LAPORAN PRAKTIKUM

KIMIA ANALITIK
ACARA
KARAKTERISASI BAHAN ALAM PENGHASIL PIGMENT HIJAU

KELOMPOK
Penanggung jawab:
Ika Nurafni Friliyani (A1M013050)

KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAAN NASIONAL

UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN
FAKULTAS PERTANIAN
PURWOKERTO
2014

I. PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Pigmen merupakan
B. Tujuan
Tujuan dilakukannya praktikum ini adalah untuk karakterisasi bahan alam
penghasil pigment hijau dengan teknik kromatogrfi kertas dan UV-VIS.

II. TINJAUAN PUSTAKA

Istilah kromatografi berasal dari kata latin chroma berarti warna dan graphien
berarti menulis. Kromatografi pertama kali diperkenalkan oleh Michael Tsweet
(1903) seorang ahli botani dari Rusia. Michael Tsweet dalam percobaannya ia
berhasil memisahkan klorofil dan pigmen-pigmen warna lain dalam ekstrak
tumbuhan dengan menggunakan serbuk kalsium karbonat yang diisikan ke dalam
kolom kaca dan petroleum eter sebagai pelarut. Proses pemisahan itu diawali dengan
menempatkan larutan cuplikan pada permukaan atas kalsium karbonat, kemudian
dialirkan pelarut petroleum eter. Hasilnya berupa pita-pita berwarna yang terlihat
sepanjang kolom sebagai hasil pemisahan komponen-komponen dalam ekstrak
tumbuhan (Alimin, 2007, hal: 73).
Kromatografi adalah proses melewatkan sampel melalui suatu kolom,
perbedaan kemampuan adsorpsi terhadap zat-zat yang sangat mirip mempengaruhi
resolusi zat terlarut dan menghasilkan apa yang disebut kromatogram (Khopkar,
2008, hal: 137).
Dalam kromatografi, komponen-komponen terdistribusi dalam dua fase yaitu
fase gerak dan fase diam. Transfer massa antara fase bergerak dan fase diam terjadi
bila molekul-molekul campuran serap pada permukaan partikel-partikel atau terserap.
Pada kromatografi kertas naik, kertasnya digantungkan dari ujung atas lemari
sehingga tercelup di dalam solven di dasar dan solven merangkak ke atas kertas oleh
daya kapilaritas. Pada bentuk turun, kertas dipasang dengan erat dalam sebuah baki
solven di bagian atas lemari dan solven bergerak ke bawah oleh daya kapiler dibantu
dengan gaya gravitasi. Setelah bagian muka solven selesai bergerak hampir sepanjang
kertas, maka pita diambil, dikeringkan dan diteliti. Dalam suatu hal yang berhasil,
solut-solut dari campuran semula akan berpindah tempat sepanjang kertas dengan
kecepatan yang berbeda, untuk membentuk sederet noda-noda yang terpisah. Apabila
senyawa berwarna, tentu saja noda-nodanya dapat terlihat. Distribusi dapat terjadi

antara fase cair yang terserap secara stasioner dan zat alir bergerak yang kontak
secara karib dengan fase cair itu. Dalam kromatografi partisi cairan, fase cair yang
bergerak mengalir melewati fase cair stasioner yang diserapkan pada suatu
pendukung, sedangkan dalam kromatografi lapisan tipis adsorbennya disalutkan pada
lempeng kaca atau lembaran plastik (Kromatografi Kertas, 2010).
Metode pemisahan kromatografi didasarkan pada perbedaan distribusi
molekul-molekul komponen di antara dua fase (fase gerak dan fase diam) yang
kepolarannya berbeda. Apabila molekul-molekul komponen berinteraksi secara lemah
dengan fase diam maka komponen tersebut akan bergerak lebih cepat meninggalkan
fase diam. Keberhasilan pemisahan kromatografi bergantung pada daya interaksi
komponen-komponen campuran dengan fase diam dan fase gerak. Apabila dua atau
lebih komponen memiliki daya interaksi dengan fase diam atau fase gerak yang
hampir sama maka komponen-komponen tersebut sulit dipisahkan (Hendayana,
1994).
Menurut Mulja (1995), berdasarkan asas terjadinya proses pemisahan maka
kromatografi dibedakan menjadi 4, yaitu:
1.

Kromatografi dengan asas adsorpsi

Kromatografi jenis ini menggunakan fasa diam padat dan fasa gerak cair atau
gas. Pemisahan komponen-komponennya akan sangat bergantung pada
perbedaan polaritas molekul-molekul yang akan dipisahkan.

2.

Kromatografi dengan asas partisi

Kromatografi jenis ini memakai fasa diam cair dan fasa gerak cair. Pemisahan
komponen-komponen akan sangat tergantung pada perbedaan Kd (Koefisien
distribusi) molekul-molekul yang dipisahkan.

3.

Kromatografi dengan asas filtrasi

Kromatografi jenis ini memakai fasa padat yang mempunyai sifat filtrasi
terhadap komponen yang mempunyai massa molekul relatif (Mr) yang tinggi dan
fasa padat tersebut dimiliki oleh gel atau sejenisnya sedangkan fasa geraknya

adalah cairan. Kromatografi dengan dasar filtrasi ini sangat dipengaruhi oleh
perbedaan bentuk (struktur dan ukuran molekul).
4.

Kromatografi dengan asas suhu kritik

Pada dasarnya merupakan pengembangan dari kromatografi gas, sebagai fasa
mobil dipakai CO2 dalam keadaan superkritik. Secara teori, pemisahan
kromatografi yang paling baik akan diperoleh jika fase diam mempunyai luas
permukaan sebesar-besarnya sehingga terjadi keseimbangan yang baik antara
fase gerak dan fase diam. Persyaratan kedua agar pemisahan baik adalah fase
gerak bergerak dengan cepat sehingga difusi yang terjadi sekecil-kecilnya. Untuk
memperoleh permukaan fase diam yang luas, maka penyerap atau fase diam
harus berupa serbuk halus. Sedangkan untuk memaksa fase gerak bergerak cepat
melalui fase diam yang berupa serbuk halus, harus digunakan tekanan tinggi.
Persyaratan tersebut menghasilkan teknik high pressure liquid chromatography,
yang

selanjutnya

lebih

dikenal

sebagai high

performance

liquid

chromatography (HPLC) atau kromatografi cair kinerja tinggi.

Menurut Sulistiani (2013), berdasarkan teknik kerja yang digunakan,
kromatografi terbagi atas:
1. Kromatografi kertas
Kromatografi kertas adalah kromatografi yang menggunakan kertas selulosa
murni yang mempunyai afinitas besar terhadap air atau pelarut polar
lainnya.Kromatografi

kertas digunakan

untuk memisahkan

campuran

dari

substansinya menjadi komponen-komponennya.

Prinsip kerja kromatografi kertas
Pelarut bergerak lambat pada kertas, komponen-komponen bergerak pada laju
yang berbeda dan campuran dipisahkan berdasarkan pada perbedaan bercak
warna.
Cara penggunaan kromatografi kertas

Kertas yang digunakan adalah Kertas Whatman No.1.

Sampel diteteskan pada garis dasar kromatografi kertas.

Kertas digantungkan pada wadah yang berisi pelarut dan terjenuhkan oleh uap

pelarut.
Penjenuhan udara dengan uap, menghentikan penguapan pelarut sama halnya

dengan pergerakan pelarut pada kertas.

2. Kromatografi kolom
Kromatografi kolom adalah kromatografi yang menggunakan kolom sebagai
alat untuk memisahkan komponen-komponen dalam campuran.
Prinsip kerja kromatografi kolom
Didasarkan pada absorbsi komponen2 campuran dengan afinitas berbeda
terhadap permukaan fase diam. Absorben bertindak sebagai fase diam dan fase
geraknya adalah cairan yang mengalir membawa komponen campuran sepanjang
kolom. Sampel yang mempunyai afinitas besar terhadap absorben akan secara
selektif tertahan dan afinitasnya paling kecil akan mengikuti aliran pelarut.
Cara penggunaan kromatografi kolom
Sampel yang dilarutkan dalam sedikit pelarut, dituangkan melalui atas kolom dan
dibiarkan mengalir ke dalam adsorben (bahan penyerap).Komponen dalam
sampel diadsorbsi dari larutan secara kuantitatif oleh bahan penyerap berupa pita
sempit pada permukaan atas kolom. Dengan penambahan pelarut secara terus
menerus, masing-masing komponen akan bergerak turun melalui kolom dan akan
terbentuk pita yang setiap zona berisi satu macam komponen. Setiap zona yang
keluar kolom dapat ditampung dengan sempurna sebelum zona yang lain keluar
kolom.
3. Kromatografi lapis tipis
Kromatografi lapis tipis (KLT) adalah cara pemisahan campuran senyawa
menjadi

senyawa

murninya

dan

mengetahui

kuantitasnya

yang

digunakan.Kromatografi lapis tipis dapat digunakan untuk memisahkan senyawasenyawa yang sifatnya hidrofobik seperti lipida-lipida dan hidrokarbon yang
sukar dikerjakan dengan kromatografi kertas.
Prinsip kerja kromatografi lapis tipis

KLT menggunakan sebuah lapis tipis silika atau alumina yang seragam pada
sebuah lempeng gelas atau logam atau plastik yang keras. Jel silika (atau
alumina) merupakan fase diam. Fase gerak merupakan pelarut atau campuran
pelarut yang sesuai. Pelaksanaan ini biasanya dalam pemisahan warna yang
merupakan gabungan dari beberapa zat pewarna.
Cara Penggunaan kromatografi lapis tipis
Pada cara penggunaan KLT hampir sama dengan penggunaan Kromatografi
kertas, hanya saja pada KLT fase diamnya menggunakan plat gelas/ logam/
Aluminium foil sedangkan pada kromatografi kertas menggunakan kertas saring.
4. Kromatografi gas
Kromatografi gas adalah proses pemisahan campuran menjadi komponenkomponennya dengan menggunakan gas sebagai fase bergerak yang melewati
suatu lapisan serapan (sorben) yang diam.
Prinsip kerja kromatografi gas
Gas pembawa (biasanya menggunakan helium, argon / nitrogen) dengan tekanan
tertentun

dialirkan

secara

konstan

melalui

kolom

yang

berisi

fase

diam. Komponen sampel akan terabsorbsi oleh fase diam dengan kecepatan
berbeda.
Cara penggunaan kromatografi gas
Sampel diinjeksikan ke injektor yang suhunya telah diatur. Setelah sampel
menjadi uap, akan dibawa oleh aliran gas pembawa menuju kolom. Sehingga
komponen akan terabsorbsi oleh fase diam sampai terjadi pemisahan.Komponen
yang terpisah menuju detektor akan menghasilkan sinyal listrik yang besarnya
proporsional. Sinyal listrik tersebut akan diperkuat oleh amplifier. Kromatogram
akan dicatat oleh rekorder berupa puncak.
Faktor retardasi (Rf) merupakan parameter karakteristik kromatografi kertas
dan kromatografi lapis tipis. Harga Rf merupakan ukuran kecepatan migrasi suatu
komponen pada kromatogram dan pada kondisi tetap merupakan besaran karakteristik

dan reproduksibel. Rf didefinisikan sebagai perbandingan jarak yang ditempuh

komponen terhadap jarak yang ditempuh pelarut (fase bergerak) (Yasid, 2005).
Susunan serat kertas membentuk medium berpori yang bertindak sebagai
tempat untuk mengalirnya fase gerak. Berbagai macam kertas yang secara komersial
tersedia adalah whatman 1, 2, 31 dan 3 MM, kertas asam asetil, kertas kieselgurh,
kertas silikon dan kertas penukar ion juga digunakan. Tersedia juga kertas selulosa
murni, kertas selulosa yang dimodifikasi dan kertas serat kaca. Zat-zat hidrofobik
dapat dipisahkan pada kedua jenis kertas terakhir ini. Kertas asam asetil atau kertas
silikon dapat digunakan untuk zat-zat hidrofobik, sedangkan untuk reagent yang
korosif, kertas serat kaca dapat digunakan. Untuk memilih kertas, yang menjadi
pertimbangan adalah tingkat dan kesempurnaan pemisahan, difusivitas pembentukan
spot, efek tailing dan pembentukan komet serta laju pergerakan pelarut terutama
untuk teknik descending (Khopkar, 2008, hal: 161 162).
Prinsip dari kromatografi kertas yaitu berdasarkan perbedaan koefisien dari
zat-zat terhadap dua fase tetapi sebagai pendukung disini adalah kertas saring yang
sifatnya kapiler. Pelarut yang sering digunakan ialah pelarut yang cepat menyerap
sehingga akan naik lebih cepat. Metode kromatografi kertas ini digunakan karena
peralatan yang dipakai tidak perlu alat-alat yang teliti dan mahal. Dimana hasil-hasil
yang lain dapat diperoleh dengan peralatan dan materi-materi yang sangat sederhana.
Jadi dengan metode kromatografi kertas kita sudah dapat melakukan percobaan
dengan hasil yang baik.

III.

METODE PRAKTIKUM
A. Alat dan Bahan

Alat :

TLC sheet

Spectrometer

Erlenmeyer

Gelas arloji

Blender

Kain saring

Lampu UV

Bahan :

Daun Ketapang
Wortel
Daun Leunca
Pelarut air dan aseton
B. Prosedur Kerja

1. Ekstraksi bahan

2. Karakterisasi dengan metoda kromatografi

3. Karakterisasi dengan spectrometer UV-VIS

IV.

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil Pengamatan

Kromatografi degan Pelarut aseton

N
O
1
2
3

Sampel

Solvent

T. sampel

T.solvent

Rf

Daun Ketapang (1)

Daun Ketapang (2)
B. Leunca (1)
B. Leunca (2)
Wortel

Aseton
Aseton
Aseton
Aseton
Aseton

1.5
4.3
2.0
4.5
4.2

5.4
5.4
5.4
5.4
5.4

0.278
0.796
0.370
0.830
0.780

B. Pembahasan

V. PENUTUP
A. Kesimpulan
B. Saran
.

DAFTAR PUSTAKA

LAMPIRAN