Anda di halaman 1dari 15

Tepi pemotongan dari teknologi elektroforesis afinitas

Eiji Kinoshita *, Emiko Kinoshita-Kikuta and Tohru Koike

Departemen Ilmu Molekuler Fungsional, Institut Biomedis dan Ilmu Kesehatan,


Universitas Hiroshima, Kasumi 1-2-3, Hiroshima 734-8553, Jepang; E-Email:
kikuta@hiroshima-u.ac.jp (E.K.-K.); tkoike@hiroshima-u.ac.jp (T.K.)
Received: 26 January 2015 / Accepted: 11 March 2015 / Published: 18 March 2015

Abstrak: Elektroforesis afinitas adalah teknik penting yang banyak digunakan


untuk memisahkan dan menganalisis biomolekul di bidang biologi dan
kedokteran. Kedua informasi analisis kuantitatif dan kualitatif dapat diperoleh
melalui elektroforesis afinitas. Elektroforesis afinitas dapat diterapkan melalui
berbagai metode, seperti pergeseran mobilitas elektroforesis, biaya pergeseran
elektroforesis kapiler atau afinitas elektroforesis. metode ini didasarkan pada
perubahan dalam pola elektroforesis makromolekul biologis yang dihasilkan dari
interaksi atau proses yang formasi kompleks yang menyebabkan perubahan
ukuran atau total biaya dari molekul. Fragmen asam nukleat dapat dicirikan
melalui afinitas mereka dari molekul lain, misalnya faktor transkripsi protein.
Membran protein hidrofobik dapat diidentifikasi dengan cara pergeseran mobilitas
yang disebabkan oleh deterjen digunakan. Berbagai metode juga telah digunakan
dalam estimasi konstanta asosiasi / pemisahan. Beberapa metode ini memiliki
kesamaan dengan kromatografi afinitas, dalam bahwa mereka menggunakan
probe atau ligan bergerak pada matriks didukung untuk elektroforesis. Metode
tersebut baru-baru ini telah memberikan kontribusi untuk profiling modifikasi
posttranslational utama protein, seperti glikosilasi atau fosforilasi. Di sini, kita
menggambarkan kemajuan dalam teknik analisis yang melibatkan afinitas
elektroforesis yang telah muncul selama lima tahun terakhir.
Kata Kunci: elektroforesis afinitas; elektroforesis afinitas kapiler; afinitasperangkap gel poliakrilamid elektroforesis; elektroforesis afinitas sakarida;
didukung molekul matriks elektroforesis; elektroforesis afinitas fosfat; phos-tag;
modifikasi posttranslational

1. Pendahuluan
Elektroforesis afinitas adalah teknik pemisahan yang didasarkan pada
fenomena dimana mobilitas molekul bermuatan dalam medan listrik arus
searah bervariasi sesuai dengan apakah atau tidak mereka berinteraksi dengan
molekul lain yang mereka miliki afinitas. Elektroforesis afinitas telah menjadi
teknik penting, terutama di sektor biologis dan medis, di mana ia digunakan
untuk memisahkan dan menganalisis makromolekul biologi. Teknik
elektroforesis afinitas pertama, lintas elektroforesis, dikembangkan oleh
Nakamura et al. [1,2]. Lintas elektroforesis telah digunakan dalam deteksi
kompleks enzim-substrat [3-6] dan di analisis kinetika reaksi antigen-antibodi
[7,8]. Prinsip yang terkait dengan metode ini telah diterapkan dalam teknik
roket immunoelectrophoresis dan menyeberangi immunoelectrophoresis [9].
Berbagai macam teknik elektroforesis afinitas telah dikembangkan yang
memberikan hasil kualitatif yang baik atau memiliki kemampuan pemisahan
yang baik. Salah satu teknik perintis tersebut adalah bahwa dari affinophoresis
[10], yang memanfaatkan affinophore, polimer hidrofilik menuduh bahwa
mengikat molekul dengan afinitas yang cocok. Dalam affinophoresis, hanya
molekul yang mengikat secara khusus untuk affinophore dapat diinduksi untuk
bermigrasi dengan penerapan medan listrik. Perkembangan probe afinitas (atau
ligan afinitas), yang merupakan molekul yang memiliki afinitas untuk molekul
tertentu, sekarang menempati peran penting dalam pertumbuhan teknologi
elektroforesis afinitas. Selain itu, teknik elektroforesis afinitas berdasarkan
retardasi migrasi molekul yang mengikat kuat ke probe afinitas bergerak pada
matriks didukung juga telah dikembangkan, dan ini telah memberikan
kontribusi untuk analisis modifikasi posttranslational utama protein [14/11].
Berbagai jenis peralatan untuk elektroforesis afinitas telah dikembangkan
untuk digunakan dalam teknik seperti elektroforesis kapiler [15-17] dan
microchip elektroforesis [18-20]. Kapiler afinitas elektroforesis, khususnya,
telah banyak digunakan sebagai teknik untuk berbagai mode di bidang ilmu
kehidupan [21]. Selain itu, afinitas elektroforesis juga digunakan dalam teknik
elektroforesis baru di mana poli (vinilidena) (PVDF) membran digunakan
sebagai novel didukung matriks molekul [22-24]. Upaya telah dilakukan untuk
menerapkan teknik ini di pemisahan afinitas glikoprotein besar [25].
Artikel ini menjelaskan kemajuan dalam teknik analisis yang melibatkan
afinitas elektroforesis yang telah muncul selama lima tahun terakhir. Selain itu,
memperkenalkan teknik untuk analisis protein terfosforilasi yang didasarkan
pada probe fosfat-afinitas, phos-tag [11,26-33], yang kami mengembangkan,
dan itu menggambarkan kontribusi dibuat untuk phosphoproteomics dengan
teknik berdasarkan phos-tag.
2. Kapiler afinitas Elektroforesis
Kapiler afinitas elektroforesis (CAE) adalah metode yang menggabungkan
penggunaan interaksi antarmolekul dalam solusi gratis dengan elektroforesis
kapiler. Dalam CAE, molekul fluorophore-label yang memiliki afinitas untuk
molekul target digunakan sebagai probe afinitas. Probe afinitas dan sampel
campuran, dan kompleks yang dihasilkan dipisahkan oleh elektroforesis

kapiler. Metode beroperasi pada prinsip bahwa mobilitas perubahan molekul


target sebagai hasil dari interaksi antarmolekul (Gambar 1). Sebuah sistem
deteksi berdasarkan pemindaian laser-induced fluorescence memungkinkan
deteksi dengan sensitivitas tinggi dan presisi tinggi, bahkan dengan jumlah
menit (<1 uL) dari sampel. Bagian ini difokuskan pada kemajuan dalam teknik
CAE melibatkan pelabelan neon molekul afinitas.

Gambar 1. Skema representasi dari kapiler afinitas elektroforesis (CAE).


Probe afinitas fluorescently berlabel dicampur dengan sampel, dan kompleks
yang dihasilkan dipisahkan oleh elektroforesis kapiler. Prinsip pemisahan
adalah perubahan mobilitas yang dihasilkan dari perbedaan dalam
keseimbangan dinamis antara molekul target dan probe afinitas di bidang
elektroforesis. Metode ini juga memungkinkan migrasi dari listrik hanya
mereka molekul yang sangat terikat pada probe afinitas
Shimura dan Karger menggunakan antigen-binding fragmen (Fab)
wilayah fluorophore-berlabel imunoglobulin dimurnikan dari antibodi
monoklonal sebagai penyelidikan afinitas untuk melakukan CAE dari
pertumbuhan hormon manusia [15]. Karena keseragaman biaya listrik adalah
penting dalam meningkatkan kekhususan berlabel Fab ke molekul target,
Shimura dan Karger fluorescently berlabel residu sistein tertentu pada wilayah
Fab dan kemudian dimurnikan sebelum digunakan. Dengan metode ini, spesies
deamidated hormon pertumbuhan manusia berhasil dipisahkan. Shimura dan
Kasai meningkatkan persiapan probe afinitas dengan menggunakan mahal
berkadar rendah antibodi monoklonal, dan mereka menggambarkan metode
persiapan baru yang menggunakan antibodi rekombinan [16]. Metode baru
dengan antibodi rekombinan memungkinkan pengenalan residu sistein untuk

pelabelan neon, substitusi residu asam amino untuk mengontrol biaya listrik
dan persiapan skala besar. Shimura dan Kasai juga menyiapkan penyelidikan
afinitas dari antibodi rekombinan terhadap insulin manusia, dan mereka tampil
CAE insulin. Meskipun kompleks probe afinitas dan insulin dipisahkan cepat
dengan paruh hanya beberapa menit, kompleks berhasil dideteksi karena
elektroforesis selesai dalam waktu lima menit.
Phillips dan Wellner mengembangkan sistem elektroforesis kapiler
berbasis microchip untuk pemisahan antigen dalam sampel [17]. Mereka
bergerak antibodi ke filter kaca dan dimasukkan filter ke port injeksi
microchip. Antigen dalam sampel ditangkap dan fluorescently berlabel di filter
kaca dan kemudian dielusi dan dipisahkan oleh elektroforesis kapiler. Enam
kemokin berhubungan dengan peradangan saraf pada bayi prematur yang
berhasil dipisahkan dan dihitung dari sampel cairan serebrospinal dalam waktu
sepuluh menit. Fakta bahwa konsentrasi kemokin ini berada di wilayah 10 pg /
mL membuktikan bahwa metode ini sangat sensitif.
Satu keuntungan dari CAE adalah bahwa probe afinitas dapat disiapkan
untuk berbagai molekul mulai dari makromolekul (seperti antibodi) untuk
senyawa molekul rendah berat. Keuntungan lain adalah bahwa pemisahan CAE
dapat diselesaikan dengan waktu singkat migrasi, memungkinkan deteksi
kompleks berumur pendek yang tidak dapat dideteksi dengan metode lain.
Akibatnya, CAE harus memiliki berbagai aplikasi lebih lanjut dalam analisis
berbagai interaksi antarmolekul.
3. Afinitas-Perangkap Poliakrilamid Gel Elektroforesis
Gel poliakrilamid elektroforesis (PAGE) telah menjadi yang palingbanyak diadopsi metode untuk pemisahan protein, karena memiliki
kemampuan pemisahan yang baik dan karena dapat digunakan dalam
kombinasi dengan berbagai metode analisis lainnya, seperti Western blotting,
analisis urutan asam amino atau spektrometri massa, setelah protein telah
ditransfer ke membran PVDF. Awada dkk. maju afinitas-perangkap
HALAMAN (AT-PAGE), teknik yang mengeksploitasi sifat-sifat gel
poliakrilamida [34]. Dalam metode ini, sampel protein yang diperoleh dari
spesimen biologi dipisahkan oleh PAGE dan kemudian ditransfer ke gel
poliakrilamid (gel afinitas-trap) yang probe afinitas yang bergerak. Pada
langkah pemindahan, protein yang tidak memiliki afinitas untuk probe afinitas
melewati gel afinitas-perangkap. Protein terjebak oleh gel afinitas-perangkap
dapat divisualisasikan oleh gel pewarnaan dan diidentifikasi oleh spektrometri
massa setelah di-gel pencernaan (Gambar 2). Dengan menggunakan tripsin
sebagai probe afinitas dan ekstrak kasar tepung kedelai sebagai sampel, Awada
dkk. berhasil mengisolasi dan mengidentifikasi inhibitor tripsin [34]. ATPAGE mungkin akan berguna dalam analisis perbedaan dalam ekspresi protein
tertentu dan dalam analisis modifikasi posttranslational protein, serta dalam
isolasi dan pemurnian protein dari spesimen biologi
4. Afinitas Elektroforesis Sakarida
Di antara berbagai modifikasi posttranslational protein, glikosilasi adalah
jenis luas modifikasi yang memainkan peran penting dalam biokimia protein.
Bidang studi glikoprotein disebut glycoproteomics dan baru-baru memperoleh

pentingnya. Dalam mengembangkan teknik mereka dari boronate afinitas


sakarida elektroforesis, Jackson et al. dimanfaatkan afinitas sakarida untuk
senyawa boron [12]. Gambar 3A menunjukkan mekanisme ikatan reversibel
dari sakarida untuk senyawa boron. Dalam boronate afinitas sakarida
elektroforesis, senyawa boron yang beroperasi sebagai probe afinitas untuk
sakarida tertentu (fruktosa) atau polialkohol linear derivatif sakarida yang
mengandung asam sialat bergerak oleh kopolimerisasi dalam gel
poliakrilamida. Sakarida yang memiliki afinitas untuk senyawa boron
bermigrasi lebih lambat melalui gel ini sebagai hasil dari interaksi dengan
senyawa boron. Gambar 3B menunjukkan struktur molekul probe afinitas [3(methacryloylamino) fenil] asam boronat (MPBA). Dengan menggunakan
kopolimer akrilamida-MPBA sebagai gel, Jackson et al. berhasil memisahkan
sakarida berat molekul rendah, termasuk monosakarida dan disakarida,
menurut perbedaan dalam struktur mereka [12]. Morais et al. menerapkan
metode ini untuk analisis glikoprotein dan berhasil memisahkan glikoprotein
dalam sampel dari pasien diabetes [13]. Aikyo dan Oh-Ishi mengembangkan
metode pemisahan di mana perbedaan dalam rantai gula glikoprotein tercermin
dalam perbedaan mobilitas mereka [14]. Karena protein memiliki berat
molekul urutan puluhan ribu hingga ratusan ribu Dalton dan rantai gula
memiliki berat molekul urutan beberapa ribu Dalton, sulit untuk glikoprotein
terpisah dengan SDS-PAGE semata-mata atas dasar perbedaan dalam struktur
rantai gula mereka. Aikyo dan Oh-Ishi karena itu berusaha untuk menganalisis
perbedaan dalam struktur rantai gula melekat pada protein yang dipilih melalui
dua dimensi (2D) elektroforesis gel (atau elektroforesis diagonal) di mana
dimensi pertama adalah isoelektrik fokus dengan gel agarosa [35] atau SDSPAGE dan dimensi kedua adalah SDS-PAGE pada gel MPBA-bergerak.
Karena MPBA memiliki afinitas yang berbeda untuk sakarida yang berbeda,
pemisahan dan analisis berbagai glikoprotein dimungkinkan dengan metode ini

Gambar 2. Skema representasi dari afinitas-perangkap elektroforesis gel


poliakrilamid (AT-PAGE). Sampel protein yang diperoleh dari spesimen biologi
dipisahkan oleh HALAMAN normal dan kemudian ditransfer ke gel perangkap
yang probe afinitas yang bergerak. Protein yang tidak memiliki afinitas untuk
probe afinitas melewati gel perangkap. Protein yang berinteraksi secara khusus
dengan probe afinitas dan terjebak oleh perangkap gel segera terdeteksi dan dapat
dengan mudah diidentifikasi dengan cara Western blotting atau spektrometri
massa.

Gambar 3. Polisakarida afinitas elektroforesis. (A) ikatan Reversible antara


senyawa boron dan polisakarida; (B) probe afinitas MPBA.
5.

Didukung Molekuler Matrix Elektroforesis dan Aplikasinya untuk afinitas


Elektroforesis
Mucins adalah glikoprotein kental yang dihasilkan oleh sel-sel epitel. Telah
dilaporkan bahwa perubahan dalam struktur rantai gula mucins terkait dengan
keberadaan tumor. Namun, karena mucins adalah protein raksasa dengan berat
molekul megadaltons dan rantai gula beberapa, yang mencakup 50% -80% dari
berat molekul ini, menghambat degradasi mucins oleh protease, penelitian tentang
mucins telah tertinggal di belakang perkembangan terakhir di proteomik klinis,
terutama di glycoproteomics dan teknologi analitis yang terkait. Untuk izin
analisis mucins, Matsuno et al. didirikan teknik membran elektroforesis bahwa
mereka bernama didukung elektroforesis molekul matriks (SMME) [22-24].
Dalam metode ini, serat dari hidrofobik membran PVDF berpori, digunakan
sebagai matriks didukung, dilapisi dengan poli hidrofilik (vinil alkohol), yang
beroperasi sebagai pembawa pemisahan (Gambar 4). Meskipun metode ini mirip
dengan klasik selulosa asetat elektroforesis, hal itu berbeda dalam beberapa hal, di
produk sampingan yang (misalnya, fragmen glukosa dari selulosa) yang mungkin
mengganggu analisis rantai gula tidak diproduksi selama pengobatan glikosidase,
karena PVDF hidrofobik kimia-stabil membran yang digunakan, memungkinkan
protein yang tetap pada membran setelah migrasi ke dideteksi dengan
menggunakan antibodi atau lektin. Atas dasar posisi band SMME dan analisis
spektrometri massa berikutnya, Matsuno et al. menunjukkan bahwa profil rantai
gula mucins berbeda tergantung pada jenis jaringan tumor dari mana mereka
berasal [22-24].
Matsuno dan Kameyama telah mengembangkan teknik yang
menggabungkan afinitas elektroforesis dengan didukung matriks elektroforesis

molekul (afinitas-SMME) dan yang memanfaatkan interaksi hidrofobik antara


membran PVDF dan biomolekul [25]. Sebuah pembawa pemisahan untuk
afinitas-SMME disiapkan dengan memungkinkan membran PVDF untuk
menyerap zat, seperti protein atau lipid, yang mampu interaksi hidrofobik dan
yang bertindak sebagai probe afinitas dan kemudian lapisan membran yang
dihasilkan dengan polimer hidrofilik (Gambar 4) . Ketika membran siap
digunakan dalam elektroforesis, zat yang berinteraksi dengan molekul teradsorpsi
pada membran bermigrasi lebih lambat. Dengan menggunakan membran PVDF
ke mana lektin, glikolipid atau antibodi yang teradsorpsi, Matsuno dan Kameyama
berusaha untuk mendeteksi interaksi lemah antara rantai gula dan zat yang
mengakui rantai gula. Karena berbagai probe afinitas dapat segera bergerak,
teknik ini bisa memberikan terobosan dalam mencari glikoprotein mampu
bertindak sebagai biomarker baru untuk berbagai penyakit.

Gambar 4. Skema representasi dari didukung elektroforesis matriks molekul


(SMME). SMME menggunakan membran hidrofobik (PVDF) yang adsorbsi
protein sebagai media pemisahan untuk elektroforesis setelah hidrofilisasi
(kiri). Dengan menggunakan prinsip ini, media pemisahan untuk
elektroforesis afinitas dapat dengan mudah dibuat dengan hidrofilisasi
membran PVDF setelah itu telah terserap komponen biologis, seperti protein,
yang bertindak sebagai probe afinitas (kanan).
6.

Afinitas Elektroforesis Fosfat


Kami telah terlibat dalam mengembangkan teknik yang dikenal sebagai
fosfat afinitas elektroforesis (phos-tag SDS-PAGE), di mana phos-tag [36],
sebuah molekul yang mengikat secara khusus untuk ion divalen fosfat dalam
larutan netral, digunakan sebagai afinitas menyelidiki. Dalam metode ini, gel di
mana akrilamida-independen phos-tag monomer dikopolimerisasikan digunakan
sebagai gel pemisahan. Protein terfosforilasi bermigrasi lebih lambat melalui gel
daripada yang sesuai protein non-terfosforilasi, karena protein terfosforilasi
bermigrasi dengan formasi reversibel berulang dan terputusnya ikatan dengan
gugus phos-tag bergerak pada gel (Gambar 5). Dalam metode ini, bahkan molekul

protein yang sama dengan nomor yang sama dari residu asam amino terfosforilasi,
tapi yang terfosforilasi di situs asam amino yang berbeda, menunjukkan pola
mobilitas yang berbeda dan dapat terdeteksi sebagai band yang terpisah [27,37].
Dengan kata lain, metode ini dapat mengungkapkan perbedaan di negara-negara
fosforilasi protein tertentu. Selain itu, metode ini mampu secara bersamaan
memvisualisasikan berbagai bentuk terfosforilasi dari protein, termasuk bentukbentuk non-terfosforilasi, dan mengukur rasio mereka.

Gambar 5. Skema representasi dari fosfat afinitas elektroforesis (phos-tag


SDS-PAGE). Kopolimerisasi akrilamida-independen phos-tag dengan
akrilamida menyediakan gel SDS-PAGE yang secara khusus dapat mengikat
protein terfosforilasi migrasi pada gel. Hal ini memungkinkan pemisahan
berbagai bentuk terfosforilasi dari protein, yang memungkinkan analisis
kuantitatif dari negara fosforilasi secara keseluruhan dan memberikan
informasi tentang perbedaan dalam fungsi protein yang timbul dari perbedaan
di negara-negara fosforilasi mereka.
a.

Contoh Analisis Terfosforilasi Protein oleh Mn2 + -Phos-Tag SDS-PAGE


Kimura et al. ditandai menyatakan fosforilasi protein pascatranslasi
dimodifikasi oleh 2D elektroforesis dengan isoelektrik fokus pada dimensi
pertama, Mn2 + -Phos-tag SDS-PAGE di kedua dimensi dan spektrometri
massa setelah elektroforesis [40]. Mereka meneliti heterogen
ribonucleoprotein nuklir K (hnRNP K), yang terlibat dalam acara, seperti
renovasi kromatin, transkripsi dan translasi atau mRNA pengolahan, dan
mereka mengungkapkan bahwa beberapa bentuk hnRNP K ada yang
memiliki negara fosforilasi yang berbeda dalam hal jumlah dan lokasi dari
kelompok fosfat. Hosokawa et al. berhasil mengukur di negara-negara
fosforilasi vivo dari cyclin-dependent kinase 5 (Cdk5) aktivator P35 (Cdk5P35), yang mengatur siklus sel berkembang biak sel [41]. Meskipun Cdk5-

b.

c.

P35, yang memiliki beberapa situs fosforilasi, menghasilkan pola pita


kompleks dalam Mn2 + -Phos-tag SDS-PAGE, kombinasi teknik dengan
mutasi spesifik asam amino memungkinkan para peneliti untuk mencocokkan
negara fosforilasi untuk banding yang pola. Selain itu, mereka dihitung rasio
individu dalam bentuk vivo terfosforilasi.
Kuantifikasi berbagai bentuk terfosforilasi rantai cahaya myosin, yang
sulit untuk melakukan dengan menggunakan sistem HALAMAN
konvensional, dapat dengan mudah dilakukan dengan menggunakan Mn2 + Phos-tag sistem SDS-PAGE, dan banyak peneliti di seluruh dunia telah
menggunakan sistem ini untuk mencapai analisis kuantitatif rantai cahaya
myosin [42-45].
Pengembangan Peningkatan Protocol, Netral phos-Tag SDS-PAGE
Sejak tahap awal dalam pengembangan Mn2 + -Phos-tag sistem SDSPAGE (lihat Bagian 6.1), kita sudah tahu bahwa beberapa bentuk
terfosforilasi protein tidak dapat dideteksi dengan menggunakan sistem ini
[37]. Karena phos-tag pada awalnya dirancang untuk menggunakan kompleks
seng yang mengikat secara optimal untuk kelompok fosfat dalam larutan air
netral, kondisi untuk Mn2 + -Phos-tag sistem SDS-PAGE tidak optimal. Oleh
karena itu kami menggunakan Zn2 + -Phos-tag kompleks (Gambar 5, M2 + =
Zn2 +) dalam suatu sistem SDS-PAGE dalam kondisi netral untuk
memecahkan masalah ini. Sistem ditingkatkan ini menunjukkan kemampuan
secara signifikan lebih besar untuk memisahkan banyak protein, dan itu
memungkinkan analisis rinci harus dibuat dari negara fosforilasi protein in
vivo. Selain itu, memfasilitasi penggunaan 2D perbedaan gel elektroforesis
(2D-DIGE) dan diharapkan untuk memajukan analisis yang komprehensif
rinci bentuk terfosforilasi protein dalam sel. Kami telah bernama ditingkatkan
protokol ini "netral phos-tag SDS-PAGE". Jika Anda tertarik untuk kemajuan
dalam phos-tag sistem SDS-PAGE kami, silahkan lihat kertas baru-baru kami
pada subjek [30-32]. Netral phos-tag SDS-PAGE adalah lebih tahan lama,
dan itu memungkinkan pengembangan gel pracetak dengan kualitas dan rak
hidup jangka panjang terjamin. Baru-baru ini, netral phos-tag SDS-PAGE gel
pracetak telah dikomersialisasikan oleh Wako Pure Chemical Industries, Ltd
(Osaka, Jepang) sebagai SuperSep phos-tag [33]. Penggunaan gel pracetak
patut dipertimbangkan dalam hal hemat tenaga kerja, menghemat waktu dan
kehandalan dalam mendeteksi
Analisis Kimia tidak stabil Histidine- atau aspartat Asam-Terfosforilasi
Protein
Di antara sistem signaling intraseluler bakteri dan tanaman duakomponen sistem sinyal yang dimediasi oleh fosforilasi dari histidin (Nya)
dan asam aspartat (Asp) residu. Namun, karena ketidakstabilan kimia
terfosforilasi Nya dan spesies Asp, beberapa metode yang tersedia untuk
analisis mereka, dan akibatnya, data protein yang mengandung spesies seperti
langka dibandingkan dengan protein terfosforilasi pada residu serin, treonin
atau tirosin. Dengan menggunakan kami Mn2 + - dan Zn2 + -Phos-tag sistem
SDS-PAGE, kami menunjukkan bahwa analisis kuantitatif dari keadaan
fosforilasi Nya dan Asp residu yang mungkin. Kami juga berhasil pengukuran

rinci perubahan tergantung waktu di transfosforilasi dari-Nya untuk Asp


dalam kinase histidin dan regulator respon yang berfungsi sebagai molekul
sinyal pada bakteri [37,46,47]. Baru-baru ini, banyak kelompok penelitian
lain telah juga menunjukkan utilitas dari phos-tag sistem SDS-PAGE
d. Pengembangan Microchip Berbasis phos-Tag Elektroforesis
Han et al. disintesis kopolimer linier akrilamida-independen phos-tag
dan dimetilakrilamida sebagai pembawa pemisahan yang mereka digunakan
untuk mengisi saluran pembawa microchip dengan suntikan otonom untuk
membentuk microchip cocok untuk digunakan dalam fosfat afinitas
elektroforesis [18-20]. Metode ini sangat berguna untuk analisis kuantitatif
cepat dari rasio fosforilasi / defosforilasi peptida substrat setelah di vitro
kinase atau fosfatase reaksi. Ini telah dipertimbangkan untuk digunakan
sebagai Microsystem untuk penentuan aktivitas enzim intraseluler dalam
diagnosis penyakit, termasuk kanker. Karena berbasis microchip
elektroforesis cocok untuk pemisahan kecepatan tinggi dari jumlah menit
sampel dan karena visualisasi data dan analisis data yang terintegrasi dalam
chip itu sendiri, berbasis microchip elektroforesis diharapkan menjadi banyak
digunakan sebagai metode alternatif untuk rumit slab-gel elektroforesis.
Prinsip berbasis phos-tag afinitas fosfat elektroforesis akan diterapkan tidak
hanya untuk berbasis microchip elektroforesis, tetapi juga untuk sistem
elektroforesis lain, dan ini harus mengarah pada kemajuan dalam sistem
mudah dan sederhana untuk analisis fosforilasi.
7. Kesimpulan
Sebagai hasil dari perkembangan yang luar biasa baru-baru ini teknologi di
proteomik, sekarang mungkin untuk mendapatkan jumlah besar data yang akurat
dengan cepat. Namun, ada banyak biomolekul, termasuk protein pascatranslasi
dimodifikasi yang memainkan peran penting dalam vivo, yang belum diteliti
karena kesulitan dalam analisis mereka. Teknik elektroforesis afinitas telah
membuat terobosan besar dalam penelitian yang melibatkan analisis rinci
biomolekul tersebut. Salah satu keuntungan menggunakan afinitas elektroforesis
adalah bahwa sampel protein terpisah bisa diperbaiki dalam matriks
elektroforesis, seperti poliakrilamida gel atau membran PVDF, dan kemudian,
molekul target dapat divisualisasikan selektif oleh berbagai pewarnaan dan
beberapa teknik imunoblotting. Selanjutnya, teknik elektroforesis afinitas telah
membuat kontribusi penting untuk analisis interaksi antarmolekul reversibel yang
memainkan peran kunci dalam berbagai sistem biologi. Karena ruang lingkup
probe afinitas tak terbatas, kombinasi cerdik probe afinitas dengan teknik
elektroforesis harus akhirnya mengungkapkan perilaku berbagai biomolekul.

DAFTAR PUSTAKA
1. Nakamura, S.; Takeo, K.; Sasaki, I.; Murata, M. Proof of the formation of enzymesubstrate complex by crossing-paper electrophoresis. Nature 1959, 184, 638639.
2. Nakamura, S.; Takeo, K.; Tanaka, K.; Ueta, T. Crossing methods in paper
electrophoresis. Hoppe-Seylers Z. Physiol. Chem. 1960, 318, 115128.
3. Nakamura, S.; Takeo, K.; Sasaki, I. Detection of enzyme substrate complexes by
crossing electrophoresis. Hoppe-Seylers Z. Physiol. Chem. 1962, 328, 139144.
4. Nakamura, S.; Takeo, K.; Sasaki, I. Demonstration of enzyme substrate complexes
in inactive or inactivated enzymes. Hoppe-Seylers Z. Physiol. Chem. 1963, 334, 95
102.
5. Takeo, K.; Nakamura, S. Dissociation constants of glucan phosphorylases of rabbit
tissues studied by polyacrylamide gel disc electrophoresis. Arch. Biochem. Biophys.
1972, 153, 17.
6. Takeo, K.; Nitta, K.; Nakamura, S. Demonstration of phosphorylase in urines by
polyacrylamide gel disc electrophoresis. Clin. Chim. Acta 1974, 57, 4554.
7. Takeo, K.; Kabat, E.A. Binding constants of dextrans and isomaltose
oligosaccharides to dextran-specific myeloma proteins determined by affinity
electrophoresis. J. Immunol. 1978, 121, 23052310.
8. Sugii, S.; Takeo, K.; Kabat, E.A. Binding constants of NZB myeloma antidextrans
for dextrans and isomaltose oligosaccharides determined by affinity electrophoresis.
J. Immunol. 1979, 123, 11621168.
9. Bg-Hansen, T.C.; Takeo, K. Determination of dissociation constants by affinity
electrophoresis: Complexes between human serum proteins and concanavalin A.
Electrophoresis 1980, 1, 6771.
10. Shimura, K. Progress in affinophoresis. J. Chromatogr. 1990, 510, 251270.
Kinoshita, E.; Kinoshita-Kikuta, E.; Takiyama, K.; Koike, T. Phosphate-binding tag,
a new tool to visualize phosphorylated proteins. Mol. Cell. Proteomics 2006, 5, 749
757.
12. Jackson, T.R.; Springall, J.S.; Rogalle, D.; Masumoto, N.; Li, H.C.; DHooge, F.;
Perera, S.P.; Jenkins, T.A.; James, T.D.; Fossey, J.S.; et al. Boronate affinity
saccharide electrophoresis: A novel carbohydrate analysis tool. Electrophoresis 2008,
29, 41854191.
13. Morais, M.P.P.; Mackay, J.D.; Bhamra, S.K.; Buchanan, J.G.; James, T.D.;
Fossey, J.S.; van den Elsen, J.M.H. Analysis of protein glycation using
phenylboronate acrylamide gel electrophoresis. Proteomics 2010, 10, 4858.
14. Aikyo, Y.; Oh-Ishi, M. Analysis of glycoproteins by SDS-PAGE with
methacrylamido phenyl boronic acid. Electrophor. Lett. (Seibutsu Butsuri Kagaku)
2014, 58, 3335.
15. Shimura, K.; Karger, B.L. Affinity probe capillary electrophoresis: Analysis of
recombinant human growth hormone with a fluorescent labeled antibody fragment.
Anal. Chem. 1994, 66, 915.

16. Shimura, K.; Kasai, K. Affinity probe capillary electrophoresis of insulin using a
fluorescence-labeled recombinant Fab as an affinity probe. Electrophoresis 2014, 35,
840845.
17. Phillips, T.M.; Wellner, E. Detection of cerebral spinal fluid-associated
chemokines in birth traumatized premature babies by chip-based immunoaffinity CE.
Electrophoresis 2013, 34, 15301538.
18. Han, A.; Hosokawa, K.; Maeda, M. Phosphate-affinity electrophoresis on a
microchip for determination of protein kinase activity. Electrophoresis 2009, 30,
35073513.
19. Han, A.; Hosokawa, K.; Maeda, M. Activity measurement of protein kinase and
protein phosphatase by microchip phosphate-affinity electrophoresis. Anal. Biochem.
2012, 421, 782784.
20. Han, A.; Hosokawa, K.; Maeda, M. Application of microchip phosphate-affinity
electrophoresis to measurement of protease activity in complex samples. Anal.
Biochem. 2013, 432, 810.
21. Krylov, S.N. Kinetic CE: Foundation for homogeneous kinetic affinity methods.
Electrophoresis 2007, 28, 6988.
22. Matsuno, Y.-K.; Saito, T.; Gotoh, M.; Narimatsu, H.; Kameyama, A. Supported
molecular matrix electrophoresis: A new tool for characterization of glycoproteins.
Anal. Chem. 2009, 81, 38163823.
23. Matsuno, Y.-K.; Dong, W.; Yokoyama, S.; Yonezawa, S.; Saito, T.; Gotoh, M.;
Narimatsu, H.; Kameyama, A. Improved method for immunostaining of mucin
separated by supported molecular matrix electrophoresis by optimizing the matrix
composition and fixation procedure. Electrophoresis 2011, 32, 18291836.
24. Matsuno, Y.-K.; Dong, W.; Yokoyama, S.; Yonezawa, S.; Narimatsu, H.;
Kameyama, A. Identification of mucins by using a method involving a combination
of on-membrane chemical deglycosylation and immunostaining. J. Immunol. Methods
2013, 394, 125130.
25. Matsuno, Y.-K.; Kameyama, A. Affinity electrophoresis on supported molecular
matrix electrophoresis. Electrophor. Lett. (Seibutsu Butsuri Kagaku) 2014, 58, 2729.
26. Kinoshita-Kikuta, E.; Aoki, Y.; Kinoshita, E.; Koike, T. Label-free kinase
profiling using phosphate affinity polyacrylamide gel electrophoresis. Mol. Cell.
Proteomics 2007, 6, 356366.
27. Kinoshita, E.; Kinoshita-Kikuta, E.; Matsubara, M.; Aoki, Y.; Ohie, S.; Mouri,
Y.; Koike, T. Two-dimensional phosphate-affinity gel electrophoresis for the analysis
of phosphoprotein isotypes. Electrophoresis 2009, 30, 550559.
Kinoshita, E.; Kinoshita-Kikuta, E.; Ujihara, H.; Koike, T. Mobility shift detection of
phosphorylation on large proteins using a Phos-tag SDS-PAGE gel strengthened with
agarose. Proteomics 2009, 9, 40984101.
29. Kinoshita, E.; Kinoshita-Kikuta, E.; Koike, T. Separation and detection of large
phosphoproteins using Phos-tag SDS-PAGE. Nat. Protoc. 2009, 4, 15131521.

30. Kinoshita, E.; Kinoshita-Kikuta, E. Improved Phos-tag SDS-PAGE under neutral


pH conditions for advanced protein phosphorylation profiling. Proteomics 2011, 11,
319323.
31. Kinoshita, E.; Kinoshita-Kikuta, E.; Koike, T. Phos-tag SDS-PAGE systems for
phosphorylation profiling of proteins with a wide range of molecular masses under
neutral pH conditions. Proteomics 2012, 12, 192202.
32. Kinoshita-Kikuta, E.; Kinoshita, E.; Koike, T. Separation and identification of
four distinct serine-phosphorylation states of ovalbumin by Phos-tag affinity
electrophoresis. Electrophoresis 2012, 33, 849855.
33. Kinoshita-Kikuta, E.; Kinoshita, E.; Koike, T. A laborsaving, timesaving, and
more reliable strategy for separation of low-molecular-mass phosphoproteins in Phostag affinity electrophoresis. Int. J. Chem. 2012, 4, 18.
34. Awada, C.; Sato, T.; Takao, T. Affinity-trap polyacrylamide gel electrophoresis:
A novel method of capturing specific proteins by electro-transfer. Anal. Chem. 2010,
82, 755761.
35. Oh-Ishi, M.; Satoh, M.; Maeda, T. Preparative two-dimensional gel
electrophoresis with agarose gels in the first dimension for high molecular mass
proteins. Electrophoresis 2000, 21, 16531669.
36. Kinoshita, E.; Takahashi, M.; Takeda, H.; Shiro, M.; Koike, T. Recognition of
phosphate monoester dianion by an alkoxide-bridged dinuclear zinc(II) complex.
Dalton Trans. 2004, 21, 11891193.
37. Kinoshita, E.; Kinoshita-Kikuta, E.; Matsubara, M.; Yamada, S.; Nakamura, H.;
Shiro, Y.; Aoki, Y.; Okita, K.; Koike, T. Separation of phosphoprotein isotypes
having the same number of phosphate groups using phosphate-affinity SDS-PAGE.
Proteomics 2008, 8, 29943003.
38. Laemmli, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of
bacteriophage T4. Nature 1970, 227, 680685.
39. Kinoshita, E.; Kinoshita-Kikuta, E.; Koike, T. Phosphate-affinity gel
electrophoresis using a Phos-tag molecule for phosphoproteome study. Curr.
Proteomics 2009, 6, 104121.
40. Kimura, Y.; Nagata, K.; Suzuki, N.; Yokoyama, R.; Yamanaka, Y.; Kitamura, H.;
Hirano, H.; Ohara, O. Characterization of multiple alternative forms of heterogeneous
nuclear ribonucleoprotein K by phosphate-affinity electrophoresis. Proteomics 2010,
10, 38843895.
41. Hosokawa, T.; Saito, T.; Asada, A.; Fukunaga, K.; Hisanaga, S. Quantitative
measurement of in vivo phosphorylation states of Cdk5 activator p35 by Phos-tag
SDS-PAGE. Mol. Cell. Proteomics 2010, 9, 11331143.
42. Takeya, K.; Loutzenhiser, K.; Shiraishi, M.; Loutzenhiser, R.; Walsh, M.P. A
highly sensitive technique to measure myosin regulatory light chain phosphorylation:
The first quantification in renal arterioles. Am. J. Physiol. Ren. Physiol. 2008, 294,
F1487F1492.
43. El-Yazbi, A.F.; Johnson, R.P.; Walsh, E.J.; Takeya, K.; Walsh, M.P.; Cole, W.C.
Pressure-dependent contribution of Rho kinase-mediated calcium sensitization in

serotonin-evoked vasoconstriction of rat cerebral arteries. J. Physiol. 2010, 588,


17471762.

44. Aguilar, H.N.; Tracey, C.N.; Tsang, S.C.; McGinnis, J.M.; Mitchell, B.F. Phostag-based analysis of myosin regulatory light chain phosphorylation in human uterine
myocytes. PLoS One 2011, 6, e20903.
45. Saito, T.; Hirano, M.; Ide, T.; Ichiki, T.; Koibuchi, N.; Sunagawa, K.; Hirano, K.
Pivotal role of Rho-associated kinase 2 in generating the intrinsic circadian rhythm of
vascular contractility. Circulation 2013, 127, 104114.
46. Yamada, S.; Nakamura, H.; Kinoshita, E.; Kinoshita-Kikuta, E.; Koike, T.; Shiro,
Y. Separation of a phosphorylated histidine protein using phosphate affinity
polyacrylamide gel electrophoresis. Anal. Biochem. 2007, 360, 160162.
47. Kinoshita, E.; Kinoshita-Kikuta, E.; Shiba, A.; Edahiro, K.; Inoue, Y.;
Yamamoto, K.; Yoshida, M.; Koike, T. Profiling of protein thiophosphorylation by
Phos-tag affinity electrophoresis: Evaluation of adenosine 5'-O-(3-thiotriphosphate)
as a phosphoryl donor in protein kinase reactions. Proteomics 2014, 14, 668679.
48. Wayne, K.J.; Li, S.; Kazmierczak, K.M.; Tsui, H.C.; Winkler, M.E. Involvement
of WalK (VicK) phosphatase activity in setting WalR (VicR) response regulator
phosphorylation level and limiting cross-talk in Streptococcus pneumoniae D39 cells.
Mol. Microbiol. 2012, 86, 645660.
49. Boulanger, A.; Chen, Q.; Hinton, D.M.; Stibitz, S. In vivo phosphorylation
dynamics of the Bordetella pertussis virulence-controlling response regulator BvgA.
Mol. Microbiol. 2013, 88, 156172.
50. Kaimer, C.; Zusman, D.R. Phosphorylation-dependent localization of the
response regulator FrzZ signals cell reversals in Myxococcus xanthus. Mol.
Microbiol. 2013, 88, 740753.
51. Ishii, E.; Eguchi, Y.; Utsumi, R. Mechanism of activation of PhoQ/PhoP twocomponent signal transduction by SafA, an auxiliary protein of PhoQ histidine kinase
in Escherichia coli. Biosci. Biotechnol. Biochem. 2013, 77, 814819.
52. Li, R.F.; Lu, G.T.; Li, L.; Su, H.Z.; Feng, G.F.; Chen, Y.; He, Y.Q.; Jiang, B.L.;
Tang, D.J.; Tang, J.L.; et al. Identification of a putative cognate sensor kinase for the
two-component response regulator HrpG, a key regulator controlling the expression
of the hrp genes in Xanthomonas campestris pv. campestris. Environ. Microbiol.
2014, 16, 20532071.
53. Madec, E.; Bontemps-Gallo, S.; Lacroix, J.M. Increased phosphorylation of the
RcsB regulator of the RcsCDB phosphorelay in strains of Dickeya dadantii devoid of
osmoregulated periplasmic glucans revealed by Phos-tag gel analysis. Microbiology
2014, 160, 27632770.
54. Allen, J.J.; Li, M.; Brinkworth, C.S.; Paulson, J.L.; Wang, D.; Hbner, A.; Chou,
W.-H.; Davis, R.J.; Burlingame, A.L.; Messing, R.O.; et al. A semisynthetic epitope
for kinase substrates. Nat. Methods 2007, 4, 511516.
55. Kee, J.-M.; Muir, T.W. Chasing phosphohistidine, an elusive sibling in the
phosphoamino acid family. ACS Chem. Biol. 2012, 7, 4451.

56. Carlson, H.K.; Plate, L.; Price, M.S.; Allen, J.J.; Shokat, K.M. Use of a
semisynthetic epitope to probe histidine kinase activity and regulation. Anal.
Biochem. 2010, 397, 139143.
57. Wilke, K.E.; Francis, S.; Carlson, E.E. Activity-based probe for histidine kinase
signaling. J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 91509153.