UJI BATAS MIKROBA

FARMAKOPE INDONESIA EDISI IV

Uji batas mikroba dilakukan untuk mengetahui jumlah mikroba yang ada dalam
semua jenis perbekalan farmasi, baik bahan baku farmasi maupun sediaan jadi. Selain itu, uji
batas mikroba ini bertujuan untuk menyatakan apakah suatu sediaan farmasi bebas dari
mikroba tertentu atau tidak. Uji ini harus dilakukakan secara aseptik. Terdapat istilah-istilah
yang terdapat dalam uji ini, diantaranya :
-

Inkubasi menempatkan wadah dalam suatu ruangan yang dijaga suhunya pada

suhu antara 30OC dan 35OC selama 24-48 jam.

Tumbuh adanya kemungkinan pertumbuhan suatu mikroba tertentu.

A. UJI PENDAHULUAN
Uji pendahuluan dilakukan dengan cara menginokulasikan sampel uji secara terpisah
dengan biakan mikroba Staphylococcus aureus, Eschericia coli, Pseudomonas aeruginosa,
dan Salmonella. Pengujian dilakukan dengan menambahkan 1 ml biakan mikroba yang
berumur 24 jam yang sudah diencerkan sebanyak 10-3 ke sampel uji dalam dapar fosfat pH
7,2 yang menggunakan media Fluid Soybean-Casein Digest atau media Fluid Lactose
Medium.
Jika tidak terdapat pertumbuhan mikroba pada media, pengujian tersebut dinyatakan
tidak berlaku dan perlu adanya modifikasi prosedur sampai terdapat pertumbuhan mikroba.
Modifikasi tersebut dapat dilakukan dengan cara :
a. Meningkatkan volume pengenceran dengan tetap mempertahankan jumlah bahan uji
b. Menambahkan zat inaktivator secukupnya ke dalam pengencer
c. Kombinasi modifikasi a dan b
LARUTAN DAPAR DAN MEDIA
Pada pembuatan media agar, larutkan bahan padat yang dapat larut adalam air. Jika
perlu, panaskan hingga larut sempurna. Tambahkn larutan asam klorida atau natrium
hidroksida secukupnya hingga diperoleh media dengan pH yang diinginkan. Tetapkan pH
pada suhu 25O 2O. Air yang digunakan pada pembuatan media agar, gunakan air murni dan
kadar air pada agar tidak lebih dari 15%.
Larutan dapar yang digunakan dalam pengujian batas mikroba ini adalah larutan
dapat fosfat pH 7,2. Larutkan 34 gr kalium fosfat monobasa P dalam 500 ml air di dalam labu
ukur 1000 ml. Selanjutnya tambahkan 175 ml natrium hidroksida 1 N hingga pH 7,2 0,1.
Tambahkan air sampai tanda, lalu campur. Masukkan ke dalam wadah, sterilkan, dan simpan

dalam lemari pendingin. Sebelum digunakan, encerkan 1 bagian larutan dengan 800 bagian
air dan sterilkan.
Terdapat berbagai media yang terdapat dalam pengujian batas mikroba. Pemilihan
media-media ini berdasarkan jenis mikroba yang akan diuji. Jika dinyatakan lain, media harus
disterilkan dengan pemanasan dalam autoklaf. Waktu pemanasan tergantung pada volume
media yang akan disterilkan. Berikut contoh media yang digunakan dalam uji batas mikroba :
1. Media FCDSLP (Fluid Casein Digest-Soy lecithin-Polysorbate 20 Medium)
2. Media SDA (Soybean-Casein Digest Agar Medium)
3. Media FSCD (Fluid Soybean Casein Digest Medium)
4. Media MSA (Mannitol-Salt Agar Medium)
5. Media BPA (Baird-parker Agar Medium)
6. Media VJA (Vogel-Johnson Agar Medium)
7. Media CETA (Cetrimide Agar Medium)
8. Media PAF (Pseudomonas Agar Medium for Detection of Fluorescin)
9. Media PAP (Pseudomonas Agar Medium for Detection Pyocyanin)
10. Media FLM (Fluid Lactose Medium)
11. Media FSCM (Fluid Selenite-Cystine Medium)
12. Media FTM (Fluid Tetrathionate Medium)
13. Media BGA (Brilliant-Green Agar Medium)
14. Media XLDA (Xylose-Lysine-Desoxycholate Agar Medium)
15. Media BSA (Bismuth Sulfite Agar Medium)
16. Media TSIA (Triple Sugar-Iron Agar Medium)
17. Media MCA (MacConkey Agar Medium)
18. Media LEMBA (Levine Eosin-Methylen Blue Agar Medium)
19. Media SDA (Sabouraud Dextrose Agar Medium)
20. Media PDA (Potato Dextrose Agar Medium)
B. PROSEDUR PENGUJIAN
Untuk sampel uji yang berbentuk salep, krim, malam, dan sediaan yang sukar larut dalam
air, sampel harus dibuat suspensi dengan menggunakan emulgator steril (misalnya salah satu
polisorbat). Gunakan blender mekanik. Jika perlu, hangatkan hingga suhu tidak lebih dari
45OC. Selanjutnya lakukan pengujian seperti yang tertera pada Angka Aerob Total, Uji
Staphylococcus aureus dan Pseudomonas aeruginosa, Uji Salmonella dan Escherichia coli.
ANGKA MIKROBA TOTAL
Terdapat 2 metode dalam pengujian angka mikroba total, yaitu metode lempeng dan
metode tabung ganda. Mula-mula suspensikan 10,0 gr sampel uji di dalam dapar fosfat
dengan media FSCD atau media FCDSLP hinga 100 ml. Masukkan sampel uji ke dalam
media tidak lebih dari 1 jam sesuai untuk inokulasi.
a) Metode Lempeng

Encerkan cairan sedemikian rupa hingga 1 ml cairan dapat menghasilkan 30300 koloni mikroba. Pipet 1 ml enceran akhir ke dalam 2 cawan petri steril.
Tambahkan 15-20 ml media SCDA yang sudah dicairkan dan didinginkan hingga
suhunya 45O. Tutup cawan petri. Campur cairan dengan agar dengan cara
memiringkan cawan. Biarkan isi cawan memadat pada suhu kamar. Balikkan cawan
dan inkubasi selama 48-72 jam. Amati pertumbuhan mikroba.
Hasil : Hitung jumlah mikroba yang ada di kedua cawan petri tersebut. Hasil
yang didapat kemudia dirata-ratakan.
b) Metode Tabung Ganda
Siapkan 14 tabung yang berukuran sama. Tambahkan 9,0 media FSCD steril ke
semua tabung. Pisahkan 12 tabung dan kelompokkan menjadi 4 kelompok. Kelompok
1 menjadi kelompok kontrol. Sedangkan 3 kelompok lain sebagai kelompok 1
(100), kelompok 2 (10), dan kelompok 3 (1). Sisa 2 tabung akan menjadi
tabung A dan tabung B. Masukkan 1 ml suspensi sampel uji kedalam tabung
kelompok 1 dan taabung A, lalu campur. Pipet 1 ml dari tabung A ke dalam tabung B,
dan campur. Tabung A dan tabung B masing-masing berisi 100 mg dan 10 mg
suspensi sampel uji. Tambahkan 1 ml dari tabung A ke dalam tabung kelompok 2.
Selanjutnya tambahkan 1 ml dari tabung B ke dalam tabung kelompok 3. Buang sisa
isi dari tabung A dan tabung B. Tutup semua tabung dan inkubasikan. Amati
pertumbuhan mikroba di setiap tabung. Tabung kontrol akan tetap jernih. Untuk
melihat pertumbuhan mikroba yang ada di tabung kelompok 1, 2 dan 3 gunakan acuan
tabel Nilai Duga Terdekat.
C. UJI MIKROBA SPESIFIK
1. Uji Staphylococcus aureus dan Pseudomonas aeruginosa
Tambahkan media FSCD ke dalam suspensi sampel uji hingga 100 ml, campur dan
inkubasikan. Amati pertumbuhan mikroba pada media. Jika terdapat pertumbuhan
mikroba, inokulasikan biakan bakteri pada permukaan lempeng media VJA (atau media
BPA atau media MSA) dan media CETA. Tutup, balikkan cawan, inkubasi. Amati
pertumbuhan mikroba yang terjadi. Jika setelah pengamatan tidak ada satupun mikroba
yang tumbuh, maka sampel uji memenuhi persyaratan bebas bakteri Staphylococcus
aureus dan Pseudomonas aureus.
a) Uji Koagulase
Uji koagulase dikhususkan untuk bakteri Staphylococcus aureus. Pindahkan
sejumlah koloni bakteri ke permukaan media VJA atau media BPA atau media
MSA ke dalam tabung yang berisi 0,5 ml plasma mamalia (kelinci atau kuda).
Inkubasi di dalam penangas air pada suhu 37OC. Amati tabung pada 3 jam

pertama, selanjutnya pada jarak waktu yang sesuai selama 24 jam. Lakukan uji
kontrol positif dan negatif bersamaan dengan uji suspensi sampel. Jika sama
sekali tidak terjadi reaksi koagulase, maka sampel uji dinyatakan bebas
Staphylococcus aureus.
b) Uji Oksidase dan Pigmen
Uji oksidase dan pigmen dikhususkan untuk bakteri Pseudomonas
aeruginosa. Pindahkan sejumlah koloni bakteri dari permukaan media CETA ke
permukaan media PAF (untuk mendeteksi fluoresin) dan media PAP (untuk
mendeteksi piosianin). Tutup dan balikkan cawan. Inkubasi pada suhu 35O 2O
selama 3 hari. Amati permukaan cawan dibawah sinar ultraviolet.
Lakukan uji oksidase untuk mengonfirmasi adanya bakteri Pseudomonas
aeruginosa. Pindahkan koloni bakteri ke atas potongan kertas saring yang
sebelumya

telah

diimpregnasi

dengan

N,N-dimetil-p-fenilendiamina

dihidroklorida. Jika tidak terjadi perubahan warna merah muda menjadi

lembayung, sampel uji dinyatakan bebas dari bakteri Pseudomonas aeruginosa.
2. Uji Salmonella dan Escherichia coli
Tambahkan sejumlah volume media FLM ke dalam suspensi sampel uji hingga 100
ml, dan inkubasi. Amati pertumbuhan pada media. Jika terdapat pertumbuhan koloni
mikroba, pipet 1 ml ke dalam wadah yang berisi 10 ml media FSCM dna media FTM,
campur, dan inkubasi selama 12-24 jam. Simpan sisa media FLM.
a) Uji Salmonella
Pindahkan sebagian media FSCM dan media FTM ke permukaan media
BGA, XLDA, dan media BSA yang terdapat di dalam cawan petri. Tutup dan
balikkan cawan petri. Jika tidak terdapat pertumbuhan sama sekali, maka sampel
uji dinyatakan bebas bakteri Salmonella. Sedangkan jika ada pertumbuhan
bakteri, lanjutkan identifikasi dengan memindahkan sejumlah koloni ke dalam
media TSIA. Goreskan ke permukaan media kemudian lakukan penusukan ke
dasar media, dan inkubasi. Jika pada permukaan tidak terdapat reaksi alkali yang
ditandai dengan warna merah dan reaksi asam yang ditandai dengan warna
kuning pada tusuka ke dasar media, maka sampel uji dinyatakan bebas bakteri
Salmonella. Berikut beberapa uji untuk mengidentifikasi adanya bakteri
Salmonella dalam suatu sediaan farmasi :
Jenis Uji

Media yang

Warna yang dihasilkan

Uji Indol

digunakan
Media Indol

+ terbentuk gelang merah

- tidak berwarna atau warna kuning

Uji Voges

Media methyl red-

Proskauer

voges prokauer (MR-

Uji

VP)
Media cair lysine

Dekarboksilasi

decarboxylase broth

kecoklatan
+ warna merah muda hingga merah tua
- warna tidak berubah
+ timbul warna ungu

Lisin
(Sumber : Radji, M. (2010). Buku Ajar Mikrobiologi : Panduan Mahasiswa Farmasi dan
Kedokteran. Jakarta : EGC)
b) Uji Escherichia coli
Goreskan sebagian dari sisa media FLM pada permukaan media MCA.
Tutup, balikkan cawan, dan inkubasi. Jika tidak terdapat pertumbuhan, maka
sampel uji langsung dinyatakan bebas bakteri Escherichia coli. Sebaliknya, jika
terdapat pertumbuhan, lanjutkan pengujian dengan cara memindahkan koloni
bakteri ke permukaan media LEMBA ke dalam cawan petri. Tutup, balikkan
cawan, dan inkubasi. Jika pada pengamatan tidak terdapat pertumbuhan koloni
bakteri yang ditandai dengan kilauan logam yang khas di bawah cahaya yang
dipantulkan dan warna biru hitam pada cahaya yang diteruskan, maka sampel uji
bebas dari bakteri Escherichia coli. Berikut beberapa reaksi khusus untuk
menguji adanya bakteri Escherichia coli :
Jenis Uji

Media yang

Uji Indol
Uji Metil

digunakan
Media trytone broth
Media methyl red-

Merah

voges prokauer (MR-

Uji Voges

VP)
Media methyl red-

Proskauer

voges prokauer (MRVP)

Media simmons citrate

Warna yang dihasilkan

+ warna merah tua
+ warna merah
- warna kuning
+ warna merah muda hingga merah tua
- warna tidak berubah

+ warna biru
- warna hijau
(Sumber : Radji, M. (2010). Buku Ajar Mikrobiologi : Panduan Mahasiswa Farmasi dan
Uji Sitrat

Kedokteran. Jakarta : EGC)

UJI STERILITAS SEDIAAN FARMASI

Sumber : Radji, M. (2010). Buku Ajar Mikrobiologi : Panduan Mahasiswa Farmasi dan
Kedokteran. Jakarta : EGC
Uji sterilitas adalah suatu pengujian yang dilakukan dengan tujuan untuk mengetahui
adanya mikroorganisme yang hidup atau memiliki daya hidup dalam suatu sediaan yang
sudah disterilkan. Prinsip uji sterilitas ini adalah menginokulasikan atau membiakkan
mikroorganisme yang terdapat dalam sediaan uji dalam media perbenihan yang sesuai. Media
yang digunakan dalam uji ini adalah media tioglikat cair dan Soybean-Casein Digest
Medium.

Terdapat 2 cara dalam uji sterilitas, yaitu :

a) Pengujian secara langsung
Pengujian ini dilakukan dengan cara menginokulasikan secara langsung sediaan yang
akan diuji ke dalam media perbenihan yang sesuai secara aseptis. Sediaan yang
disterilisasi dengan cara ini diantaranya :
- Sediaan yang bervolume kurang dari 10 ml
- Sediaan yang tidak mengandung antibiotik atau antimikroba. Apabila sediaan
tersebut mengandung antimikroba, antimikroba tersebut harus diinaktivasi
terlebih dahulu dengan larutan inaktivator.
b) Pengujian dengan menggunakan penyaring membran
Pengujian ini dilakukan dengan cara menyaring larutan sediaan melalui suatu
membran yang sesuai, kemudian membran tersebut diletakkan pada media perbenihan
yang sesuai secara aseptis. Membran filter yang biasa digunakan adalah membran
yang memiliki ukuran pori-pori 0, 45 g dan garis tengah 47 mm. Kecepatan alir
larutan 55-75 ml/menit pada tekanan 70 mmHg. Terdapat 3 jenis membran filter, yaitu
membran hidrofilik, membran hidrofobik, dan membran hidrofilik-hidrofobik.
Sediaan yang disterilisasi dengan cara ini diantaranya :
- Sediaan yang bervolume besar seperti cairan infus

Sediaan yang mengandung lemak/minyak

Sediaan yang bervolume lebih dari 10 ml
Sediaan yang mengandung antibiotik atau antimikroba
Untuk beberapa jenis sediaan, biasanya dilakukan pembilasan membran filter

setelah penyaringan sediaan. Larutan pembilas yang digunakan untuk membilas

membran filter dibagi menjadi 3 jenis, diantaranya :

Larutan A : larutan pepton 0,1%. Biasanya digunakan untuk larutan air

Larutan D : larutan pepton 0,1% dan tween 80 0,1% . larutan ini digunakan

untuk larutan yang mengandung lemak/minyak.

Larutan K : larutan pepton 0,5%, ekstrak daging sapi 0,3%, dan polisorbat 80
0,1%. Larutan ini digunakan untuk larutan selain lemak/minyak, seperti
petrolatum.

Sebelum dilakukan pengujian sterilitas, perlu dilakukan uji fertilitias media. Uji
fertilitas ini dilakukan untuk mengetahui apakah media yang digunakan dalam uji
sterilitas layak untuk digunakan.
A. Pengujian Sterilitas secara Langsung untuk Sediaan yang Berbentuk Salep, Minyak, atau
Lemak yang Tidak Larut dalam Isopropil Miristat
Sampel dibagi menjadi 2 kelompok dimana masing-masing terdiri dari 10 wadah. Dari
kesepuluh wadah tersebut, diambil dan ditimbang masing-masing sebanyak 100 mg sampel
uji. Kemudian dimasukkan ke dalam 100 ml larutan pendispersi dan kocok homogen. Larutan
pendispersi disesuaikan dengan sampel dan tidak bersifat antimikroba. Sebanyak 10 ml
suspensi sampel uji dimasukkan kedalam 80 ml media trypticase soy broth dan 80 ml fluid
thioglycollate medium, kemudian homogenkan dengan hati-hati. inkubasi selama 14 hari pada
suhu 35OC untuk fluid thioglycollate medium dan pada suhu 25OC untuk trypticase soy broth.
B. Pengujian dengan Sterilitas untuk Sediaan yang Berbentuk Salep, Minyak, atau Lemak
yang Larut dalam Isopropil Miristat
Siapkan wadah sebanyak 20 buah. Ambil dan timbang 100 mg sampel uji kemudia
larutkan dalam 100 ml larutan isopropil miristat yang telah disterilkan dengan penyaringan
menggunakan membran 0,22 g, pH 6,5. Jika perlu, hangatkan pada suhu 45 OC selama 15
menit, kemudian disaring melalui membran filter dengan bantuan pompa vakum. Setelah
penyeringan, membran dicuci 2 kali dengan menggunakan 200 ml Larutan pembilas D,
kemudian dibilas sekali lagi dengan menggunakan larutan pembilas A.
Bila sediaan zat uji mengandung vaselin (petrolatum), cairan pembilas yang digunakan
adalah larutan pembilas K. Sebelum penyeringan, membran dibasahi terlebih dahulu dengan

200 ml larutan pembilas. Setelah penyaringan, membran dibilas 3 kali dengan 100 ml larutan
pembilas K.
C. Penafsiran Hasil Uji
Setelah akhir masa inkubasi, pertumbuhan mikroba diamati disetiap wadah.
Pertumbuhan mikroba ditandai dengan terjadinya kekeruhan atau pertumbuhan pada
permukaan media. Jika tidak terjadi pertumbuhan, sampel dinyatakan memenuhi syarat
sterilitas. Jika tidak memenuhi syarat, pengujian ini dilakukan ulang dengan jumlah sampel
dinaikkan menjadi 2 kali lipat dari pengujian pertama.
UJI POTENSI ANTIBIOTIK
Sumber : Radji, M. (2010). Buku Ajar Mikrobiologi : Panduan Mahasiswa Farmasi dan
Kedokteran. Jakarta : EGC
Antibiotik adalah suatu senyawa yang dihasilkan oleh suatu mikroorganisme
tertentuyang pada konsentrasi rendah dapat memusnahkan atau mebghambat pertumbuhan
mikroorganisme lain. Uji potensi antibiotik ini dilakukan untuk memberikan jaminan kualitas
dan mutu antibiotik yang digunakan dalam pengobatan memenuhi syarat yang telah
ditentukan. Prinsip dari pengujian ini adalah membandingkan dosis larutan sediaan uji
terhadap dosis larutan baku pembanding yang menghasilkan derajat hambatan yang sama
pada mikroorganisme uji. Terdapat 2 metode dalam uji potensi antibiotik ini, yaitu :
a) Metode turbidimetri (tabung)
Prinsip dari metode ini adalah membandingkan hambatan pertumbuhan
mikroorganisme

dalam

media

cair

yang

mengandung

larutan

antibiotik.

Mikroorganisme diinokulasikan ke dalam media cair yang mengandung antibiotik ke

dalam tabung. Pertumbuhan mikroorganisme ditandai dengan adanya kekeruhan
media pada tabung uji. Rasio potensi antibiotikya adalah perbandingan kekeruhan
media dalam tabung uji dengan kekeruhan media dalam tabung antibiotik baku
pembanding.
b) Metode lempeng silinder (difusi agar)
Prinsip dari metode ini adalah membandingkan zona hambatan pertumbuhan
mikroorganisme uji oleh dosis antibiotik uji terhadap zona hambatan oleh dosis
antibiotik

baku

pembanding

pada

media

lempeng

agar.

Mikroorganisme

diinokulasikan ke dalam media lempeng agar di cawan petri. Kemudian dimasukkan

silinder besi tahan karat kedalamnya. Larutan antibiotik akan berdifusi keluar dari
silinder besi tersebut dan menghambat pertumbuhan mikroorganisme uji yang berada

di sekeliling silinder. Rasio antibiotiknya adalah perbandingan ukuran garis tengah

zona hambatan yang disebabkan oleh larutan antibiotik uji dan larutan antibiotik baku
pembanding.
Penetapan potensi antibiotik menurut Farmakope Indonesia edisi IV
Prinsip uji potensi antibiotik menurut FI IV adalah menginterpolasikan derajat
hambatan pertumbuhan mikroorganisme uji yang diperoleh secara difusi agar dari dosis
sediaan uji terhadap kurva baku dari dosis sediaan baku. Penetapan ini menggunakan 5 dosis
larutan baku pembanding (S1, S2, S3, S4, S5) dan satu dosis larutan uji dengan konsentrasi
yang sama dengan dosis standar 3 (S3). Uji ini menggunakan 15 buah cawan petri karena
penetapan dilakukan secara triplo.

Inokulum
Inokulum mikroorganisme dibuat dalam media cair.konsentrasi yang dibutuhkan
adalah 106 sampai 107 sel/ml. Syarat-syarat mikroorganisme yang digunakan adalah galur
murni koleksi laboratorium berstandar, peka terhadap antibiotik, dan selalu dilakukan
peremajaan minimal 1 minggu sekali.
Larutan antiobiotik pembanding
Terdapat 3 jenis antibiotik baku pembanding, diantaranya adalah baku pembanding
internasional, baku pembanding nasional, dan baku pembanding kerja. Namun yang biasa
digunakan dalam penetapan potensi antibiotik adalah baku pembanding kerja.
Tingkat dosis

Terdapat 5 tingkatan dosis, yaitu : S1, S2, S3, S4, S5. S3 bertindak sebagai acuan.
Contoh :
Apabila S3 adalah 10 g/ml, maka dosis baku lainnya adalah :
o S2 = 4/5 x 10 g/ml = 8 g/ml
o S1 = 4/5 x 8 g/ml = 6,4 g/ml
o S4 = 5/4 x 10 g/ml = 12,5 g/ml
o S5 = 5/4 x 12,5 g/ml = 15,625 g/ml
Cara Perhitungan
Untuk menghitung data potensi, gunakan metode garis lurus transformasi log dengan
prosedur penyeseuaian kuadrat terkecil dan uji linearitas. Bila sejumlah penetapan dari bahan
uji yang sama dilakukan menggunakan kurva baku yang sama, hitung koefisien variasi dari
hasil semua penetapan bahan uji.