Nama NIM Kelas Kelompok Hari,tanggal Waktu PJP Asisten
: Eka Yulianti : J3M113016 : LNK A P1 : V (lima) : Sabtu, 10 Mei 2014 : 14.00 18.00 WIB : M. Arif Mulya, S.Pi : Ivone Ramdhani
INDENTIFIKASI BAKTERI (Karakteristik Sifat Biokimia dan Fisiologis Bakteri)
TEKNIK DAN MANAJEMEN LINGKUNGAN
PROGRAM DIPLOMA INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2014
Pendahuluan Bakteri adalah organisme bersel tunggal yang hidup bebas dan mampu bereproduksi sendiri tetapi menggunakan hewan sebagai penjamu untuk mendapatkan makanan. Bakteri tidak memiliki inti sel. Bakteri terdiri atas sitoplasma yang dikelilingi oleh sebuah dinding sel yang kaku yang terbuat dari suatu zat khusus yang disebut peptidoglikan, didalam sitoplasma terdapat materi genetik, baik DNA maupun RNA, dan struktur intrasel yang diperlukan untuk metabolisme energi. Bakteri bereproduksi secara aseksual melalui replikasi DNA dan pembelahan sel sederhana (Corwin 2008). Pada umumnya bakteri bersifat tembus cahaya, hal ini disebabkan karena banyak bakteri yang tidak mempunyai zat warna (Waluyo 2004) . Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan. Sifat metabolisme bakteri dalam uji biokimia biasanya dilihat dari interaksi metabolit-metabolit yang dihasilkan dengan reagen-reagen kimia. Kemampuan bakteri menggunakan senyawa tertentu sebagai sumber karbon dan sumber energi yang dapat digunakan untuk identifikasi. Uji-uji biokimia yang biasanya dipakai dalam kegiatan identifikasi bakteri atau mikroorganisme yaitu antara lain adalah, uji gelatin, uji oksidatif/fermentatif, uji motilitas, dan uji oksidase (Dwidjoseputro 1994). Karakterisitik utama mikroorganisme untuk identifikasi dan klasifikasi suatu mikroorganisme perlu diketahui karekteristiknya sebanyak mungkin, karakteristiknya yang pertama adalah karakteristik kultural yaitu mikroorganisme memerlukan media yang bersifat khusus, utamanya berteknologi memerlukan bakteri tertentu untuk dapat tumbuh dan berkembangbiak. Jenis kapang dapat tahan keasaman sampai kira-kira pH 3, sedangkan bakteri pada umumnya tidak tahan asam, yang kedua adalah karakteristik mikroskopik dimana digunakan untuk melihat wujud suatu mikroba, terutama bakteri, diperlukan suatu mikroskop dengan pembesaran sekitar 1000 kali. Karakteristik ketiga adalah karakteristik metabolik yang dapat kita lihat dari bentuknya saja seringkali mencukupi untuk menentukan karakter organisme tertentu. Karakteristik keempat adalah Karakteristik Kimiawi, dimana dalam hal ini diperlukan analisis kimia untuk dapat mengetahui zat atau unsur kimia maupun susunan kimia yang terdapat dalam bakteri tersebut, bahkan bagian-bagian suatu bakteri perlu dianalisis pula. Karakteristik kelima adalah karakteristik antigenik, disini diperlukan hewan besar tertentu untuk disuntik dengan mikroba yang tidak diketahui, diambil serumnya untuk dilakukan reaksi antigen antibiotik yang bersifat sangat spesifik. Karakteristik keenam adalah karakteristik genetik dilakukan dengan karakteristik mikroorganisme atas dasar susunan DNA yang ternyata bersifat konstan pada suatu mikroorganisme tertentu, dinyatakan dalam % (G+C) Guanine dan Cytosine (Mulyono 1992). Tujuan Percobaan bertujuan mengidentifikasi bakteri dengan melihat dan menentukan sifat dan fisiologis bakteri melalui uji-uji kualitatif yaitu uji oksidase, uji katalase, uji motilitas, uji oxidatif / Fermentasi, dan uji gelatin.
Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan, yaitu tabung reaksi dan tutup, rak tabung reaksi, bunsen, kawat inokulum, ose, pipet tetes, kertas cakram, dan gelas objek. Bahan-bahan yang digunakan, yaitu biakan bakteri B, paraffin cair, H2O2 cidro, media O/F, media SIM (Sulfida Indol Motility), reagen P-aminodimetil anilina oksalat 1%, dan media nutrien gelatin. Metode Kerja Uji katalase dilakukan dengan diambilnya satu ose koloni bakteri B secara aseptis dan diinokulasikan pada object glass pada dua titik dengan salah satunya sebagai kontrol. Setelah itu, dengan menggunakan pipet tetes, 3% H 2O2 diteteskan pada object glass secukupnya pada salah satu daerah yang telah ada bakterinya, kemudian diamati, jika ada gelembung beberapa saat setelah penetesan larutan H2O2 maka hasil uji positif dan jika tidak ada gelembung maka hasilnya negatif. Uji oksidase dilakukan dengan sebanyak dua buah gelas objek disiapkan dan diletakkan kertas cakram steril pada masing-masing gelas objek tersebut. Salah satu kertas cakram digunakan sebagai kontrol. Kemudian, diteteskan reagen P-aminodimetil anilina oksalat 1% pada dua buah kertas saring, lalu diambil biakan cair bakteri B dan diteteskan pada salah satu kertas cakram yang telah mengandung reagen P-aminodimetil anilina oksalat 1%. Perubahan yang terjadi diamati, jika warna berubah maka hasil uji positif, sedangkan jika tidak terjadi perubahan warna menjadi biru violet maka hasil uji negatif. Teknik tersebut dilakukan secara aseptik. Uji oksidatif/fermentatif dilakukan dengan dua buah tabung yang berisi media O/F disiapkan terlebih dahulu lalu biakan bakteri B diambil sebanyak satu ose dan diinokulasikan secara vertikal pada media O/F, salah satu tabung ditetesi 1 ml paraffin cair dan tabung yang satu lagi tidak ditetesi paraffin cair kemudian kedua tabung diinkubasikan selama 24 jam, jika tabung yang tidak diberi paraffin menghasilkan warna hijau dan tabung yang diberi paraffin menghasilkan warna kuning maka bakteri merupakan fermentatif/ anaerob, jika tidak diberi paraffin kuning dan diberi paraffin hijau maka hasilnya adalah oksidatif. Jika diberi dan tidak diberi paraffin hasilnya adalah kuning maka bakteri termasuk oksidatif fermentatif, jika kedua tabung hijau maka negatif. Uji motilitas dilakukan dengan media SIM disiapkan terlebih dahulu lalu biakan bakteri B diambil sebanyak satu ose dan diinokulasikan secara vertikal pada media SIM. Kemudian, diinkubasi selama 24 jam. Teknik tersebut dilakukan secara aseptik. Hasil uji motilitas bakteri diperlihatkan dengan adanya pertumbuhan bakteri pada permukaan media dan tidak hanya bekas pada tusukan, bakteri non motil tumbuh sepanjang tusukan, pembentukkan dan adanya pembebasan sulfida ditunjukkan dengan terbentuknya warna hitam. Uji gelatin dilakukan dengan media nutrien gelatin disiapkan lalu biakan bakteri B diambil sebanyak satu ose dan diinokulasikan secara vertikal pada media nutrien gelatin tersebut, kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37C. Teknik tersebut dilakukan secara aseptik. Hasil uji positif jika gelatin
terhidrolisa atau tetap cair, sedangkan hasil uji negatif jika gelatin tidak terhidrolisa atau membeku. Data dan Hasil Pengamatan Tabel 1 Hasil Pengamatan Identifikasi Bakteri B Uji Hasil Keterangan Katalase Tidak terjadi gelembung Oksidase Tidak terjadi perubahan warna merah O/F NT Not testable Tanpa parafin + Menjadi berwana kuning Parafin + Menjadi berwarna kuning Motilitas + Terdapat motil Gelatin + Gelatin tetap cair Hasil uji Katalase, Oksidase, O/F, Motilitas dan Gelatin dapat dilihat pada gambar berikut: Gambar 1 hasil uji Katalase bakteri B Gambar 2 hasil uji oksidase pada bakteri B Gambar 3 hasil uji O/F pada bakteri B Gambar 4 hasil uji Motilitas pada bakteri B Gambar 5 hasil uji Gelatin pada bakteri B
Pembahasan Uji Oksidase dilakukan untuk mengetahui apakah bakteri dapat menguraikan enzim oksidase atau tidak. Perubahan warna yang terjadi pada test strip tadi diamati setelah didiamkan selama 20-60 detik. Apabila terjadi perubahan warna menjadi biru violet maka oxidase test dinyatakan positif dan menandakan bahwa bakteri tersebut adalah bakteri non enterik, sedangkan bila tidak terjadi perubahan warna maka oxidase test dinyatakan negatif dan menandakan bakteri tersebut adalah bakteri enterik (Marlina 2008). Uji oksidase bertujuan untuk menentukan bakteri enterik atau non enterik. Enzim sitokrom oksidase akan berubah menjadi bentuk tidak aktif dengan mereduksi sitokrom c. Enzim ini akan menjadi bentuk aktifnya kembali jika terjadi transfer elektron ke molekul oksigen. Keberadaan oksigen pada enzim oksidase akan mereduksi substan-substan organik diantaranya substan yang terdapat pada oxidase test strip yang mengandung N,N dimetil1,4 fenilen diammonium diklorida dan 1 naftol. Reaksi tersebut akan menghasilkan molekul indophenol blue yang mengakibatkan warna test strip akan berwarna biru violet. Reaksi ini merupakan reaksi positif untuk bakteri non enterik sedangkan pada bakteri enterik tidak terjadi perubahan warna. Berdasarkan percobaan hasil yang diperoleh adalah bakteri tidak menghasilkan perubahan warna yang menandakan bahwa pada uji ini menunjukan hasil yang negatif. Uji katalase digunakan untuk mendeteksi adanya enzim katalase. Enzim ini terdapat pada sel - sel yang mempunyai metabolisme aerobik. Bakteri anaerob tidak mempunyai enzim katalase. Uji katalase merupakan salah satu pengujian biokimia untuk mengidentifikasi bakteri apakah menghasilkan enzim katalase atau tidak. Enzim katalase dihasilkan oleh beberapa jenis bakteri dalam rangka mencegah oksidasi radikal bebas yang dapat merusak atau membunuh bakteri, ada beberapa jenis pengujian biokimia lain yang merupakan bagian dari pengidentifikasian suatu jenis bakteri diantaranya yaitu, kemampuan bakteri menghasilkan enzim hidrolitik terhadap substrat yang ditambahkan pada media, kemampuan memfermentasi gula, mengoksidasi nitrat dan sebagainya. Reagen yang digunakan sebagai pereaksi mengandung 3% larutan Hidrogen peroksida. Enzim katalase akan bereaksi dengan hydrogen peroksida yang menghasilkan gas (oksigen). Percobaan dilakukan dengan cara di atas kaca objek ditetesi satu tetes H2O2 3%, ditambahkan koloni bakteri dan langsung diamati terjadinya penguraian hidrogen peroksida dinyatakan positif bila menghasilkan enzim katalase yang ditandai dengan terbentuknya gelembung udara dan negatif bila tidak ada gelembung udara, ini terjadi karena bakteri yang apabila ditambahkan hidrogen peroksida menghasilkan peroksida. Mekanisme enzim katalase memecah H2O2 yaitu saat melakukan respirasi, bakteri menghasilkan berbagai macam komponen salah satunya H2O2. Bakteri yang memiliki kemampuan memecah H2O2 dengan enzim katalase maka segera membentuk suatu sistem pertahanan dari toksik H2O2 yang dihasilkannya sendiri. Bakteri katalase positif akan memecah H2O2 menjadi H2O dan O2 dimana parameter yang menunjukkan adanya aktivitas katalase tersebut adalah adanya gelembung-gelembung oksigen seperti pada percobaan yang telah dilakukan. Prinsip dari uji katalase adalah pernapasan
anaerob, mikroorganisme memproduksi hydrogen peroksida dan dalam beberapa
kasus, bahkan mencapai racun toksik superoksida. Akumulasi dari zat ini dapat mengakibatkan kematian organisme kecuali mereka dapat mendegradasi secara enzimatis. Zat ini diproduksi ketika lingkungan aerob, fakultatif anaerob, dan mikroaerofil digunakan dalam jalur pernapasan aerobic, dimana oksigen merupakan akhir aseptor electron, selama pendegradasian karbohidrat untuk produksi energy. Organisme mampu memproduksi katalase yang secara cepat mampu mendegradasi hydrogen peroksida. Organisme aerobic yang kekurangan katalase dapat mendegradasi terutama superoksida toksik menggunakan enzim superoksida dismutase. Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan dengan menggunakan bakteri B maka hasil menunjukan bahwa tidak membentukk gelembung gas yang menandakan bahwa pada uji katalase bakteri B menunjukan hasil negatif. Media O/F merupakan salah satu media yang digunakan untuk pengujian fisio-metabolisme suatu bakteri yaitu untuk mengetahui kemampuan memecah karbohidrat (glukosa) dalam suasana aerobik (oksidatif) dan anaerobik (fermentative) (Pelczar 1986). Bakteri yang menghasilkan warna kuning jika ditambahkan paraffin cair merupakan bakteri yang dapat memanfaatkan glukosa. Berdasarkan percobaan maka pada tabung yang tidak diberikan paraffin cair menghasilkan warna kuning dan pada bakteri yang ditambahkan paraffin cair juga menghasilkan warna kuning sehingga bakteri ini termasuk bakteri oksidatif dan bakteri fermentatif. Prinsip uji motilitas yaitu untuk mengetahui apakah bakteri yang diamati motil (bergerak) atau tidak. Apabila setelah dilakukan inkubasi selama 24 jam, bakteri tumbuh pada permukaan media, maka bakteri tersebut motil atau uji positif, tetapi bila bakteri hanya tumbuh pada bekas tusukan jarum inokulasi, maka bakteri tersebut tidak motil atau uji negatif (Tarigan 1988). Pada percobaan yang dilakukan bakteri hanya tumbuh pada bagian yangg ditusukan saja sehingga hasil yang didapatkan adalah bakteri nonmotil. Larutan gelatin bersifat cair pada suhu ruang atau suhu kamar dan padat apabila berada dalam lemari es. Bila gelatin telah dihidrolisa oleh jasad renik akan tetap bersifat cair meskipun berada dalam lemari es. Hidrolisis gelatin terjadi karena bakteri menghasilkan gelatinase untuk menghidrolisis polimer protein, gelatin, asam amino. Prinsip uji Gelatin yaitu untuk melihat kepemilikian enzim proteolitik pada bakteri untuk menguraikan gelatin. Gelatin yang telah teruraikan oleh bakteri tidak akan membeku pada suhu dingin. Sebaliknya gelatin yang tidak teruraikan oleh bakteri akan membeku pada suhu dingin. Jadi uji positif ditandai dengan gelatin yang cair pada suhu dingin (Lehninger 1982). Berdasarkan hasil percobaan maka bakteri B tetap cair meskipun pada suhu dingin sehingga menghasilkan hasil positif pada uji gelatin. Simpulan Berdasarkan hasil percobaan maka pada uji katalase diperoleh hasil negatif, pada uji oksidase diperoleh hasil negatif, pada uji O/F bakteri menunjukan hasil Not Testable dan bakteri tersebut adalah bakteri aerob dan bakteri anaerob. Pada uji Motilitas pada bakteri B menunjukan hasil positif dan
pada uji gelatin bakteri B menunjukan hasil positif dapat disimpulkan dengan menggunakan tabel Cowan maka bakteri B merupakan bakteri Bacillus. Daftar Pustaka Corwin E. 2008. Buku Saku Patofisiologi. Subekti, Nike Budhi, penerjemah. Jakarta : Penerbit Buku Kedokteran EGC. Terjemahan dari: Handbook Of Pathophysiology. Dwidjoseputro. 1994. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta: Djambatan Lehninger, AL. 1982. Dasar-dasar Biokimia. Penerjemah: Manggy Thenawijaya. Jakarta: Erlangga. Terjemahan dari Principle of Biochemistry Marlina. 2008. Identifikasi bakteri Vibrio parahaemolitycus dengan metode Biolog dan Deteksi Gen ToxRnya secara PCR. Jurnal Sains dan Teknologi Farmasi Vol 13 No 1 2008 Mulyono. 1992. Teknologi Fermentasi. Bogor : IPB Pelczar MJ, Chan E.C.S. 1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta: UI-Press. Taringan J. 1988. Pengantar Mikrobiologi. Jakarta: Departemen pendidikan Waluyo, L. 2004. Mikrobiologi Umum. Malang: Universitas Muhamadiyah Malang
