PENDAHULUAN
1. 1 Latar Belakang
terdiri atas gula, basa nukleotida, dan gugus fosfat. Secara alami, polimer DNA
membentuk untai ganda yang disatabilkan oleh ikatan hidrogen antara pasangan basa.
Setiap sel mengandung untai DNA yang disebut kromosom yang diturunkan dari satu
berukuran jauh lebih besar dari satu molekul DNA di dalam prokariot. Molekul DNA
dalam eukariot bergabung dengan sistem protein dan dikelompokkan menjadi serabut
kromatin dalam molekul yang dikelilingi oleh sistem membran ganda yang bersifat
dalam satu sel. DNA mitokondria memiliki fungsi yang sangat penting dalam
secara maternal dan tidak ada rekombinasi. Pada DNA mitokondria terdapat daerah
pengontrol yang tidak mengkode (noncoding region), yang dikenal dengan daerah
1
PCR (Polymerase Chain Reaction) merupakan teknik in vitro yang sangat
berguna dalam membuat salinan DNA. PCR memungkinkan sejumlah kecil sekuens
DNA tertentu disalin untuk diperbanyak atau dimodifikasi secara tertentu. Dengan
teknik ini, perbanyakan fragmen DNA dapat dilakukan secara cepat dan spesifik.
PCR memanfaatkan enzim DNA polimerase yang secara alami memang berperan
dalam perbanyakan dalam proses replikasi. Teknik PCR dilakukan dengan siklus
suhu berulang. Setiap siklus terdiri atas tahap denaturasi (pembukaan untai ganda
DNA) pada suhu 92,5˚ – 97,5˚C; annealing (penempelan primer) pada suhu 60˚C; dan
Salah satu sifat unik DNA mitokondria adalah laju mutasi yang relatif lebih
tinggi dibandingkan DNA inti. Laju mutasi DNA mitokondria yang tinggi
(tingkat polimorfisme yang tinggi). Karena sifat tersebut, DNA mitokondria dapat
populasi.
berasal dari sel folikel akar rambut. Digunakannya sel folikel akar rambut sebagai
sampel adalah karena sel tersebut dapat dikatakan mewakili keseluruhan jenis sel
yang ada pada tubuh manusia. Hal ini disebabkan karena sel tersebut bersumber dari
satu sel telur yang memiliki satu jenis DNA mitokondria, yang kemudian
2
terdiferensiasi seiring dengan perkembangan embrio. Pada fase perkembangan
perubahan pada urutan nukleotida DNA mitokondria pada sel rambut dalam satu
individu. Oleh karena itu, urutan nukleotida D-loop DNA mitokondria pada sel
1. 2 Identifikasi Masalah
1. Mengisolasi DNA mitokondria dari sampel sel folikel akar rambut dengan
agarosa.
1. 4 Kegunaan Percobaan
3
1. Memberikan informasi tentang fragmen D-Loop DNA mitokondria dari sel
1. 5 Metodologi Percobaan
mitokondria dengan cara lisis sel, amplifikasi fragmen D-loop DNA mitokondria
dengan metode Polymerase Chain Reaction (PCR), dan analisis hasil PCR dengan
UNPAD, jalan Singa perbangsa No. 2, pada tanggal 26 November 2009 dan 3
Desember 2009.
4
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Mitokondria
Mitokondria berasal dari kata Yunani mito yang berarti benang dan chondrion
yang berarti seperti granul (butiran-butiran), sehingga dapat diartikan sebagai organel
orgnel yang unik karena memiliki DNA tersendiri dengan sifat-sifat yang spesifik
Mitokondria memiliki dua membran, luar dan dalam. Membran dalam berlipat
membentuk Krista. Ruang antar mabran berada antara membran dan matriks menutup
membran dalam. Bentuk dan jumlah mitokondria berbeda tipa jenis sel tergantung
pada kebutuhan energi sel tersebut (Stryer, 2002). Protein yang terlibat di dalam
respirasi sel dan sintesis ATP berada di dalam membrane dalam (Lehtinen, 2001).
2.2 DNA
DNA adalah pembawa informasi genetik yang paling bertanggung jawab atas
karakteristik dari suatu sel. Semua informasi tersebut dikode dalam struktur DNA.
DNA marupakan polimer nukleotida yang sangat panjang. Setiap nukleotida terdiri
dari tiga unit, yaitu suatu gula dengan 5 atom C, suatu basa nitrogen dan basa fosfat.
Basa Nitrogen adalah cincin heterosiklik yang mempunyai kerangka karbon dan
nitrogen. Ada dua kelas basa nitrogen, yaitu puri dan pirimidin. Purin terdiri dari
5
cincin dengan 6 atom karbon bercampur dengan cincin dengan 5 atom karbon,
sedangkan pirimidin terdiri dari suatu cincin tunggal mengandung 6 atom karbon.
Nukleotida terdiri dari kombinasi satu buah gula, satu buah basa nitrogen dan paling
seikit satu buah gugus fosfat. Suatu rantai tunggal DNA merupakan suatu polimer
dari nukleotida-nukleotida yang berikatan satu sama lain dengan ikatan fosfodiester
3’-5’. Kerangka dari polimer tersebut disebut kerangka gula fosfat karena terdiri dari
unit-unit gula deoksiribosa dan gugus fosfat pada ikatan fosfodiesternya. Rantai
tunggal DNA kemudian berikatan dengan rantai tunggal lainnya sehingga menjadi
rantai ganda DNA. Kemudian pada rantai ganda DNA tersebut membentuk rantai
komplementer yang berbentuk heliks. Pembentukan struktur heliks ini terjadi karena
dalam satu sel. Pewrisan sifat DNA mitokondria dilakukan secara maternaldan tidak
ada rekombinasi. Pada DNA ini terjadi laju mutasi yang tinggi. Karena sifat tersebut,
individu dalam suatu populasi, hubungan evolusi diantara populasi dan rekonstruksi
migrasi suatu populasi. DNA mitokondria memiliki fungsi yang sangat penting dalam
6
aktifitas mitokondria. DNA mitokondria pada umumny berbentuk silkular (Chinnery,
2003).
dan tiap mitokondria mengandung 5-10 kopi mtDNA (Goto, 2001). Tiap sel
2. Dalam satu sel, semua molekul mtDNA dapat bersifat idendtik (homoplasmi),
atau terdiri dari dua tipe molekul mtDNA yang memiliki urutan yang berbeda,
yang keduanya berada dalam sel, jaringan atau bahkan di organelyang sama
3. MtDNA ditunkan seluruhnya melalui garis ibu, mtDNA ayah tidak berperan
7
1993; Celeste et al., 2003), hal ini dikarenakan mtDNA tidak memiliki system
5. mtDNA tidak dilindungi oleh histon (Croteau & Bohr, 1997). Hal tersebut
3. Protein pembentang dan 20 protein enzim lainnya atau sistem replikasi DNA atau
polimerasi,
Isolasi DNA merupakan teknik dasar yang harus dikuasai dalam teknologi
DNA rekombinan. Tujuan isolasi adalah mendapatkan DNA tanpa debris sel.
8
Organisme tingkat rendah, seperti bakteri dan lain-lain (sel prokariot), dan makhluk
tingkat tinggi seperti manusia, hewan, tumbuhan, dan lain-lain (sel eukariot)
Prinsip teknik isolasi DNA mencakup berbagai tahap reaksi dengan tujuan
yang berbeda-beda setiap tahapnya. Tahap pertama adalah penghancuran dinding sel.
Tahap ini dapat dilakukan secara mekanis dan secara enzimatis. Cara mekanis yang
sering dilakukan adalah teknik sonikasi, high pressure distruption dan mencairkan
dalam keadaan dingin. Sedangkan cara enzimatis yang umum dilakukan adalah
penggunaan lisozim. Saat ini kedua teknik ini sering digabungkan dengan beberapa
modifikasi perlakuan.
Tahap kedua adalah lisis sel. Proses ini dapat dilakukan dalam berbagai cara,
tergantung pada jenis selnya. Sel-sel lunak dapat disuspensi dengan mudah
menggunakan buffer non-osmotik. Sedangkan sel-sel yang kuat dapat dilisis dengan
penambahan detergen yang keras seperti Triton X-100 atau sodium dodesil sulfat
(SDS). Pada sel eukariot proses ini sering digabung dengan tujuan dapat merusak
proteinase K.
9
3. Detergen, berfungsi sebagai surfaktan untuk mersak fosfolipid dan mendenaturasi
protein.
Gambar 2.1 Teknik Lisis Sel serta Isolasi DNA dan Gen
Tahap ketiga adalah membersihkan debris sel. Proses ini sering dilakukan
dengan cara sentrifugasi. Campuran molekul, seperti protein, DNA, dan lain-lain,
atau pelarut organik, seperti kloroform, dan lain-lain atau proteinnya dihancurkan
supernatan cairan hasil tahap ini dan dapat dipresipitasi dengan penambahan alkohol.
Selain teknik isolasi DNA, diperlukan juga teknik isolasi gen. Teknik ini
dipotong dengan berbagai enzim restriksi. Hasil reaksi ini adalah berbagai fragmen
10
penyambungan fragmen DNA dan DNA vektor. Hasilnya adalah berbagai molekul
DNA rekombinan dalam bentuk siklik. Kumpulan DNA rekombinan ini merupakan
pustaka gen yang akan dimanfaatkan untuk mengisolasi gen yang diinginkan (Toha,
2001).
proses denaturasi, untai ganda DNA akan terputus menjadi untai tunggal DNA karena
terdenaturasi. Bila suhu yang diperlukan untuk denaturasi kurang dari suhu
sebagian, namun jika melebihi suhu optimumnya, aktivitas enzim polimerase akan
primer kepada DNA templat. Suhu pada proses ini adalah sekitar 45-55 oC selama 1
menit. Suhu ini diperoleh setelah menghitung Tm primer, yaitu sekitar 3-5 oC
dibawah Tm. Bila suhu annealing berada terlalu jauh baik di atas dan di bawah Tm,
primer tidak akan menempel di templat dengan sempurna. Sehingga tahap ini dapat
Tahap ketiga atau tahap terakhir dari suatu siklus PCR adalah tahap
yang digunakan pada tahap ini adalah 74 oC selama 1 menit, suhu tersebut merupakan
suhu optimum bagi enzim polimerase untuk bekerja secara optimum (Toha, 2001).
11
Hasil akhir proses PCR disebut amplikon. Cara yang paling sederhana
menentukan bakteri dan protozoa pathogen pada manusia (HIV, Virus Leukimia,
Hepatitis B, Virus C dan Virus demam), untuk diagnosa penyakit tertentu (kanker),
juga untuk mendeteksi mikroba pathogen dalam makanan, dan lain-lain (Toha, 2001).
tetapi berpengaruh dalam perkembangan teknik biologi molecular. PCR pertama kali
ditemukan olah K.B. Mullis pada tahun 1984, peraih nobel kimia tahun 1994, sepuluh
sehingga dengan hanya satu DNA dapat diperbanyak dua kali lipat dalam satu siklus
suhu. Dengan menggunakan teknik PCR banyak metode dalam biologi molekul dapat
dapat dimodifikasi menjadi prosedur yang potensial untuk menaikan hasil, spesifisitas
ataupun sensitivitas. Menurut definisi PCR adalah memoerbanyak DNA secara in-
vitro dengan memanfaatkan cara reflikasi DNA dengan bantuan enzim DNA
polymerase dan perubahan sifat fisik DNA terhadap suhu (Lisdiyanti, 1997).
12
Secara prinsip, PCR merupakan proses yang diulang0ulangantara 20-30 kali.
Setiap siklus terdiri dari tiga tahap. Berikut adalah tiga thp bekerjanya PCR dalam
siklus:
Pada tahap ini (berlangsung pada suhu tinggi 94-960C) ikatan hydrogen DNA
tahap awal PCR tahap ini dilakukan agak lama (sampai menit) untuk
tidak stabil dan siap menjadi templat (patokan) bagi rimer. Durasi tahap ini 1-
2 menit.
basanya. Ini dilakukan pada suhu antara 45-600C. Penempelan ini bersifat
atau primer menempel di sembarang tempat. Durasi tahap ini 1-2 menit.
Suhu untuk proses ini tergantung dari jenis DNA polymerase yang dipakai.
Dengan Taq-Polimerase, proses ini biasanya dilakukan pada suhu 760C. durasi
13
Melting temperature (Tm) primer dapat dikalkulasikan dari primer yang
mendesain sepasang primer haruslah memiliki Tm yang sama. Persamaan yang sering
Walaupun demikian persamaan ini tidak tepat untuk primer yang lebih panjang dari
2.5 Elektroforesis
Elektroforesis gel adalah salah satu teknik utam dalam biologi molecular.
Prinsip dasar teknik ini adalah bahwa DNA, RNA atau protein dapat dipisahkan oleh
medan listrik. Dalam hal ini, molekul-molekul tersebut dipisahkan berdasarkan laju
perpindahannya oleh gaya gerak listrik di dalam matriks gel. Laju perpindahan
dilakukan untuk tujuan analisis, namun dapat pula digunakan sebagai teknik
14
Elektroforesis pada prinsipnya merupakan proses bergeraknya molekul
bermuatan melalui pori-pori gel di bawah pengaruh medan listrik dengan kekuatan
tertentu. Pada pH mendekati netral DNA bermuatan negatif, sehingga molekul ini
dapat bermigrasi dari katoda ke anoda dengan mobilitas yang dipengaruhi oleh
ukuran dan konformasi fragmen DNA, kekuatan arus listrik, konsentrasi etidium
bromida (EtBr), kekuatan ion buffer, dan konsentrasi gel yang digunakan.
Molekul DNA yang berukuran kecil dapat dengan mudah melalui pori-pori
gel sehingga pergerakannnya relatif cepat. Sebaliknya molekul DNA yang berukuran
besar karena sulit melewati pori-pori gel, maka akan bermigrasi lebih lambat. DNA
yang mempunyai ukuran sama, tetapi mempunyai konformasi berbeda akan bergerak
dengan kecepatan berbeda. DNA dengan konformasi siklik akan lebih mudah
melewati pori-pori gel dibandingkan dengan DNA konformasi linier. Bila voltage
rendah, maka kecepatan pergerakan fragmen DNA yang linier sebanding dengan
ketinggian voltagenya. Pada voltage yang tinggi, kecepatan pergerakan fragmen DNA
EtBr dalam gel dapat menurunkan sekitar 15% kecepatan pergerakan DNA
yang linier atau DNA dengan konformasi lingkaran terbuka. Proses elektroforesis
yang menggunakan bufer dengan kekuatan ion yang rendah akan menyebabkan
pergerakn DNA relatif lambat. Dan sebaliknya bergerka lebih cepat pada bufer
dengan kekuatan ion yang lebih tinggi. Namun bila kekuatan ion terlalu tinggi, maka
kan terbentuk panas, sehingga gel dapat meleleh dan DNA dapat terdenaturasi.
15
Kemampuan pemisahan DNA pada elektroforesis juga ditentukan oleh
perbedaan konsentrasi gel, dan kemampuan ukuran DNA yang dapat dipisahkan
(Toha, 2001).
(UV) dengan bantuan EtBr yang dapat berfluororesensi bila disinari UV. EtBr
molekul EtBr sebanding dengan ukuran rantai DNA yang diamati. Dengan demikian
ukuran DNA yang dianalisis dapat diketahui. Pemberian EtBr diberikan sebelum atau
16
Analisis hasil teknik PCR, restriksi, ligasi, dan teknik pembentukan DNA
17
BAB III
3.1.1 Alat
Gunting, inkubator, sentrifugator, vortex, dan tabung mikro 1,5 ml, mesin
TM
PCR, mikropipet 100, 10, 25 µl, dan mikrosentrifuga suhu kamar mini sub
dna electrophoresis cell (biord), pemanas, cetakan gel, alat sinar UV, dan
kamera.
3.1.2 Bahan
PCR, dNTP, primer reverse (M1), primer forward (M2), DNA taq polimerase,
bromida, primer 982 pb, marker 1000 pb, loading buffer (Merck: sukrosa
Sampel diambil dari sel folikel rambut sebanyak 5 helai, kemudian dipotong-
potong kecil pada bagian akarnya dengan gunting yang telah dicuci
18
menggunakan etanol 70%. Kemudian potongan rambut dimasukan dalam
tabung mikro 1,5 ml dan ditambah 30µL buffer lisis, 6 µL protease K dan 264
µL akuabides. Setelah itu di inkubasi pada suhu 56oC selama 1 jam (setiap 15
selama 4 menit pada suhu 4˚C. Setelah itu supernatan yang diperoleh di
pindahkan dalam tabung mikro yang baru dan disimpan pada suhu -20˚C.
dengan teknik PCR, sebelumnya alat yang digunakan disetrilkan dengan cara
2,5 µL MgCl2, 2,5 µL buffer PCR Taq DNA Polymerase, 2,5 µL dNTP,
primer M1 dan M2 sebanyak 0,5 µL, 5 µL template, dan 0,2 µL Taq DNA
selama 10 detik. Kemudian dimasukan dalam PCR selam 2 jam dalam mesin
PCR Automatic Thermal Cycler 30 siklus. Tahap awal PCR adalah denaturasi
awal yang akan dilakukan pada suhu 94oC selama 1 menit, kemudian masuk
ke program siklus PCR dengan masing-masing siklus terdiri tiga tahap yaitu
pada suhu 55oC selama 1 menit, dan perpanjangan primer (extension) pada
19
suhu 72oC selama 1 menit. Akhir dari semua siklus dilakukan tambahan
adalah pembuatan gel agarosa dengan cara melarutkan agarosa 0,4 g dalam
bufer TAE 1 x 40 ml pada penangas air. Setelah itu didinginkan dan ditambah
0.2 µL etidium bromida (EtBr), kemudian dimasukan dalam cetakan gel yang
20
d
b
u
k
L
µ
,3
1
(
tx
lC
iRg
A
N
D
q
r
e
m
ly
o
)
i2
s
a
T
M
H
P
f
p
0
5
n
m
r
a
k
u
e
5
n
S
s
t
h
N
D
b
p
+
g
A
Gambar 3.1
Gambar 3.2
Bagan Alir Isolasi DNA Mitokondria Sel Folikel Rambut
21
,4
rlg
se
n
o
ita
A
N
0
G
H
K
D
k
p
fm
Gambar 3.3 Bagan Alir Karakterisasi DNA Mitokondria Sel Folikel
Rambut
22
BAB IV
PEMBAHASAN
DNA mitokondria dari sel folikel rambut secara in vitro dengan teknik PCR.
fragmen DNA dalam jumlah banyak dari sumber DNA yang jumlahnya sangat kecil,
Sumber DNA yang digunakan dalam percobaan ini adalah sel folikel rambut.
Sel ini berkembang karena adanya suatu sumber energi. Energi tersebut dihasilkan
oleh mitokondria. Oleh karena itu dapat disimpulkan bahwa di dalam sel folikel
Pada percobaan ini fragmen DNA mitokondria yang digunakan adalah daerah
D-loop. Dipilihnya daerah D-loop ini karena D-loop merupakan daerah hipervariabel,
yang mana pada setiap etnis berbeda (polimorfisme), sehingga DNA pada daerah ini
bisa digunakan untuk keperluan identifikasi dan forensik. Selain itu pada D-loop
terdapat daerah yang merupakan titik awal proses replikasi dan daerah promotor
transkripsi. Karena laju mutasi pada DNA mitokondria tinggi, yaitu sepuluh kali dari
DNA inti, maka tingkat polimorfisme tinggi sehingga dapat digunakan untuk
identifikasi. Meskipun tingkat atau laju mutasi DNA mitokondria tinggi, namun tidak
akan mengganggu kerja tubuh yang ada, karena pada DNA mitokondria terdapat D-
23
loop yang tidak memiliki histon, yaitu suatu protein yang mengkode sekitar
seperempat asam amino terutama arginin dan lisin yang berfungsi mengepak dan
menyusun DNA menjadi unit-unit struktural, sehingga tidak ada protein berbeda
yang diekspresikan yang dapat merusak kerja tubuh. Dapat terjadinya mutasi ini
secara umum terjadi pada DNA mitokondria yang terdapat di dalam matriks melalui
auatu reaksi oksidatif yang juga terjadi di matriks. Reaksi ini menghasilkan
loop tidak memiliki histon yang merupakan pelindung DNA sehingga akan mudah
Prosedur pertama dalam percobaan ini yaitu membuat template mtDNA yang
digunakan pada untuk reaksi PCR. Melisis sel folikel rambut yaitu dengan cara
memotong kecil-kecil bagian akar rambut yang memiliki ujung putih, sekitar satu
buffer lisis, Proteinase K, dan akuabides dengan volume total untuk masing-
masingnya sebesar 300 μL, baru setelah itu disentrifugasi. Buffer lisis mengandung
dilakukan untuk memecah membran sel dan membran organel (inti dan mitokondria)
sehingga DNA akan dapat diisolasi. Perusakan membran sel dan organel sel yaitu
dari protein penyusun membran sehingga lapisan membran rusak. Tween-20 bersifat
seperti detergen (pengemulsi) yang dapat menyebabkan integritas dari fosfolipid dan
24
protein hidrofob sehingga DNA dapat keluar. Setelah DNA keluar (baik DNA inti
memfragmentasinya, dan hal ini tidak diharapkan. Oleh karena itu ditambahkan
EDTA pH 8,0 yang dapat membentuk khelat dengan Mg2+ atau logam lain yang
berfungsi sebagai kofaktor enzim nuklease, sehingga enzim nuklease menjadi tidak
aktif dan DNA tidak akan terfragmentasi. Penambahan EDTA ini tidak boleh
berlebihan atau kekurangan, artinya pengkhelatan tidak boleh terlalu kuat dan tidak
boleh terlalu lemah karena akan mengganggu proses PCR yang juga memerlukan
penambahan buffer lisis, ditambahkan akuabides dan kemudian diinkubasi pada suhu
56°C selama 1 jam. Inkubasi pada suhu ini dimaksudkan untuk mengaktifkan kerja
enzim Proteinase K karena pada suhu tersebut memiliki aktivitas optimum. Setiap 15
menit inkubasi dihentikan, kemudian tabung divortex agar reagen-reagen yang tadi
ditambahkan tercampur sempurna. Setelah 1 jam, kemudian diinkubasi lagi pada suhu
95°C selama 5 menit. Penginkubasian pada suhu ini berguna untuk mendenaturasi
karena bila tidak, enzim proteinase K akan memotong enzim Taq polimerase yang
molekul dari DNA mitokondria dan DNA inti maka dengan sentrifugasi keduanya
25
perbedaan kecepatan sedimentasi dari partikel-partikel molekul yang disebabkan oleh
medan sentrifugal. Kecepatan sedimentasi ini dipengaruhi oleh bentuk molekul, berat
molekul atau radius molekul. Setelah itu supernatant disimpan dalam freezer -20°C
untuk mencegah kerusakan atau denaturasi protein dalam sebuah tabung mikro.
dengan PCR. Terlebih dahulu dibuat master mix yang merupakan campuran dari
buffer PCR 10x (tris-HCl 100 mM pH 9, KCl 500 mM, dan MgCl 2 15 mM) dengan
primer M1 dan M2, dNTP, akuabides, dan terakhir adalah DNA Taq polimerase.
Perlu diperhatikan pada saat belum digunakan semua reagen harus disimpan pada
suhu serbuk es (sekitar -20°C) yaitu untuk menjaga keakuratan volume. Pada saat
pemipetan, tip pipet harus menempel pada dinding tabung agar reagen yang
dikeluarkan tip pipet volumenya sesuai karena penambahan reagen harus dilakukan
secara kuantitatif.
Buffer PCR berfungsi untuk mendapat pH optimum untuk enzim Taq DNA
2. Meningkatkan kelarutan dNTP sehingga reaksi kimia dalam PCR akan lebih
mudah.
akan menyebabkan produk PCR yang rendah, tapi Mg dengan konsentrasi yang
26
Primer M1 dan M2 yang digunakan merupakan komplemen dari template
menentukan suhu annealing yang akan digunakan dalam reaksi PCR. Basa dNTP
yang mengandung dATP, dGTP, dCTP, dan dTTP, merupakan sumber basa yang
akan menempel di template. Sedangkan enzim Taq DNA polimerase selain berfungsi
memperbanyak dan memperpanjang primer, juga akan membaca basa yang terdapat
pada template dan akan mendatangkan pasangan basa yang sesuai. Penggunaan
konsentrasi Taq DNA polimerase yang tinggi berakibat produk yang dihasilkan tidak
akan spesifik.
Setelah master mix dibuat dengan final volume 25 μL, kemudian ditambahkan
10 μL template mtDNA yang telah dibuat. Kemudian tabung divortex agar semua
dalam es sambil menunggu set-up mesin PCR. Setelah siap, tabung dimasukkan ke
dalam mesin PCR dan prosesnya dimulai. Reaksi yang terjadi di dalam mesin PCR :
27
2. Annealing pada suhu 50°C, 1 menit
Tahap pertama reaksi PCR adalah denaturasi pada suhu 94°C selama 1 menit.
Pada tahap ini rantai ganda DNA akan terbuka membentuk rantai DNA tunggal.
terdenaturasi, sedangkan bila suhu di atas 94°C, maka enzim Taq polimerase akan
suatu bakteri termofilik yang stabil pada suhu tinggi yaitu Thermos aquaticus,
sehingga pada suhu 94°C tidak terdenaturasi padahal suhu optimumnya adalah 72°C.
Tahap kedua adalah annealing pada suhu 50°C selama 1 menit. Annealing
Tm = 4 (G + C) + 2 (A + T)
Tm atau temperature melting merupakan suhu yang menunjukkan pada saat DNA
terdenaturasi 50%. Suhu annealing pada proses PCR kali ini adalah 55°C. karena
primer M1 dan M2 yang digunakan terdiri atas nukleotida yang apabila kita hitung
dapat diperoleh 55°C suhu annealing. Tapi penentuan suhu annealing biasanya ± 5°C
di bawah Tm. Tapi pada suhu 55°C ini merupakan suhu optimum terjadinya
penempelan primer pada template. Suhu annealing tidak boleh lebih dari 60°C karena
dikhawatirkan primer tidak akan menempel pada template, dan tidak boleh lebih
rendah juga dari 60°C karena primer akan menempel di tempat yang tidak spesifik
28
Tahap terakhir adalah extension yaitu tahap pemanjangan primer akibat
adanya enzim Taq DNA polimerase. Extension ini terjadi pada suhu 72°C dimana
merupakan suhu optimum enzim Taq polimerase. Setelah annealing, primer ini
DNA didenaturasi dengan pemanasan sampel beberapa saat yang menghasilkan kira-
kira dua kali template untai tunggal untuk primer annealing pada siklus selanjutnya.
sejunlah kecil fragmen DNA dengan ukuran 0,3 – 1,0 kb. Sedangkan fragmen DNA
yang digunakan adalah 0,4 kb. Gel agarosa ini dibuat dengan melarutkan sebanyak
0,4 gram agarosa dalam 40 mL buffer TAE ( tris asetat 0,04 M, EDTA 0,001 M pH
didinginkan hingga 50-60°C dan ditambahkan ethidium bromida. Dalam hal ini
buffer TAE sebagai media penghantar arus, dimana fragmen mtDNA akan bergerak
melihat pita DNA maka harus menodai gel dengan ethidium bromida yang
29
Agarosa merupakan suatu koloidal laut yang dimurnikan dari alga. Ketika
dididihkan dalam suatu larutan buffer, agarosa akan larut dan ketika didinginkan akan
terlalu panas akan merusak karet-karet penyimpan agar. Selain itu, viskositasnya
tersisipkan diantara basa asam nukleat dan memberikan deteksi dalam gel. Ethidium
bromida ini terdapat dalam bentuk bubuk atau larutan yang larut dalam air. Kristal
30
Dapat tersisipnya ethidium bromida diantara basa asam nukleat, karena
ethidium bromida sedikit mirip pasangan basa dan dapat masuk ke dalam rantai
ganda DNA di antara pasangan basanya. Hal tersebut sangat mutagen. Ethidium
tereksitasi ke tingkat energi yang lebih tinggi (dengan UV 365 nm). Ketika elektron
kembali pada tingkat energi yang lebih rendah, menimbulkan perbedaan energi (sinar
tampak). Fluorosensi ethidium bromida bebas dalam larutan rendah, karena elektron
dapat mengalir diantara dua level energi, dalam tingkatan energi vibrasi. Ketika
ethidium bromida terikat pada DNA yang lebih kaku maka jalur pengeluaran energi
rendah. Jalur fluorosensi ini yang umum terjadi dimana Ethidium bromida tidak
tersisipkan lebih panjang di antara pasangan basa yang bersesuaian dengan stem
akseptor tRNA valin. Karena itu tersisipnya akan berada di antara pasangan basa pada
struktur stem-loop panjang bagian bawah. Dengan demikian ethidium bromida lebih
31
Gambar 4.2 Penyisipan Ethidium Bromida pada Pasangan Basa
cetakan yang memiliki sisir untuk membentuk sumur gel. Setelah cetakan jadi, pada
telah dicampur dengan 2 μl loading buffer. Loading buffer terdiri atas sukrosa 50%,
EDTA pH 8,0 dan brom fenol biru yang digunakan sebagai pewarna guna
mana proses elektroforesis telah berlangsung, dengan adanya warna biru yang
bergerak dalam agar. Selain itu, penambahan sukrosa ini sebagai pemberat bagi
digunakan tidak boleh dinaikkan karena fragmen besar akan berpindah sebanding
pemisahan zat berdasarkan pengaruh medan listrik. Karena adanya aliran listrik yang
mengalir pada gel, maka fragmen DNA bergerak ke kutub positif (ditandai dengan
noda biru bergerak ke kutub positif). Hal ini karena molekul DNA relatif lebih kecil
sehingga bergerak lebih dulu daripada molekul lain yang besar, selain itu DNA ini
atau tidak atau ingin mengetahui DNA mitokondria yang diisolasi itu benar dengan
yang diinginkan, maka divisualisasi di bawah lampu UV. Agarosa dikeluarkan dari
32
buffer. Setelah dikenakan sinar UV terlihat pita berwarna merah-orange, kemudian
difoto dan terlihat hasil seperti gambaran pita di bawah ini. Hal ini menunjukkan hasil
Keterangan :
Lajur 2 -9 : hasil karaktrisasi kelompok 1-8 dgn primer M1-HV2R (982 pb)
empat titik sehingga terdapat lima fragmen (masing-masing berukuran 1.419 pb, 517
pb, 396 pb, 214 pb, dan 75 pb). Karena M1 dan M2 yang digunakan adalah MH dan
33
BAB V
KESIMPULAN
5.1 D-loop DNA mitokondria dari sel folikel rambut dapat diisolasi dengan cara
lisis.
5.2 D-loop DNA mitokondria dapat diamplifikasi secara in vitro dengan teknik
PCR.
5.3 Fragmen D-loop DNA mitokondria hasil PCR dapat dianalisis dengan metode
elektroforesis.
34
DAFTAR PUSTAKA
Celeste, A., Difilippantonio, S., Difilippantonio, M. J., Capentillo, O. F., Pilch, D. R.,
Sedelnikova, O. A., Eckhaus, M., Ried, T., Bonr, W. M., & Nussenweig,
A. 2003. CellI. 144(3),371-383.
Chinnery, P.F. & D.M. Turnbull. 2000. Mitochondrial DNA Mutations in The
Pathogenesis of Human Disease. Mol. Med. Today. 6,425-432.
Croteau, D.L. & Bohr, V.A. 1997. Repair of Oxidative Damage to Nuclear and
Mitochondrial DNA in Mammalian Cells. The Journal of Biochemical
Chemistry. 272, 25409-25412.
Milligan, J.R., Aguilera, J.A., & Ward, J.F.1993. Variation of Single – Strand Break
Yield with Scafenger Concentration for Plasmid DNA Iradiated in
Aqueous Solution. JSTOR. Radiation Research. 133 (2), 151-157.
35
Reynier, P., Chretien, M.F., Safagner, F., Larcher, G.,Rohmer, V., Barriere, P., &
Malthiery, Y. 1998. Long PCR Analysis of Human Gamete mtDNA
Suggests Deffective Mitochondrial Maintenance in Spermatozoa and
Supports The Bottleneck Theory for Oocytes. Biochem Biophys Res
Common. 252, 373-377.
Schaefer, A.M., Taylor, R.W., & Turnbull,D.M. 2001. The Mitochondrial Genome
and Mitochondrial Muscle Disorders. Curr Opin Pharmacol. 1, 288-293.
Stryer, L., Berg, J.M., & Tymoczko, J.L.2002. Biochemistry. WH Freeman and
Company. New York.
36
LAMPIRAN
Gambar Alat
Mikro Pipet
Micro Sentrifuge
37
Inkubator
Alat Elektroforeis
Mesin PCR
38