Transformasi E.

coli ke vektor Agrobacterium

tumefaciens LBA4404
1. Karakteristik Agrobacterium tumefaciens
Agrobacterium
tumefaciens adalah bakteri
patogen pada
tanaman yang banyak digunakan untuk memasukkan gen asing
ke dalam sel tanaman untuk menghasilkan suatu tanaman
transgenik. Secara alami, A. tumefaciens dapat menginfeksi
tanaman dikotiledon melalui bagian tanaman yang terluka
sehingga menyebabkan tumor mahkota empedu (crown gall
tumor).

Bakteri yang tergolong ke dalam gram negatif ini

Memiliki sebuah plasmid besar yang disebut plasmid-Ti yang
berisi gen penyandi faktor virulensi penyebab infeksi
bakteri ini pada tanaman.
Menyerang tanaman
dikotiledon serta tanaman monokotiledon seperti jagung,
gandum, dan tebutelah digunakan untuk memasukkan sel
asing ke dalam genom tanaman.
Agrobacterium tumefaciens adalah bakteri patogen pada
tanaman yang banyak digunakan untuk memasukkan gen
asing ke dalam sel tanaman untuk menghasilkan suatu
tanaman transgenik.
Agrobacterium berbentuk batang, berukuran 0,6 1,0 m
sampai 1,5 3,0 m, dalam bentuk tunggal atau berpasangan.
Agrobacterium merupakan bakteri yang mudah bergerak
(motile) dan memiliki 1-6 flagela peritrichous serta merupakan
bakteri tak berspora.
Suhu optimal pertumbuhan bakteri ini adalah 25-28C.
Kumpulan bakteri ini biasanya berbentuk cembung, bulat,
lembut, dan tak berpigmen. Agrobacterium diisolasi dari
tanaman yang terinfeksi Crown Gall.
Strain LBA4404 resisten terhadap antibiotic jenis rifampisin,
streptomycin, dan tetracycline

2.Metode Transformasi e. coli ke Vektor A. tumefaciens

a. Elektroporasi
Elektroporasi merupakan salah satu cara melakukan
transformasi
dengan
menggunakan
aliran
listrik.

Elektroporasi berperan untuk meningkatkan efisiensi

integrasi DNA pada sel inang. Aliran listrik yang digunakan
dalam elektroporasi akan menyebabkan membran sel
mengalami kerusakan sementara. Kerusakan pada membran
sel karena terbentuknya pori sementara pada lapisan
hidrofobik sekitar 2 nm yang membuat struktur membrane
sel menjadi permeable untuk proses integrasi DNA menuju
sitoplasma dalam sel.
Sebelum melakukan transformasi ke vector A.tumefaciens,
plasmid yang memiliki DNA rekombinan pada e.coli di isolasi
terlebih dahulu untuk mendapatkan DNA rekombinan murni.
Setelah di isolasi, DNA rekombinan di transformasi ke vector
A.tumefaciens

Gambar 1.
Elektroporasi

b.
Polyethylen glycol (PEG)

Transformasi PEG atau

disebut
dengan
transformasi

protoplas

merupakan teknik transfer gen secara langsung karena

proses introduksi DNA dilakukan tanpa melalui perantara.
Transfromasi protoplas umumnya dilakukan pada tanaman
monokotil jenis serealia. Senyawa PEG ini akan menjadi

perantara masuknya DNA ke dalam sel. Keberhasilan teknik

transformasi ini masih rendah karena regenerasi protoplas
sangat bergantung pada jenis genotipe yang digunakan dan
tidak dapat diaplikasikan pada semua sel.
Sebelum melakukan transformasi ke vector A.tumefaciens,
plasmid yang memiliki DNA rekombinan pada e.coli di isolasi
terlebih dahulu untuk mendapatkan DNA rekombinan murni.
Setelah di isolasi, DNA rekombinan di transformasi ke vector
A.tumefaciens

PE
G

Gambar 2.
PEG

c. Particle Bombardment
Particle Bombardment atau disebut juga biolistic
merupakan metode transfer gen yang digunakan untuk
melakukan transformasi terhadap sel secara in situ. DNA
target akan diletakkan diatas permukaan emas sekitar 0.51.5 mikrometer. DNA tersebut kemudian dilakukan
penembakan dengan alat yang disebut gene gun. Gene gun
akan menembak sel dengan tekanan tinggi. DNA yang sudah
dilapisi emas akan masuk ke dalam jaringan menembus
dinding sel dan membran, kemudian DNA berdifusi dan
menyebar di dalam sel secara independen.

Sebelum melakukan penembakan, plasmid yang memiliki

DNA rekombinan pada e.coli di isolasi terlebih dahulu untuk
mendapatkan DNA rekombinan murni. Setelah di isolasi, DNA
rekombinan di transformasi ke vector A.tumefaciens.

Gambar 3. (a) Gene Gun (b) Particle

Bombardment

d. Silikon Karbid

Karbid silikon yaitu teknologi transfer gen di mana suspensi

sel tanaman inang dicampur dengan serat karbid silikon
yang mengandung DNA plasmid dari gen interes, kemudian
dimasukkan ke dalam tabung mikro dan dilakukan
pemutaran dengan vortex. Serat silikon karbida berfungsi
sebagai jarum injeksi mikro (micro injection) untuk
memudahkan perpindahan DNA ke dalam sel.

Sebelum melakukan transformasi ke vector A.tumefaciens,

plasmid yang memiliki DNA rekombinan pada e.coli di isolasi

terlebih dahulu untuk mendapatkan DNA rekombinan murni.

Setelah di isolasi, DNA rekombinan di transformasi ke vector
A.tumefaciens.

Gambar 4. Silikon
Karbid/Whiskers
e. Freeze-Thaw
Freeze-thaw merupakan suatu metode yang dapat membentuk
fase kristalin pada polimer hidrogel yang membuat hidrogel
menjadi lebih kuat dan liat. Selain karena lebih banyaknya fase
kristalin yang terbentuk, kekuatan hidrogel dari metode ini
didapatkan karena fase kristalin hasil freeze-thaw akan
menghasilkan ikatan silang (Puspitasari dkk., 2011; Millon dkk.,
2007).
Metode
freeze-thaw
diharapkan
akan
mampu
meningkatkan kekuatan fisik membran tanpa mengubah
komposisi bahan penyususnnya. Artinya, dengan menggunakan
komposisi penyusun membran yang telah teruji memiliki
biokompatibilitas dan biodegradabilitas yang baik, dapat
diupayakan cara untuk meningkatkan kekuatan fisik membran
tersebut.
Cara melakukan metode ini dimulai dengan pelet E. coli
rekombinan diresuspensi dalam PBS kemudian dimasukan ke
dalam Nitrogen cair selama 1 menit dan dimasukan ke dalam air
mendidih selama 30 detik atau 1 menit, diulang sebanyak 5 kali.

Kemudian hasil freeze thaw disentrifugasi untuk memisahkan

supernatan dan pellet.
f.

Triparental Mating
Triparental mating merupakan sebuah metode konjugasi materi
genetik (DNA) antarsel yang memanfaatkan kontak antarsel
dengan perantara E.coli.
Proses ini membutuhkan tiga komponen yaitu :
Helper strain sebagai strain yang membantu mobilisasi broad
host range plasmid dan tidak akan bereplikasi di recipient
Donor strain sebagai strain yang akan memberi plasmid of
interest
Recipient strain sebagai strain yang akan menerima plasmid
of interes.
Mekanisme triparental mating :
1. Helper plasmid mengkode semua protein untuk membentuk
mating bridge yang akan digunakan untuk transfer dirinya
sendiri dan mobilisasi plasmid lain ke recipient plasmid.
2. Terlebih dahulu hepler plasmid memindahkan dirinya ke
donor strain yang mana membawa GOI yang akan
dipindahkan ke A.tumefaciens.
3. Kemudian, helper plasmid akan membantu mobilisasi
perpindahan plasmid GOI ke dalam A.tumefaciens strain
4. Di dalam A.tumefaciens terdapat helper plasmid dan donor
plasmid. Namun, helper plasmid tidak akan ikut bereplikasi
Proses mating dilakukan dengan menggoreskan atau
mengaduk bersama satu lup koloni bakteri E. coli kemudian
helper (E.coli strain pRK2013) dan Agrobacterium (LBA4404)
secara bergantian pada medium LB padat tanpa antibiotik
(Minarsih, 2003). Selanjutnya kultur diinkubasi pada suhu 28 o C
selama 8- 18 jam. Seleksi dilakukan dengan cara
menumbuhkan kembali koloni bakteri tersebut pada medium
seleksi yaitu LB padat yang mengandung antibiotik rifampisin
dan kanamisin kemudian diinkubasi pada suhu 28o C selama 18
jam. Pada medium seleksi ini diharapkan tumbuh bakteri
Agrobacterium yang membawa plasmid rekombinan.

Gambar 5. Triparental
Mating

Kesimpulan :
Dari beberapa metode transformasi
di atas, dalam kasus ini digunakan
triparental
mating
karena
tahapan
yang
dilakukan
menggunakan bakteri perantara,
yaitu E.coli. Plasmid GOI E.coli
nantinya akan di transfer ke
A.tumefaciens dengan bantuan
helper strain E.coli pRK2013.

Daftar Pustaka

Wideani, Gita. 2011. Transformasi gen OsERA1 (Oryza sativa

Enhanced Response tp ABA1) ke Kalus Padi cv. Taipei 309
Menggunakan Agrobacterium tumefaciens.
http://lib.ui.ac.id/file?file=digital/20281077-S656-Transformasi
%20gen.pdf (diakses pada 24 November 2015)

Fitranty, Niyyah, dkk. 2003. Efektivitas Agrobacterium

mentransfer gen P5CS ke dalam kalus tebu klon PS 851.
http://www.researchgate.net/publication/237656328_Efektivita
s
Agrobacterium_mentransfer_gen_P5CS_ke_dalam_kalus_tebu_
klon_PS_851 (diakses pada 24 November 2015)

Santoso, Tri J, dkk. 2010. Konstruksi Kandidat Gen AV1

Begomovirus pada pBI121 dan Introduksinya ke dalam
Tembakau Menggunakan Vektor Agrobacterium tumefaciens.

http://biogen.litbang.pertanian.go.id/terbitan/pdf/agrobiogen_7
_1_2011_02.pdf (diakses pada 24 November 2015)

Siemens, J, O.Schieder. 1996. Plant Tissue Culture and

Biotechnology vol 2(2): 66-72

NN. Transformation-Plant Cells.

http://plantcellbiology.masters.grkraj.
org/html/Genetic_Engineering4D-TransformationPlant_Cells.htm (diakses pada 24 November 2015)