. (Albert Lehninger,1982:235).
ia. Untuk menguji teori aktivitas enzim maka kami melakukan
perlakuan bakteri termofilik penghasil enzim amylase dengan variasi pH 5, 7,
9. Untuk membuat variasi pH kami menggunakan larutan sitrat buffer fosfat.
Larutan buffer adalah larutan yang tahan terhadap perubahan pH dengan
penambahan asam atau basa. Larutan seperti itu digunakan dalam berbagai
percobaan biokimia dimana dibutuhkan pH yang terkontrol dan tepat (Fardiaz,
1992). Larutan buffer bermanfaat untuk melarutkan kotoran yang masih
terikut di dalam endapan enzim tersebut sekaligus bisa mencegah enzim dari
denaturasi dan kehilangan fungsi biologisnya (Fox, 1991). Buffer dapat
mempertahankan kondisi enzim presipitat agar tidak terjadi perubahan pH dan
mencegah agar enzim tidak mengalami inaktivasi (Winarno, 1995).
ib. Selain dipengaruhi pH, kerja enzim juga dipengaruhi oleh suhu
sehingga kami membuat variasi suhu 30, 40, 500C utnuk menguji aktivitas
enzim. Pada suhu di atas dan di bawah optimalnya, aktivitas enzim berkurang.
Di atas suhu 50C enzim secara bertahap menjadi inaktif karena protein
terdenaturasi. Pada suhu 100C semua enzim rusak. Pada suhu yang sangat
rendah, enzim tidak benar-benar rusak tetapi aktivitasnya sangat banyak
berkurang (Gaman & Sherrington, 1994). Namun enzim yang kami gunakan
pada percobaan ini berasal dari bakteri termofilik yang sudah lama inaktif
sehingga suhunya tidak terlalu tinggi yaitu sekitar 30-50 0C. untuk
mengaktifkan enzim tersebut, kami melakukan penanaman bakteri pada media
agar miring dengan metode goresan zig-zag. Setelah medium tumbuh dan
jumlahnya cukup kemudian kami biakan di medium cair untuk diberi
perlakuan suhu dan pH yang telah ditentukan.

ic. Penentuan nilai absorbansi dilakukan dengan menguji larutan pada

alat spektrofotometri. Nilai absorbansi yaitu kemampuan suatu zat dalam
menyerap sinar spektro pada panjang gelombang tertentu. Pada praktikum ini
digunakan panjang gelombang 540nm. Berdasarkan hasil praktikum, pada
media yang menggunakan media NB+Pati diperoleh nilai absorbansi terbesar
yaitu 0,628. Nilai absorbansi tersebut diperoleh pada bakteri termofilik yang
diberi perlakuan suhu 400C dan pH 5. Pada media control atau hanya
menggunakan NB saja diperoleh nilai absorbansi sebesar 0,488. Nilai
absorbansi tersebut diperoleh pada bakteri termofilik yang diberi perlakuan
suhu 300C dan pH 5. Berdasakan hasil tersebut maka bakteri termofilik dapat
bekerja optimum pada suhu 400C dan pH 5 pada media NB+Pati serta suhu
300C dan pH 5 pada media NB saja.
id. Hal tersebut terlihat bahwa enzim dipengaruhi oleh panas atau
suhu, yang ditunjukkan dengan nilai absorbansinya. Semakin tinggi suhunya,
nilai absorbansinya semakin turun, karena enzim mengalami inaktivasi pada
suhu tinggi. Sedangkan pada pengaruh pH didapatkan bahwa setiap bahan
memiliki nilai pH optimum untuk melakukan aktivitas enzimnya, yang dapat
dilihat dari nilai absorbansinya. Menurut Gaman & Sherrington (1994)
semakin besar atau basa pH yang digunakan maka semakin rendah nilai ODnya dikarenakan enzim mengalami denaturasi. Suhu yang tinggi akan
menaikkan aktivitas enzim tapi suhu yang terlalu tinggi pun dapat
mendenaturasi enzim. Ketika temperatur meningkat, pH optimal enzim adalah
sekitar pH 7 (netral) dan jika medium menjadi sangat asam atau sangat alkalis
enzim mengalami inaktivasi. Akan tetapi beberapa enzim hanya beroperasi
dalam keadaan asam atau alkalis, sedangkan aktivitas enzim sangat
dipengaruhi oleh suhu.
ie. Konsentrasi glukosa pada perlakuan dapat diketahui dengan
membuat grafik kurva standar glukosa dengan persamaan:
if. y = 0,0084x + 0,007, maka

x=

y 0,007
0,0084

ig.
ih.
ii.
ij.

Keterangan:
x = konsentrasi glukosa hasil hidrolisis pati
y = nilai absorbansi enzim perlakuan
ik. Berdasarkan hasil analisis dengan persamaan tersebut, diperoleh
konsentrasi glukosa tertinggi pada media NB+Pati yaitu sebesar 73,929.
Konsentrasi glukosa tersebut diperoleh pada bakteri dengan perlakuan suhu
400C dan pH 5 karena enzim yang dihasilkan bakteri termofilik bekerja
optimum dalam mengubah pati menjadi glukosa pada suhu dan pH tersebut.
Sedangkan pada media control (NB saja) diperoleh konsentrasi glukosa

tertinggi sebesar 57,262 pada perlakuan bakteri termofilik dengan suhu 300C
dan pH 5. Hal itu karena enzim amylase dari bakteri termofilik pada media
NB mampu bekerja optimum dalam mengubah nutrient cair missal berupa
litmus milk menjadi glukosa.
il. Kemudian dicari massa glukosa pada masing-masing media
menggunakan rumus:
im. Rumus

in. Maka,
gr =

M=

gr
Mr X

1000
P

M x Mr x P
1000

io.
ip. Keterangan
iq.
gr
: Massa glukosa (g)
ir.
M
: Konsentrasi glukosa (M)
is.
Mr
: Berat molekul glukosa = 180
it.
P
: Volume pelarut (ml) = 5 ml
iu. Berdasarkan perhitungan rumus diperoleh massa glukosa tertinggi
pada media NB+Pati sebesar 66535,71 mg yaitu pada perlakuan bakteri
termofilik di suhu 400C dan pH 5. Sedangkan pada media NB saja diperoleh
massa glukosa tertinggi sebesar 51535,71 mg pada perlakuan bakteri
termofilik di suhu 300C dan pH 5. Hal itu berarti pada suhu dan ph tersebut
enzim amylase pada bakteri termofilik bekerja secara optimum dalam
mengubah nutrisi pada media sehingga dihasilkan produk berupa glukosa
dalam jumlah banyak.
iv. Setelah diketahui massa glukosa yang dihasilkan, maka kita dapat
mengetahui aktivitas enzim menggunakan rumus:
iw.
ix.
iy.
iz.
ja.
jb.
jc.

AE =

MG x 1000
BMg x MI

Keterangan:
AE
: Aktivitas enzim (unit/mL filtrat enzim)
MG : massa glukosa
BMg : berat molekul glukosa = 180
MI
: masa inkubasi = 20 menit
jd. Berdasarkan perhitungan menggunakan rumus diperoleh aktivitas
enzim (unit/mL filtrat enzim) tertinggi untuk media NB+Pati yaitu sebesar
18482,14 pada perlakuan suhu 400C dan pH 5. Sedangkan pada media NB saja
diperoleh aktivitas enzim tertinggi sebesar 14315,48 pada perlakuan suhu
300C dan pH 5. Dari hasil tersebut terlihat bahwa aktivitas enzim sangat

dipengaruhi oleh konsentrasi substrat. Pada media NB+Pati aktivitas enzim

lebih besar karena penambahan substrat berupa Pati mampu meningkatkan
aktivitas enzim. Namun, jika enzim sudah mencapai titik jenuh atau semua sisi
aktif enzim sudah berikatan dengan substrat maka jika dilakukan penambahan
substrat tidak akan meningkatkan aktivitas anzim. Hal ini karena enzim sudah
mencapai kecepatan maksimum (Vmax).
J. Kesimpulan
je. Berdasarkan pembahasan maka dapat ditarik kesimpulan sebagai berikut:
1. Enzim pada umumnya memiliki pH optimum 5 sehingga kerja enzim
optimum, karena suasana yang terlalu asam atau alkalis menyebabkan
denaturasi protein dan hilangnya secara total aktivitas enzim. Larutan
Buffer digunakan untuk menjaga aktivitas enzim agar tidak rusak dan
mengalami aktivasi saat penambahan pH.
2. Suhu optimum enzim yaitu 40oC, pada suhu lebih dari 50oC enzim
menjadi inaktif karena protein terdenaturasi. Nilai absorbansi pada
percobaan ini dapat menunjukkan nilai aktivitas enzim yang dipengaruhi
oleh pH dan suhu tertentu.
K. Saran
jf. Untuk penelitian selanjutnya sebaiknya bakteri yang digunakan bakteri
yang masih baru sehingga suhunya belum berubah karena adaptasi dengan
lingkungan. Selain itu sebaiknya dilakukan pengulangan untuk masing-masing
perlakuan supaya data hasil penelitian lebih valid.
L. Daftar Pustaka
jg.
jh.
ji.
jj.
jk.

Albert L. Lehninger. 1982. Dasar dasar Biokimia. Jakarta :

Erlangga.
Fardiaz, S. (1992). Mikrobiologi Pangan 1. Gramedia Pustaka.
Jakarta.
Fox, P.F. (1991). Food Enzymology Vol 2. Elsevier Applied
Science. London.

jl.
jm.

Gaman, P.M & K.B. Sherrington. (1994). Ilmu Pangan,

Pengantar Ilmu Pangan, Nutrisi dan Mikrobiologi. Universitas
Gadjah Mada press. Yogyakarta.