2011
A BO RAT O R I O D E B I O P R OC E S O S
GRUPO B-4
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2011
INTRODUCCION
En la actualidad muchos de los alimentos son obtenidos gracias al manejo y
conocimiento del crecimiento de microorganismos. Resulta entonces importante el
conocimiento de las condiciones en que estos microorganismos puedan optimizar sus
productos. Para ello la preparacin de medios de cultivo para estos microorganismos es
un buen punto de partida para conocer sobre su comportamiento as como tambin el
seguimiento de la cintica nos proporciona datos mucho ms prcticos y exactos sobre la
velocidad y caractersticas del crecimiento del microorganismo tratado.
La preparacin de medios para el desarrollo de procesos de fermentacin es una
etapa fundamental para asegurar la productividad de los mismos. Los componentes de
los medios constituyen los efectores externos de naturaleza qumica que desempean un
rol esencial en los procesos ya que deben cumplir con los requerimientos del crecimiento
y de formacin de productos y adems suministrar energa para la sntesis de metabolitos
y para el mantenimiento celular. No obstante que los microorganismos varan
considerablemente respecto de los nutrientes que pueden necesitar.
Es as que para esta prctica hemos centrado nuestra atencin en el tratamiento de
un microorganismo (Saccharomyces cerevisiae ATCC-4126), iniciando desde
su siembra partiendo desde su estado en cepa congelada , para luego sembrarlo en medio
rico, empleando la glucosa como fuente de carbono, procurando su rpida activacin,
para que luego de un determinado tiempo podamos sembrar la bacteria pero en un medio
mnimo; es decir con los mnimos requerimientos; en el cual es ms factible determinar
la cintica de crecimiento.
Dentro de su importancia en la agroindustria la Saccharomyces cerevisiae
ATCC-4126 es muy valiosa para la conversin de fructosa en etanol que puede mejorar
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Objetivos Especficos:
Disear el medio de cultivo.
Realizar la activacin y desarrollo del inoculo.
Identificar y describir las partes, a accesorios y geometras, conocimiento de la
operacin del fermentador, esterilizacin, carga y descarga y toma de muestra.
Identificar en el fermentador los instrumentos de medicin y control automtico,
as como la calibracin de los sensores
Puesta en marcha del cultivo por lote alimentado y determinar max y Y x/s.
Obtener los perfiles de masa celular, fuente de carbono y oxgeno disuelto a travs
del tiempo de operacin.
Observar las zonas de crecimiento exponencial y limitada.
Determinar el Y x/s y Qx del CLA.
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Microorganismo.
La levadura usada es SaccharomycesCerevisiae ATCC 4126, siendo el sustrato
sacarosa
Condiciones del medio:
Sustrato limitante: SACAROSA( C12H22O11)
Duracin: 6 horas de la etapa de CLA
Usar el fermentador automticoBiotron Modelo Liflus G X de 2 litros
Control de pH medianteelectrodo
Medicin de oxigeno disuelto mediante electrodo : 1,0 vim ; 200 rpm
La existencia de las zonas de crecimiento exponencial y limitado.
Utiliza macro nutrientes como: C.N.Mg,K,P
Utiliza micro nutrientes como: Ca,Na,Fe,Cu,Mn,Mo,Co,Zn
2.1.
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Extracto de Levadura
Extracto de malta
A B O R A T O R I O D E B I O P R O C EPeptona
SOS
Agar
Glucosa
So (g/l)
So (g/50ml)
3
0.15
3
0.15
G5 R U P O B - 4 0.25
20
1
10
0.5
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CONCENTRACIN (G/L)
PESAR (G)
Sacarosa
15
0.225
Extracto de
0.045
Levadura
Extracto de Malta
0.075
Solucin de Sales
5 ml/L
0.075ml
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Nutriente
Sacarosa
(C12H22O11)
Sulfato de
Amonio
(NH4)2SO4
Fosfato Potasico
(KH2PO4)
K
Mg
P
-
% en
Celula
45
% en
nutriente
42,105
Y x/s (g/g)
S`0 (g/l)
S0 (g/l)
0,4678
3,8478
3,8478
pesar
(gr)
0.3847
21,21
2,3567
0,7638
1,1457
0.1146
0,5
28,676
57,352
0,0314
0,0471
0.0047
Sulfato de
Magnesio
Heptahidratado
(MgSO4.7H2O)
Fosfato Potasico
(KH2PO4)
0,4
9,86
24,65
0,0730
0,1095
0.0195
22,79
11,395
0,1580
0,2369
0.0236
9
Extracto de
Levadura
1,8
0.18
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Solucion de sales
10 ml/L
Condiciones de Cultivo :
pH inicial :
4,2
SHAKER
Temperatura:
35C
Velocidad de agitacin : 200 rpm
Nutriente
Sacarosa
(C12H22O11)
Sulfato de
Amonio
(NH4)2SO4
Fosfato Potasico
(KH2PO4)
K
Mg
P
-
% en
Celula
45
% en
nutriente
42,105
Y x/s (g/g)
S`0 (g/l)
S0 (g/l)
0,4678
3,8478
3,8478
21,21
2,3567
0,7638
1,1457
0,5
28,676
57,352
0,0314
0,0471
Sulfato de
Magnesio
Heptahidratado
(MgSO4.7H2O)
Fosfato Potasico
(KH2PO4)
0,4
9,86
24,65
0,0730
0,1095
22,79
11,395
0,1580
0,2369
Extracto de
Levadura
1,8
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Solucion de sales
10 ml/L
Condiciones de Cultivo :
pH inicial :
4,2
SHAKER
Temperatura:
35C
Velocidad de agitacin : 200 rpm
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Nutriente
YX/S
So
(gr/l)
Extracto de
levadura
(NH4)2SO4
2.36
KH2PO4
11.38
KH2PO4
57.47
MgSO47H2O
Pesos (g)
1.800
Mg
So
(gr/l)
24.66
1.45
4
0.30
1
0.06
0
0.13
9
2.181
3.489
0.451
0.722
0.089
0.143
0.208
10.00
0
Extracto de sales
2.880
0.333
16.000
Condiciones de Cultivo :
pH inicial :
4,2
SHAKER
Temperatura:
35C
Velocidad de agitacin : 200 rpm
Para sta
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PREPARACION DE SALES
en la balanza analtica.
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AEREACION
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Se pueden tener sistemas donde los microorganismos crecen con mltiples sustratos,
pero en el caso que todos son limitantes. Ej, C, N, O2 , luego la cantidad de cada uno
de ellos afecta la cintica de crecimiento.
Transferencia de Oxgeno
El comportamiento de las fermentaciones est fuertemente influenciado por una serie de
operaciones de transferencia.
Es posible que una determinada fermentacin, en especial las aerbicas, est limitada en
sus posibilidades de mejorar su rendimiento y productividad, no por razones propias de las
caractersticas de las clulas sino que por problemas en el diseo que permita satisfacer la
alta demanda de transferencia de masa, y en especial de oxgeno.
Necesidades de Diseo
Se diseo de un sistema de aireacin-agitacin debera satisfacer que:
DEMANDA DE OXIGENO = OFERTA DE OXIGENO
Por otra parte, el crecimiento microbiano se puede representar por:
1CaHbOC + m NH3 + n O2 q CdHeOfNg + r CO2 + t H2O + u ChHiOjNk
CdHeOfNg: Biomasa
ChHiOjNk: Metabolito extracelular
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Mtodos de determinacin kL a
Para la adecuada operacin de un fermentador se hace necesario conocer el valor del
coeficiente volumtrico de transferencia de O2
kL = f (Sc, Sn, GR)
kL a a = f (D32, H)
Titulacin
Oxidacin de sulfito de sodio
Eliminacin del O2
Mtodo Dinmico.
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o Balances de masa
o Medicin Directa con analizador de O2
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o Mtodo dinmico
En este caso la medicin se realiza en el fermentador durante el
crecimiento de un cultivo activo, registrndose el oxgeno disuelto. El
proceso tiene 2 etapas.
Etapa 1: Durante la fermentacin se corta el suministro de aire (T1)
y se registra la disminucin de O2 disuelto. En este caso el suministro
es nulo.
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AGITACIN
La agitacin es la operacin que crea o que acelera el contacto entre dos o varias
fases. Una fermentacin microbiana puede ser considerada como un sistema de tres
fases, que implica reacciones lquido-slido, gas-slido y gas-lquido.
La fase lquida contiene sales disueltas, sustratos y metabolitos. Puede existir,
en algunos casos, una segunda fase lquida si existe un sustrato inmiscible en
agua como por ejemplo los alcanos.
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un mezclado homogneo
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ESTERILIZACION
Esterilizacin significa la eliminacin de toda forma de vida de un medio o
material, lo que se lleva a cabo generalmente por medios fsicos, por ejemplo,
filtracin, o por muerte de los organismos por calor, productos qumicos u otra va.
La razn fundamental para efectuar la esterilizacin en Microbiologa Industrial es
para evitar la competicin por los nutrientes en medios de cultivo y permitir as que
el cultivo de microorganismos especficos que se utilizan en un proceso de
fermentacin de los rendimientos esperados en biomasa y/o metabolitos especficos.
Mtodos de esterilizacin
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Donde:
A = constante
E = energa de activacin
R = Constante general de los gases
T = Temperatura en grados Kelvin
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Y por tanto
2.7.
El biorreactor ser puesto en marcha con un volumen inicial igual a 0.75Lt para
llegar a un volumen final de 1.65Lt y utilizando la siguiente formula:
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V=V0+Ft
Se trabajara con 1,5 vvm y 150 rpm como ser un cultivo por lote alimentado
aireado no habr flujo de salida.
F(t)
SR(t)
Vf, Xf
VR = Vf - V0
V0, X0, S0
RESERVORIO
BOMBA
BIORREACTOR
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Determinacin de PH (4.2)
Sensor de PH
Sensor de T
Sensor Oxgeno Disuelto.
Antiespumante
Condensador
Motor de rotor
Posee cuatro bombas peristaticos: acido- base- alimentacin-
espumante
2 Sensores de aire (1%)
Un vaso con capacidad de 6lt
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2011
1.
2.
3.
4.
5.
6.
2.8.
Sensor de espuma
Condensador
Motor
Sensor de O.D
Sensor de PH
Sensor de T
Fuente de Fe
0.6009 g FeSO4.7H2O
Fuente de Cu
0,25 g CuSO4.5H2O
Fuente de Co
0,24 g CoCl2.6H2O
Fuente de Zn
0,4015 g ZnSO4.7H 2O
Fuente de Mg
2,20 g MgSO4.7H2O
Fuente de B
0.06 g H3BO3
Fuente de Cl
HClconc.
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PH mayor de la solucin.
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2011
Materiales y equipos
Balanza analtica
Olla a presin
Mechero Bunsen
Pipetas de 10 ml.
Aza bacteriolgica
Tubos de ensayo con tapas (8 tubos)
Varilla de vidrio
Matraz Erlenmeyer (250ml)
Guantes.
Esptula
Probeta graduada
Capachos de papelmetalico
Reactivos
Muestra: Saccharomycescerevisiae ATCC 4126
Sustrato: sacarosa
Agua destilada.
Extracto de levadura.
Peptona.
Agar.
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Reactivos
Componentes segn Tabla N 2
Alcohol
HClcc.
Materiales y equipos
Matraz de 1 L
Matraces de 125 ml
Varilla de vidrio
Capachos de papel metlico.
Balanza analtica
Reactivos
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2011
y 5 de anexos
Agua destilada
Alcohol
IV. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES:
ACTIVIDADES
Recepcin de gua de practicas
Explicacin del procedimiento
de
FECHA
02/11/10
02/11/10
prctica.
Presentacin
de
07/11/10
practicas
Esterilizacin de materiales preparacin
09/11/10
del
preinforme
calibrado
Toma de muestras para determinacin
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16/11/10
22/11/10
22/11/10
23/11/10
23 24/11/10
25/11/10
30/11/10
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V. BIBLIOGRAFIA
http://www.microbiologia.com.ar/bacteriologia/fisiologia.php?
Mostrar=quimicos
http://www.laboratoriosmicrokit.com/docs/..%5Cmanual%5CKits-C.pdf.
http://www.monografias.com/trabajos15/lactobacilos/lactobacilos.shtml
www.sciencedirect.com
MEDIOS DE FERMENTACION.PDF
Microbiologa General Tema 2.- Cultivo de microorganismos.PDF
Diseo de fermentadores o bioreactores.PDF
http://darwin.usal.es/profesores/pfmg/sefin/MI/tema12MI.html
http://www.monografias.com/trabajos63/fermentadores-cultivo
sumergido/fermentadores-cultivo-sumergido2.shtml
http://es.wikipedia.org/wiki/Biorreactor#Dise.C3.B1o_de_un_Biorreactor_de_Tanque
_Agitado
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ANEXOS
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MEDIO
Solido de mantencin
(YM solido)
Activacin
Fermentacin
NUTRIENTE
Extracto de levadura
Peptona
Extracto de malta
Agar
Glucosa
Sacarosa
Extracto de levadura
Extracto de malta
Solucin de sales
Sacarosa
Extracto de levadura
(NH4)2SO4
KH2PO4
MgSO4.7H2O
Solucin de sales
pH 4,2
CONCENTRACIN (GR/L)
3
5
3
20
10
15
3
5
5 ml/L
1.8
10 ml/L
% DE COMPOSICION
45 %
9%
0.4 %
0.5 %
2.0 %
COMPOSICION
DE
NUTRIENTE
(g)
PARA
UN
MEDIO
DE
Extracto de Levadura
Extracto
A BO RAT O R I O D E B I O P R O
C E S Ode
S malta
Peptona
Agar
Glucosa
So (g/l)
So (g/50ml)
3
0.15
3
G R U P O B - 4 0.15
5
0.25
20
1
10
0.5
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2011
CONCENTRACIN (G/L)
PESAR (G)
Sacarosa
15
0.225
Extracto de
0.045
Levadura
Extracto de Malta
0.075
Solucin de Sales
5 ml/L
0.075ml
Nutriente
Sacarosa
(C12H22O11)
A BO RAT O R I O D E B I O P R OC E S O S
% en
Clula
45
% en
Nutriente
42,105
Y x/s (g/g)
S`0 (g/l)
S0 (g/l)
0,4678
3,8478
3,8478
GRUPO B-4
pesar
(gr)
0.3847
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2011
P
-
Sulfato de
Amonio
(NH4)2SO4
Fosfato Potasico
(KH2PO4)
21,21
2,3567
0,7638
1,1457
0.1146
0,5
28,676
57,352
0,0314
0,0471
0.0047
Sulfato de
Magnesio
Heptahidratado
(MgSO4.7H2O)
Fosfato Potasico
(KH2PO4)
0,4
9,86
24,65
0,0730
0,1095
0.0195
22,79
11,395
0,1580
0,2369
0.0236
9
Extracto de
Levadura
Solucion de sales
1,8
0.18
10 ml/L
Condiciones de Cultivo :
pH inicial :
4,2
SHAKER
Temperatura:
35C
Velocidad de agitacin : 200 rpm
Nutriente
Sacarosa
(C12H22O11)
A BO RAT O R I O D E B I O P R OC E S O S
% en
Clula
45
% en
Nutriente
42,105
Y x/s (g/g)
S`0 (g/l)
S0 (g/l)
0,4678
3,8478
3,8478
GRUPO B-4
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2011
P
-
Sulfato de
Amonio
(NH4)2SO4
Fosfato Potasico
(KH2PO4)
21,21
2,3567
0,7638
1,1457
0,5
28,676
57,352
0,0314
0,0471
Sulfato de
Magnesio
Heptahidratado
(MgSO4.7H2O)
Fosfato Potasico
(KH2PO4)
0,4
9,86
24,65
0,0730
0,1095
22,79
11,395
0,1580
0,2369
Extracto de
Levadura
Solucion de sales
1,8
10 ml/L
Condiciones de Cultivo :
pH inicial :
4,2
SHAKER
Temperatura:
35C
Velocidad de agitacin : 200 rpm
A BO RAT O R I O D E B I O P R OC E S O S
Nutriente
YX/S
GRUPO B-4
So
(gr/l)
So
(gr/l)
Pesos (g)
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1.800
(NH4)2SO4
2.36
KH2PO4
11.38
KH2PO4
57.47
Mg
MgSO47H2O
24.66
1.45
4
0.30
1
0.06
0
0.13
9
2.181
0.451
0.089
0.208
10.00
0
Extracto de sales
2.880
3.489
0.722
0.143
0.333
16.000
Condiciones de Cultivo :
pH inicial :
4,2
SHAKER
Temperatura:
35C
Velocidad de agitacin : 200 rpm
= 45 %
1.
CALCULO DE % NUTRIENTE:
A BO RAT O R I O D E B I O P R OC E S O S
GRUPO B-4
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2011
136.1
100%
PM = 342
342
39.1
100%
12x12
132
PM = 136.1
136.1
31
100%
PM = 246.3
KH2PO4
PM = 136.1
x = 21.21
MgSO47H2O
x = 22.777
K:
100%
28
2.
PM = 132
KH2PO4
P:
x = 28.73
(NH4)2SO4:
x = 42.105
246.3
100%
24.3
x = 9.866
CALCULO DE YX/S:
A BO RAT O R I O D E B I O P R OC E S O S
Sacarosa:
GRUPO B-4
Yx/s=(42.105/45)x0.5
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2011
Yx/s= 0.468g/g
KH2PO4:
(NH4)2SO4:
P:
Yx/s=(9.866/0.4)
K:
MgSO47H2O
KH2PO4:
Yx/s=(21.21/9)
Yx/s=(22.777/2)
Yx/s=(28.73/0.5)
3.
CALCULO DE S0
Sacarosa:
KH2PO4
0.468= 1.8/S0
S0= 1.8/0.468
S0 = 3.8462g/l
A BO RAT O R I O D E B I O P R OC E S O S
P:
S0= (1.8/11.3885)x1.5
S0 = 0.2371 g/l
K2HPO4
GRUPO B-4
K:
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2011
S0= (1.8/57.46)x1.5
S0 = 0.046989 g/l
Extracto de levadura :
S0= (1.8/2.3567)x1.5
S0= 1.8
(NH4)2SO4:
S0 = 0.10946 g/l
Solucin de sales
S0 = 1.14567 g/l
S0= 10ml/L
MgSO47H2O
S0= (1.8/24.665)x1.5
COMPONENTES
CaCL2,2H2O
ZnSO4.7H2O
FeSO4.7H2O
CuSO4.5H2O
CoCL2,6H2O
MoO3
MnCL2,6H2O
NaCl
CONCENTRACION
(gr/L)
X0 = 1.8 gr/L
A BO RAT O R I O D E B I O P R OC E S O S
GRUPO B-4
Pgina 50
2011
S0 = 0
Sf = 3.77 gr/L
C
45%
N
9%
Mg
0.4
%
K
0.5
%
P
2.0
%
Yx/s=(42.105/45)x0.5
A BO RAT O R I O D E B I O P R OC E S O S
GRUPO B-4
Pgina 50
2011
Vo=800ml
Xo=0.2g/L
Xf=2g/L
X=1.8 g/l
So=?
A BO RAT O R I O D E B I O P R OC E S O S
GRUPO B-4
Pgina 50
2011
Y x / s=
X f X 0
S 0S f
Entonces, So=?
1.8
0.468
S o=
S o=3.8462 g/ L
t=
t=
1
u max
ln (
xf
)
xo
1
2
ln (
)
0.2
(0.37)
t=6.22 horas
So=0 gr/L
Xo=1.8gr/L
umax=0.37h-1
= 0.47 g/g
x/s
Vo=800ml
A BO RAT O R I O D E B I O P R OC E S O S
GRUPO B-4
Pgina 50
2011
V V 0 1.60.8
dV
=F entonces : F= f
=
=0.16 L/h=2.67 ml /min
dt
t
5
Condiciones de transicin
cumplir:
Como se tiene dos zonas de crecimiento, por teora sabemos que se debe
Biomasa producida en la zona de crecimiento exponencial
= Biomasa producida en la zona de crecimiento limitado
A BO RAT O R I O D E B I O P R OC E S O S
GRUPO B-4
Pgina 50
2011
u t
XoVo e max. = FSfYX/S t + SoVo + XoVo
Despejando Sf, obtenemos que:
S F =
( XoVo eu
.t T
SoVoXoVo)
F Y X / S tT
max
Reemplazando:
(1.80.8 e 0.372.5 00.81.80.8)
S F =
0.160.472.5
S F =11.66 g /L
Tendremos que:
Asimismo, Sf=?
y So=0gr/l
ASIMISMO:
Sf=?
A BO RAT O R I O D E B I O P R OC E S O S
GRUPO B-4
Pgina 50
2011
A partir de:
Sabiendo que:
ks=0.01
umax=0.37h-1
= 0.47 g/g
x/s
Reemplazando:
(0.1611.660.4670.01)
SF =
0.1611.660.467 ( 0.3751 ) + ( 0+ 1.80.8 )0.37
S F =0.01368 gr / L
NA=
. x
yo 2
Donde:
x: Biomasa
Yo2: Rendimiento de O2
1 5 g cel.
0,4 ) (
)
(
h
L
NA=
( 1,25
gO2
)
L.h
NA=1,6
g cel
gO2
A BO RAT O R I O D E B I O P R OC E S O S
GRUPO B-4
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KLA=
2011
NA
(CLCL)
Donde:
cel
)
gO 2
KLA=
( 0,60,12 ) mgO 2
L
KLA=3333,3 g cel/ L
(1,6 g
A BO RAT O R I O D E B I O P R OC E S O S
GRUPO B-4
Pgina 50
B= 29.41 g citrato/100 ml
[B]= (29.41/170.14*100)=1.73M
Luego, se tomo:
P.M=192.13gr/mol
P.M=170.14 gr/mol
157.5 ml A + 92.5 ml B
KOH
[A]= (1.19*157.5/500)=0.375M
[B]= (1.73*92.5/500)=0.32M
pka=3.13
pH =pka + log([sal]/[acido])
pH = 3.13 + log(0.32/0.375)
pH citrato= 4.2
ajuste pH HCl y
vvm=2,035 10
NA T
Donde:
T: Temperatura en K
: Eficiencia de Absorcin
g.K
L. h
a nivel de laboratorio.
Q=vvm VL
Donde:
Q=0,5
g . K
1,8 L
l.h
Q=0,9
L
h