Transkripsi, Terminasi, dan Pengolahan RNA

Dalam bab sebelumnya kita dianggap struktur RNA polimerase,

turunan inisiasi proses, struktur , dan fungsinya. Dalam bab ini kita akan
terus dengan proses transkripsi. Kami akan mempertimbangkan secara
singkat perpanjangan memproses dan kemudian membahas penghentian
transkripsi. Akhirnya, kami akan membahas pengolahan RNA yang terjadi
setelah transkripsi. Ini meliputi modifikasi sederhana dari RNA oleh
pembelahan atau Selain dari kelompok dan basis, dan pemotongan lebih
kompleks, splicing, dan editing yang lebih sering terjadi pada sel-sel
eukariotik daripada di prokariotik sel.
Polymerase Tingkat Pemanjangan
Bahkan lebih dari itu sel untuk mengatur sintesis RNA di langkah
inisiasi sehingga mesin yang rumit yang terlibat di mandiri mengatur ribuan
gen tidak perlu dibangun ke modul sintesis RNA dasar. Setelah sintesis RNA
telah dimulai, hasil pada tingkat rata-rata yang sama pada kebanyakan,
independen kondisi pertumbuhan. Hal ini dapat dibuktikan? Kebutuhan lain
untuk mengetahui Tingkat perpanjangan RNA dalam penafsiran percobaan
fisiologis. Bagaimana segera setelah tambahan dari sebuah inducer baru
bisa disintesis mRNA molekul muncul?
Pengukuran tingkat RNA perpanjangan tidak terlalu sulit untuk tampil
di vitro, tetapi mereka lumayan lebih sulit untuk melakukan tumbuh sel. Di
sini kita akan menjelaskan salah satu metode yang telah digunakan untuk
menentukan in vivo RNA tingkat elongasi di Escherichia coli.
Pengukuran yang digunakan rifampisin, antibiotik yang menghambat
RNA polymerase hanya pada langkah inisiasi. Ini tidak berpengaruh pada
RNA polimerase molekul bertunangan di pemanjangan. rifamycin dan
radioaktif uridin adalah serentak menambahkan untuk bakteri; demikian
hanya RNA rantai bahwa proses dari pemanjangan waktu penambahan

adalah radioaktif berlabel, dan tidak baru yang bisa menjadi dimulai (Ara.
5.1). Setelah penambahan rifampisin dan uridin, sampel diambil dari budaya
dan RNA mereka dipisahkan menurut ukuran dengan elektroforesis pada gel
poliakrilamida. Misalkan spesies tertentu molekul RNA baik dipisahkan dari
semua spesies lain oleh elektroforesis. Kemudian, radioaktivitas di kelas
ukuran ini akan meningkatkan
Dengan waktu selama molekul RNA polymerase menuliskan sesuai
gen, tetapi sekali molekul polimerase terakhir untuk memulai telah melintasi
kawasan itu, tidak ada peningkatan tambahan dalam radioaktivitas. selang
antara tambahan dari rifamycin dan akhir dari periode di mana radioaktivitas
meningkat adalah waktu yang diperlukan untuk Molekul RNA polimerase
untuk menuliskan dari promotor sampai akhir dari wilayah ditranskrip.
Kompleks gen RNA ribosom adalah sistem yang digunakan untuk
pengukuran ini. Masing-masing tujuh kompleks gen hampir identik terdiri
dari dua promotor berjarak dekat, gen untuk 16S RNA ribosom, wilayah
spacer, gen tRNA, gen untuk 23S ribosom RNA, dan gen untuk 5S RNA
ribosom (Gambar. 5.2). Panjang total unit transkripsi ini sekitar 5.000
nukleotida. Itu 16S RNA, spacer tRNA, 23S RNA, dan RNA 5S semua
dihasilkan oleh belahan dalam sintesis DNA dada dari rantai polinukleotida
tumbuh.
Interval antara waktu penambahan rifamycin dan waktu yang terakhir
molekul RNA polimerase mentranskripsi di akhir gen 5S adalah waktu yang
diperlukan untuk RNA polimerase untuk menuliskan 5.000 basis dari
promotor sampai akhir kompleks gen ribosom. Kali ini ditemukan dari
penggabungan pengukuran uridin radioaktif. Transkripsi gen 5S di berakhir
ketika radioaktivitas di 5S RNA berhenti meningkat. Ini terjadi 90 detik
setelah rifamycin dan uridin tambahan (Ara. 5.3). hasil pemanjangan menilai
dari 60 nukleotida per kedua. Ini tipe dari pemanjangan menilai pengukura
telah dilakukan pada Sel pertumbuhan di banyak berbeda pertumbuhan, dan
sebagai diharapkan, Hasil menunjukkan bahwa RNA rantai pertumbuhan
menilai independen dari pertumbuhan dari Sel diberikan suhu.

Transkripsi Pemutusan di Tempat Tertentu

Jika transkripsi gen yang berbeda akan diatur secara berbeda, maka
gen harus transcripsi dipisahkan. Isolasi transkripsi bisa dicapai tanpa
eksplisit transkripsi hambatan antara gen jika gen secara luas dan jika RNA
polimerase sesekali acak dihentikan transkripsi. Sebuah metode yang lebih
efisien untuk memisahkan unit transkripsi hanyalah untuk memiliki sinyal
terminasi transkripsi di ujungnya.
Sinyal terminasi transkripsi dapat terbukti ada oleh beberapa jenis
eksperimen. Salah satu yang pertama kali dilakukan pada bakteri adalah
genetik. Sebagai disebutkan sebelumnya, unit transkripsi disebut operon.
Bahkan meskipun gen dalam dua operon yang berbeda mungkin terletak
dekat dengan salah satu lain pada kromosom, hanya dengan menghapus
terminasi transkripsi sinyal di itu akhir dari satu operon bisa gen dari kedua
operon menjadi menyatakan control dari pertama promoter (Ara. 5.4).
Tipe kedua dari demonstrasi menggunakan dalam transkripsi vitro.
Radioaktif RNA disintesis di vitro ditandai DNA Template dan dipisahkan
menurut ukuran pada poliakrilamida gel. Beberapa template menghasilkan
kelas diskrit transkrip RNA yang dihasilkan oleh inisiasi pada promotor dan
terminasi di situs sebelum akhir molekul DNA. Sehingga template ini harus
berisi situs terminasi transkripsi. Tentu saja, pembelahan sebuah molekul
RNA dapat keliru untuk penghentian terminasi.
Terminasi
Percobaan sederhana memodifikasi awal dan tengah bagian dari gen
yang paling sering hanya urutan pada akhir ditranskripsi wilayah yang
menentukan terminasi transkripsi. Salah satu mekanisme yang sederhana
untuk terminasi transkripsi pada bakteri menggunakan hanya polimerase
RNA dan membutuhkan hanya urutan 3 ' akhir dari RNA. Penghentian sinyal
terdiri dari wilayah yang kaya basis GC yang dapat membentuk loop hairpin

diikuti oleh serangkaian U. Kelas ini terminator fungsi tanpa perlu faktor
protein tambahan dari sel. Terminasi sistem eukariotik terjadi menjalankan U
ini seperti dalam kasus prokariotik, tetapi tidak ada hairpin hulu semu.
Kemungkinan besar sebagai RNA yang memanjang melewati daerah
kaya GC, berpasangan dengan dirinya sendiri untuk membentuk sebuah
Hairpin (Gambar. 5.5). Hairpin ini mungkin jadi buruk dalam alur transkrip
atau ngarai di polimerase (Gambar. 5.6), melemahkan ikatan polimerase
untuk gelembung transkripsi dan juga menyebabkan RNA polimerase untuk
berhenti sejenak di daerah ini. Melepaskan kemudian terjadi dari
menjalankan U. Pengukuran fisik langsung memiliki menunjukkan bahwa
oligo (ru: dA) hybridizes dengan kelemahan yang luar biasa dibandingkan
untuk oligonukleotida lainnya. Kombinasi faktor-faktor ini perubahan
kompleks RNA elongasi dari yang sangat stabil sampai tidak stabil bahwa
penghentian transkripsi biasanya terjadi.
Kesempatan kedua terminator prokariotik jauh berbeda. Ini kelas
membutuhkan kehadiran protein rho untuk penghentian. Kegiatan
penghentian lanjut dirangsang oleh protein kedua, Nusa produk gen. Selama
transkripsi, RNA polimerase berhenti dekat urutan terminasi, kemungkinan
besar dibantu dalam berhenti oleh protein Nusa, dan kemudian rho
mengakhiri proses transkripsi dan melepaskan RNA dan polimerase RNA.
Analisis 3 'berakhir transkrip tergantung rho mengungkapkan mereka untuk
tidak mengandung pola urutan dilihat atau struktur sekunder yang signifikan.
Mereka memiliki struktur bahkan kurang sekunder dari diharapkan untuk
sama sekali acak urutan.
Kemungkinan besar, ketika RNA baru memanjang dari polimerase RNA
dari ribosom dan tidak memiliki struktur sekunder yang signifikan, protein
dapat mengikat dan bergerak dengan konsumsi energi sepanjang RNA
hingga polimerase. Saat mencapai polimerase, memisahkan transkrip
tumbuh dari template dan berakhir transkripsi. Pemisahan dua untai dicapai
oleh Helikase RNA-DNA (Gambar. 5.7).

Penemuan Faktor rho secara tidak sengaja. Transkripsi lambda DNA

dalam sistem in vitro menghasilkan sejumlah besar salah salinan.
Ketidaktepatan Hal tersebut diungkapkan oleh hibridisasi RNA ke dua helai
dipisahkan dari lambda. Transkrip yang benar akan hibridisasi didominasi
hanya satu untai. Rupanya kondisi digunakan untuk transkripsi tidak
mereproduksi yang ada dalam sel dan faktor rho mengurangi jumlah
transkripsi yang salah. Ini adalah mimpi seorang ahli biokimia untuk itu
berarti bahwa sesuatu yang harus ada dan menunggu untuk ditemukan.
Oleh karena itu Roberts mencari dan menemukan protein dalam ekstrak sel
yang akan meningkatkan transkripsi in vitro. Setelah menyelesaikan
pemurnian dan dalam mempelajari sifat-sifatnya "kesetiaan" faktor, ia
menemukan bahwa transkripsi dihentikan. faktor Rho sugestif dengan
sebuah helikase DNA diperlukan dalam replikasi DNA, DnaB. Keduanya
mengikat nukleat asam dan bergerak sepanjang asam nukleat dengan
konsumsi ATP. Di proses gerakan ini, untai komplementer dapat mengungsi.
Selanjutnya, kedua helicases yang hexameric, dan kedua menghidrolisis
signifikan jumlah ATP ketika di hadapan oligonukleotida beruntai tunggal.
Meskipun terminasi transkripsi dan peraturan biasanya ditentukan
hanya dengan peristiwa yang terjadi di dekat ujung 3 'dari transkrip, kadangkadang ujung 5 'juga terlibat. Transkripsi dalam E. coli dari RNA ribosom dan
beberapa gen fag lambda tergantung setelah memodifikasi kompleks
transkripsi lama setelah polymerase melintasi urutan khusus di dekat
promotor. Pada titik ini beberapa protein mengikat salinan RNA dari urutan
dan mengikat untuk RNA polimerase juga. Setelah modifikasi tersebut,
elongasi akan melanjutkan ke akhir unit transkripsi dan mengabaikan
beberapa peluang untuk terminasi yang akan dimanfaatkan oleh RNA
polimerase tidak dimodifikasi. Ini akan menjadi luar biasa jika sel-sel
eukariotik tidak memanfaatkan ini sebagai mekanisme regulasi gen.
Proses Prokariotik RNA Setelah Sintesis

Hal ini sama sekali tidak mengherankan bahwa transkrip utuh yang
dihasilkan oleh transkripsi beberapa operon tidak selalu cocok untuk semua
biologis peran RNA. Dalam E. coli ribosomal dan t RNA mengikuti transkripsi.
Misalnya, RNAse III membelah pertama dalam bagian-bagian dari rRNA yang
dilipat kembali pada diri mereka sendiri untuk membentuk hairpin (Gambar.
5.8). Kemudian nucleases lain membuat pemotongan tambahan. RNAse III
juga membelah transkrip awal fag T7. Sejumlah kelompok metil juga
ditambahkan ke rRNA setelah sintesis. Bagaimana kita tahu RNAse III
membelah ribosom dan fag T7 RNA? Efek dari mutasi adalah salah satu cara
untuk menunjukkan peran in vivo dari enzim. Penyidik pertama mengisolasi
cacat mutan di RNAse III. Mereka melakukan ini dengan skrining ekstrak
dibuat dari koloni terisolasi dari sel termutasi untuk aktivitas enzim RNAse III
(Gambar. 5.9). Satu dari 1.000 koloni sel menghasilkan dengan tingkat
enzim.