TUGAS KIMIA ANALITIK

Hight performance liquid chromatography (HPLC) dan

gas Kromatografi (GC)

Oleh:

Kelompok VII
Afrianti Ramadhani
Dekna Aswita
Gusnilawati
Reviana ervita
Rezki Pratama

JURUSAN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS NEGERI PADANG
2010

KROMATOGRAFI
A. Pendahuluan
Kromatografi adalah suatu metode pemisahan fisik, dimana komponenkomponen yang dipisahkan didistribusikan diantara dua fasa, salah satu fasa fasa
tersebut adalah suatu lapisan stasioner dengan permukaan yang luas, yang lainnya
sebagai fluida yang mengalir lembut di sepanjang landasan stasioner.
Fasa stasioner bisa berupa padatan maupum cairan, sedangkan fasa bergerak
bisa berupa cairan maupun gas. Jadi semua jenis kromatografi yang diketahui
diorganisir jadi satu dalam empat kategori yang ditunjukakan dalam tabel sebagai
berikut:
Fasa stasioner
Fasa bergerak
Contoh-contoh

padat
Cair
gas
Kromatografi Kromatografi
asli
gas-padat,
Tswett,dengan atau GSC
larutan
petroleumeter
dan
kolom
CaCO3,

Cair
cair
Gas
Kromatograf Kromatogra
i partisi pada fi gas-cair
kolom silika atau GLC
gel
Kromatograf
i kertas

Kromatografi
pertukaran ion
Seluruh bentuk kromatografi terdiri dari fase diam dan fase gerak. Dalam
seluruh bentuk kromatografi yang lain, anda akan menemui fase gerak adalah cairan.
Dalam kromatografi gas-cair, fase gerak adalah gas seperti helium dan fase diam
adalah cairan yang mempunyai titik didih yang tinggi diserap pada padatan.
Bagaimana kecepatan suatu senyawa tertentu bergerak melalui mesin, akan
tergantung pada seberapa lama waktu yang dihabiskan untuk bergerak dengan gas dan
sebaliknya melekat pada cairan dengan jalan yang sama.
Dalam semua teknik kromatografi, zat-zat terlaryt yang dipisahkan bermigrasi
sepanjang kolom (seperti dalam kromatografi kertas atau lapisan tipis, ekivalen fisik
kolom), dasar pemisahan terletak dalam laju perpindahan yang berbeda untuk larutan
berbeda. Laju perpindahan sebuah zat terlarut sebagai hasil dari dua faktor, yang satu
cenderung menggerakkan zat terlarut itu, dan yang lain menahannya. Perbedaan kecil
antara dua zat terlarut dalam kekuatan adsorbsi dan dalam interaksinya dalam pelarut

yang bergerak menjadi dasar pemisahan bila zat molekul-molekul zat terlarut itu
berulangkali menyebar diantara dua fasa keseluruh panjang kolom. Ada beberapa cara
untuk mengklasifikasi teknik kromatografi didasarkan atas tipe penamaan dari fasa
(fasa tetap dan fasa bergerak) seperti gas-cairan(GLC), gas-padat (GSC), cairancairan(LLC), dan cairan-padat(LSC). Klasifikasi lain didasarkan pada teknik
penggunaan contohnya.
Teori kromatografi didasarkan pada kesetimbangn distribusi sampel antara
fasa yang ditetapkan oleh konstanta kesetimbangan K, disebut dengan koefisien
distribusi. Rata-rata konsentrasi mengikuti hukum distribusi :

Dimana Cs adalah konsentrasi fasa stasioner dan Cm konsentrasi fasa bergerak.

Laju rata-rata perpindahan molekul ditentukan oleh :
1. Kecepatan molekul pembawa
2. Perbandingan volume fasa stasioner dengan fasa bergerak
3. Koefisien distribusu dari zat terlarut

1. Kromatografi Gas
Kromatografi gas-cair (GLC), atau kromatografi gas (GC), merupakan jenis
kromatografi yang digunakan dalam kimia organik untuk pemisahan dan analisis. GC
dapat digunakan untuk menguji kemurnian dari bahan tertentu, atau memisahkan
berbagai komponen dari campuran. Dalam beberapa situasi, GC dapat membantu
dalam mengidentifikasi sebuah kompleks.
Dalam kromatografi gas, fase yang bergerak (atau "mobile phase") adalah
sebuah operator gas, yang biasanya gas murni seperti helium atau yang tidak reactive
seperti gas nitrogen. Stationary atau fasa diam merupakan tahap mikroskopis lapisan
cair atau polimer yang mendukung gas murni, di dalam bagian dari sistem pipa-pipa
kaca atau logam yang disebut kolom. Instrumen yang digunakan untuk melakukan
kromatografi gas disebut gas chromatograph (atau "aerograph", "gas pemisah").

senyawa gas yang sedang dianalisis berinteraksi dengan dinding kolom yang
dilapisi dengan berbagai tahapan stationary. Ini menyebabkan setiap kompleks ke
elute di waktu yang berbeda, yang dikenal sebagai ingatan waktu yang kompleks.
Perbandingan dari ingatan kali yang memberikan kegunaan analisis GC-nya.
Kromatografi gas yang pada prinsipnya sama dengan kromatografi kolom
(serta yang lainnya bentuk kromatografi, seperti HPLC, TLC), tapi memiliki beberapa
perbedaan penting. Pertama, proses memisahkan compounds dalam campuran
dilakukan antara stationary fase cair dan gas fase bergerak, sedangkan pada
kromatografi kolom yang seimbang adalah tahap yang solid dan bergerak adalah fase
cair. (Jadi, nama lengkap prosedur adalah "kromatografi gas-cair", merujuk ke ponsel
dan stationary tahapan, masing-masing.) Kedua, melalui kolom yang lolos tahap gas
terletak di sebuah oven dimana temperatur gas yang dapat dikontrol, sedangkan
kromatografi kolom (biasanya) tidak memiliki kontrol seperti suhu. Ketiga,
konsentrasi yang majemuk dalam fase gas adalah hanya salah satu fungsi dari tekanan
uap dari gas.
Kromatografi gas juga mirip dengan pecahan penyulingan, karena kedua
proses memisahkan komponen dari campuran terutama berdasarkan titik didih (atau
tekanan uap) perbedaan. Namun, pecahan penyulingan biasanya digunakan untuk
memisahkan komponen campuran pada skala besar, sedangkan GC dapat digunakan
pada skala yang lebih kecil (yakni microscale).
Kromatografi gas terkadang juga dikenal sebagai uap-tahap kromatografi
(VPC), atau gas-cair kromatografi partisi (GLPC). Alternatif nama ini, serta masingmasing singkatan, sering ditemukan dalam literatur ilmiah.
Diagram alir kromatografi gas-cair

Mekanisme kerja GC
Injeksi sampel
Sejumlah kecil sampel yang akan dianalisis diinjeksikan pada mesin
menggunakan semprit kecil. Jarum semprit menembus lempengan karet tebal
(Lempengan karet ini disebut septum) yang mana akan mengubah bentuknya kembali
secara otomatis ketika semprit ditarik keluar dari lempengan karet tersebut.
Injektor berada dalam oven yang mana temperaturnya dapat dikontrol. Oven
tersebut cukup panas sehingga sampel dapat mendidih dan diangkut ke kolom oleh
gas pembawa misalnya helium atau gas lainnya.
Ada dua tipe utama kolom dalam kromatografi gas-cair. Tipe pertama, tube
panjang dan tipis berisi material padatan; Tipe kedua, lebih tipis dan memiliki fase
diam yang berikatan dengan pada bagian terdalam permukaannya.
Kolom biasanya dibuat dari baja tak berkarat dengan panjang antara 1 sampai
4 meter, dengan diameter internal sampai 4 mm. Kolom digulung sehingga dapat
disesuakan dengan oven yang terkontrol secara termostatis.Kolom dipadatkan dengan
tanah diatomae, yang merupakan batu yang sangat berpori. Tanah ini dilapisis dengan
cairan bertitik didih tinggi, biasanya polimer lilin.
Komponen dalam kromatografi gas :
1. Gas pembawa dan pemasukan sampel
Fase bergerak dalam kromatografi ini adalah gas, yang paling lazim adalah
helium, hidrogen, atau nitrogen. Kompenen pilihan gas spembawa
terutama tergantung pada karakteristik detektor. Kromatografi gas
komersial biasanya menyediakan katup pengatur tambahan untuk
pengendalian tekanan yang baik pada inlet kolom. Dekat inlet kolom ada
suatu alat dimana sampel-sampel dapat dimasuukan kedalam aliran gas

pembawa. Sampel-sampel tersebut bisa berupa gas atau cairan yang mudah
menguap. Lubang injeksi dipanaskan agar sampel cair teruapkan dengan
cepat.
2. Kolom
Aliran gas selanjutnya menemui kolom yang diletakkan dalam oven
bertemperatur konstan. Ini adalah jantung instrumen tesebut, tempat
dimana proses kromartgrafi dasar berlangsung. Kolom memilki variasi
dalam hal ukuran dan bahan isian. Tabung diisi dengan bahan padat halus
dengan luas permukaan besar yang relatif inert. Padatan iitu sebenarnya
hanya sebuah penyangga mekanik untuk cairan, sebelum diisi kedalam
kolom, padatan tersebut diimpregnasi dengan cairan yang diinginkan yang
berpareran sebagai fasa stasioner sesungguhnya. Cairan ini harus stabil dan
nonfolatil pada temperatur kolom,

pemisahan dan harus sesuai untuk

pemisahan tertentu.
3. Detektor
Setelah muncul dari kolom itu, aliran gas lewat melalui sis lain detektor.
Maka elusi zat terlarut dari kolom itu mengatur ketidakseimbangan
antaradua sisi detektor yang direkam secara elektrik. Laju aliran gas
pembawa adalah hal yang sangat penting, dan biasanya pengukur aliran
untuk itu tersedia. Secara normal gas-gas yang muncul dialirkan keluar
pada tekanan atmosfir. Karena pekerja laboratorium secara terus menerus
terpapar oleh uap senyawa-senyawa yang terkromatogafi yang mungkin
tak baik walaupun kadarnya biasanya kecil maka ventilasi pada keluaran
instrumen harus diperhatikan. Ketentuan bisa dibuat untuk menjebak zat
terlarut yang dipisahkan setelah muncul dari kolom jika hal ini dibutuhkan
untuk penyelidikan lebih lanjut.
Penerapan kromatografi gas
1. Untuk identifikasi senyawa
Dengan suatu kolom tertentu dan dengan semua fariabelnya seperti
temperatur dan laju alir, dikendalikan secara cermat, waktu retensi atau
volume retensi suatu zat terlarut merupakan suatu besaran dari zat terlarut
tersebut, seperti halnya titk didih atau halnya indek bias adalah besaran. Ini

menunjukkan bahwa sifat retensi dapat digunakan untuk mengetahui suatu

senyawa.
2. Analisis kuantitatif
Dengan GC tergantung pada hubungan antara jumlah suatu zat terlarut dan
ukuran dari pita elusi yang dihasilkan. Secara umum dengan detektor
diferensial, ukuran jumlah zat terlarut yang paling baik adalah luas
dibawah pita elusi. Jumlah zat terlarut = faktor kalibrasi x luas dibawah
pita elusi.
Keterbasan GC adalah volatilitas sampel itu harus mempunyai tekanan uap
yang cukup pada temperatur kolom tersebut, dan ini segera menghilangkan banyak
jenis sampel. Suatu perhitungan yang aktual tidak mungkin dilakukan tetapi harus
diperkirakan bahwa sekitar 20% senyawa kimia yang diketahui kurang cukup
volatil.kebanyakan sampel organik tidak cukup volatil untuk memungkinkan
penerapan langsung dari GC.

Temperatur kolom
Temperatur kolom dapat bervariasi antara 50 oC sampai 250 oC. Temperatur
kolom lebih rendah daripada gerbang injeksi pada oven, sehingga beberapa komponen
campuran dapat berkondensasi pada awal kolom. Kolom memulai pada temperatur
rendah dan kemudian terus menerus menjadi lebih panas dibawah pengawasan
komputer saat analisis berlangsung.
Proses pemisahan pada kolom
Ada tiga hal yang dapat berlangsung pada molekul tertentu dalam campuran
yang diinjeksikan pada kolom:
Molekul dapat berkondensasi pada fase diam.
Molekul dapat larut dalam cairan pada permukaan fase diam
Molekul dapat tetap pada fase gas
Dari ketiga kemungkinan itu, tak satupun yang bersifat permanen.Senyawa yang
mempunyai titik didih yang lebih tinggi dari temperatur kolom secara jelas cenderung

akan berkondensasi pada bagian awal kolom. Namun, beberapa bagian dari senyawa
tersebut akan menguap kembali dengan dengan jalan yang sama seperti air yang
menguap saat udara panas, meskipun temperatur dibawah 100 0C. Peluangnya akan
berkondensasi lebih sedikit selama berada didalam kolom.
Sama halnya untuk beberapa molekul dapat larut dalam fase diam cair. Beberapa
senyawa akan lebih mudah larut dalam cairan dibanding yang lainnya. Senyawa yang
lebih mudah larut akan menghabiskan waktunya untuk diserap pada fase diam:
sedangkan senyawa yang suka larut akan menghabiskan waktunya lebih banyak
dalam fase gas.
Proses dimana zat membagi dirinya menjadi dua pelarut yang tidak
bercampurkan karena perbedaan kelarutan, dimana kelarutan dalam satu pelarut satu
lebih mudah dibanding dengan pelarut lainnya disebut sebagai partisi. Sekarang, anda
bisa beralasan untuk memperdebatkan bahwa gas seperti helium tidak dapat
dijelaskan sebagai pelarut. Tetapi, istilah partisi masih dapat digunakan dalam
kromatografi gas-cair.
Substansi antara fase diam cair dan gas. Beberapa molekul dalam substansi
menghabiskan waktu untuk larut dalam cairan dan beberapa lainnya menghabiskan
waktu untuk bergerak bersama-sama dengan gas.
Waktu retensi
Waktu yang digunakan oleh senyawa tertentu untuk bergerak melalui kolom
menuju ke detektor disebut sebagi waktu retensi. Waktu ini diukur berdasarkan waktu
dari saat sampel diinjeksikan pada titik dimana tampilan menunujukkan tinggi puncak
maksimum untuk senyawa itu.
Setiap senyawa memiliki waktu retensi yang berbeda. Untuk senyawa tertentu,
waktu retensi sangat bervariasi dan bergantung pada: Titik didih senyawa. Senyawa
yang mendidih pada temperatur yang lebih tinggi daripada temperatur kolom, akan
menghabiskan hampir seluruh waktunya untuk berkondensasi sebagai cairan pada
awal kolom. Dengan demikian, titik didih yang tinggi akan memiliki waktu retensi
yang lama.
Kelarutan dalam fase cair. Senyawa yang lebih mudah larut dalam fase cair,
akan mempunyai waktu lebih singkat untuk dibawa oleh gas pembawa.. Kelarutan
yang tinggi dalam fase cair berarti memiiki waktu retensi yang lama.
Temperatur kolom. Temperatur tinggi menyebakan pergerakan molekulmolekul dalam fase gas; baik karena molekul-molekul lebih mudah menguap, atau

karena energi atraksi yang tinggi cairan dan oleh karena itu tidak lama tertambatkan.
Temperatur kolom yang tinggi mempersingkat waktu retensi untuk segala sesuatunya
di dalam kolom.
Untuk memberikan sampel dan kolom, tidak ada banyak yang bisa dikerjakan
menggunakan titik didih senyawa atau kelarutannya dalam fase cair, tetapi anda dapat
mempunyai pengatur temperatur.
Semakin rendah temperatur kolom semakin baik pemisahan yang akan anda
dapatkan, tetapi akan memakan waktu yang lama untuk mendapatkan senyawa karena
kondensasi yang lama pada bagian awal kolom.
Dengan kata lain, menggunakan temperatur tinggi, segala sesuatunya akan
melalui kolom lebih cepat, tetapi pemisihannya kurang baik. Jika segala sesuatunya
melalui kolom dalam waktu yang sangat singkat, tidak akan terdapat jarak antara
puncak-puncak dalam kromatogram.
Jawabannya dimulai dengan kolom dengan suhu yang rendah kemudian
perlahan-lahan secara teratur temperaturnya dinaikkan.
Pada awalnya, senyawa yang menghabiskan lebih banyak waktunya dalam fase gas
akan melalui kolom secara cepat dan dapat dideteksi. Dengan adanya sedikit
pertambahan temperatur akan memperjelas perlekatan senyawa. Peningkatan
temperatur masih dapat lebih `melekatan` molekul-molekul fase diam melalui kolom.
Detektor
Ada beberapa tipe detektor yang biasa digunakan. Detektor ionisasi nyala
dijelaskan pada bagian bawah penjelasan ini, merupakan detektor yang umum dan
lebih mudah untuk dijelaskan daripada detektor alternatif lainnya.
Detektor ionisasi nyala

Dalam mekanisme reaksi, pembakaran senyawa organik merupakan hal yang

sangat kompleks. Selama proses, sejumlah ion-ion dan elektron-elektron dihasilkan
dalam nyala. Kehadiran ion dan elektron dapat dideteksi.
Seluruh detektor ditutup dalam oven yang lebih panas dibanding dengan
temperatur kolom. Hal itu menghentikan kondensasi dalam detektor.
Jika tidak terdapat senyawa organik datang dari kolom, anda hanya memiliki nyala
hidrogen yang terbakar dalam air. Sekarang, anggaplah bahwa satu senyawa dalam
campuran anda analisa mulai masuk ke dalam detektor.
Ketika dibakar, itu akan menghasilkan sejumlah ion-ion dan elektron-elektron
dalam nyala. Ion positif akan beratraksi pada katoda silinder. Ion-ion negatif dan
elektron-elektron akan beratraksi pancarannya masing-masing yang mana merupakan
anoda.Hal ini serupa dengan apa yang terjadi selama elektrolisis normal.
Pada katoda, ion positif akan mendatangi elektron-elektron dari katoda dan
menjadi netral. Pada anoda, beberapa elektron dalam nyala akan dipindahkan pada
elektroda positif; ion-ion negatif akan memberikan elektron-elektronnya pada
elektroda dan menjadi netral.
Kehilangam elektron-elektron dari satu elektroda dan perolehan dari elektroda
lain, akan menghasilkan aliran elektron-elektron dalam sirkuit eksternal dari anoda ke
katoda. Dengan kata lain, anda akan memperoleh arus listrik.

Arus yang diperoleh tidak besar, tetapi dapat diperkuat. Jika senyawa-senyawa
organik lebih banyak dalam nyala, maka akan banyak juga dihasilkan ion-ion, dan
dengan demikian akan terjadi arus listrik yang lebih kuat. Ini adalah pendekatan yang
beralasan, khususnya jka anda berbicara tentang senyawa-senyawa yang serupa, arus
yang anda ukur sebanding dengan jumlah senyawa dalam nyala.
Kekurangan utama dari detektor ini adalah pengrusakan setiap hasil yang
keluar dari kolom sebagaimana yang terdeteksi. Jika anda akan mengrimkan hasil ke
spektrometer massa, misalnya untuk analisa lanjut, anda tidak dapat menggunakan
detektor tipe ini.
Penerjemahan hasil dari detektor
Hasil akan direkam sebagai urutan puncak-puncak; setiap puncak mewakili
satu senyawa dalam campuran yang melalui detektor. Sepanjang anda mengontrol
secara hati-hati kondisi dalam kolom, anda dapat menggunakan waktu retensi untuk
membantu mengidentifikasi senyawa yang tampak-tentu saja anda atau seseorang lain
telah menganalisa senyawa murni dari berbagai senyawa pada kondisi yang sama.

Area dibawah puncak sebanding dengan jumlah setiap senyawa yang telah
melewati detektor, dan area ini dapat dihitung secara otomatis melalui komputer yang
dihubungkan dengan monitor. Area yang akan diukur tampak sebagai bagian yang
berwarna hijau dalam gambar yang disederhanakan.
Perlu dicatat bahwa tinggi puncak tidak merupakan masalah, tetapi total area
dibawah puncak. Dalam beberapa contoh tertentu, bagian kiri gambar adalah puncak
tertinggi dan memiliki area yang paling luas. Hal ini tidak selalu merupakan hal
seharusnya..

Mungkin saja sejumlah besar satu senyawa dapat tampak, tetapi dapat terbukti
dari kolom dalam jumlah relatif sedikit melalui jumlah yang lama. Pengukuran area
selain tinggi puncak dapat dipergunakan dalam hal ini.
Perangkaian kromatogram gas pada spektrometer massa
Hal ini tidak dapat dillakukan menggunakan detektor ionisasi nyala, karena
detektor dapat merusak senyawa yang melaluinya. Anggaplah anda menggunakan
detektor yang tidak merusak. Senyawa,
Ketika detektor menunjukkan puncak, beberapa diantaranya melalui detektor
dan pada waktu itu dapat dibelokkan pada spektrometer massa. Hal ini akan
memberikan pola fragmentasi yang dapat dibandingkan dengan data dasar senyawa
yang telah diketahui sebelumnya pada komputer. Itu berarti bahwa identitas senyawasenyawa dalam jumlah besar dapat dihasilkan tanpa harus mengetahui waktu
retensinya.
2. HPLC( Hight Performance Liquid Chromatography)
HPLC secara mendasar merupakan perkembangan tingkat tinggi dari
kromatografi kolom. Selain dari pelarut yang menetes melalui kolom dibawah
grafitasi, didukung melalui tekanan tinggi sampai dengan 400 atm. Ini membuatnya
lebih cepat.
HPLC memperbolehkan penggunaan partikel yang berukuran sangat kecil
untuk material terpadatkan dalam kolom yang mana akan memberi luas permukaan
yang lebih besar berinteraksi antara fase diam dan molekul-molekul yang
melintasinya. Hal ini memungkinkan pemisahan yang lebih baik dari komponenkomponen dalam campuran.
Perkembangan

yang

lebih

luas

melalui

kromatografi

kolom

mempertimbangkan metode pendeteksian yang dapat digunakan. Metode-metode ini

sangat otomatis dan sangat peka.
Ada dua fase HPLC:
Fase normal HPLC
Kolom diisi dengan partikel silika yang sangat kecil dan pelarut non polar
misalnya heksan. Sebuah kolom sederhana memiliki diameter internal 4.6 mm (dan
mungkin kurang dari nilai ini) dengan panjang 150 sampai 250 mm.

Senyawa-senyawa polar dalam campuran melalui kolom akan melekat lebih

lama pada silika yang polar dibanding degan senyawa-senyawa non polar. Oleh
karena itu, senyawa yang non polar kemudian akan lebih cepat melewati kolom.
Fase balik HPLC
Dalam kasus ini, ukuran kolom sama, tetapi silika dimodifikasi menjadi non
polar melalui pelekatan rantai-rantai hidrokarbon panjang pada permukaannya secara
sederhana baik berupa atom karbon 8 atau 18. Sebagai contoh, pelarut polar
digunakan berupa campuran air dan alkohol seperti metanol.
Dalam kasus ini, akan terdapat atraksi yang kuat antara pelarut polar dan
molekul polar dalam campuran yang melalui kolom. Atraksi yang terjadi tidak akan
sekuat atraksi antara rantai-rantai hidrokarbon yang berlekatan pada silika (fase diam)
dan molekul-molekul polar dalam larutan. Oleh karena itu, molekul-molekul polar
dalam campuran akan menghabiskan waktunya untuk bergerak bersama dengan
pelarut.
Senyawa-senyawa non polar dalam campuran akan cenderung membentuk
atraksi dengan gugus hidrokarbon karena adanya dispersi gaya van der Waals.
Senyawa-senyawa ini juga akan kurang larut dalam pelarut karena membutuhkan
pemutusan ikatan hydrogen sebagaimana halnya senyawa-senyawa tersebut berada
dalam molekul-molekul air atau metanol misalnya. Oleh karenanya, senyawasenyawa ini akan menghabiskan waktu dalam larutan dan akan bergerak lambat dalam
kolom.Ini berarti bahwa molekul-molekul polar akan bergerak lebih cepat melalui
kolom. Fase balik HPLC adalah bentuk yang biasa digunakan dalam HPLC.Melihat
seluruh proses

Diagram alir HPLC

Injeksi sampel
Injeksi sample seluruhnya otomatis dan anda tidak akan mengharapkan
bagaimana mengetahui apa yang terjadi pada tingkat dasar. Karena proses ini meliputi
tekanan,

tidak

sama

halnya

dengan

kromatografi

gas

(jika

anda

telah

mempelajarinya).
Waktu retensi
Waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju
detektor disebut sebagai waktu retensi. Waktu retensi diukur berdasarkan waktu
dimana sampel diinjeksikan sampai sampel menunjukkan ketinggian puncak yang
maksimum dari senyawa itu.
Senyawa-senyawa yang berbeda memiliki waktu retensi yang berbeda. Untuk
beberapa senyawa, waktu retensi akan sangat bervariasi dan bergantung pada:

Tekanan yang digunakan (karena itu akan berpengaruh pada laju alir dari
pelarut)

Kondisi dari fase diam (tidak hanya terbuat dari material apa, tetapi juga pada
ukuran

partikel)

Komposisi yang tepat dari pelarut

Temperatur pada kolom

Itu berarti bahwa kondisi harus dikontrol secara hati-hati, jika anda menggunakan
waktu retensi sebagai sarana untuk mengidentifikasi senyawa-senyawa.
Detektor

Ada beberapa cara untuk mendeteksi substansi yang telah melewati kolom.
Metode umum yang mudah dipakai untuk menjelaskan yaitu penggunaan serapan
ultra-violet.
Banyak senyawa-senyawa organik menyerap sinar UV dari beberapa panjang
gelombang. Jika anda menyinarkan sinar UV pada larutan yang keluar melalui kolom
dan sebuah detektor pada sisi yang berlawanan, anda akan mendapatkan pembacaan
langsung berapa besar sinar yang diserap.

Jumlah cahaya yang diserap akan bergantung pada jumlah senyawa tertentu
yang melewati melalui berkas pada waktu itu. Anda akan heran mengapa pelarut yang
digunakan tidak mengabsorbsi sinar UV. Pelarut menyerapnya! Tetapi berbeda,
senyawa-senyawa akan menyerap dengan sangat kuat bagian-bagian yang berbeda
dari specktrum UV.
Misalnya, metanol, menyerap pada panjang gelombang dibawah 205 nm dan
air pada gelombang dibawah 190 nm. Jika anda menggunakan campuran metanol-air
sebagai pelarut, anda sebaiknya menggunakan panjang gelombang yang lebih besar
dari 205 nm untuk mencegah pembacaan yang salah dari pelarut.
Interpretasi output dari detektor
Output akan direkam sebagai rangkaian puncak-puncak, dimana masingmasing puncak mewakili satu senyawa dalam campuran yang melalui detektor dan
menerap sinar UV. Sepanjang anda mengontrol kondisi kolom, anda dapat
menggunakan waktu retensi untuk membantu mengidentifikasi senyawa yang
diperoleh, tentunya, anda (atau orang lain) sudah mengukur senyawa-senyawa
murninya dari berbagai senyawa pada kondisi yang sama.

Anda juga dapat menggunakan puncak sebagai jalan untuk mengukur

kuantitas dari senyawa yang dihasilkan. Mari beranggapan bahwa tertarik dalam
senyawa tertentu, X.
Jika anda menginjeksi suatu larutan yang mengandung senyawa murni X yang
telah diketahui jumlahnya pada instrumen, anda tidak hanya dapat merekam waktu
retensi dari senyawa tersebut, tetapi anda juga dapat menghubungkan jumlah dari
senyawa X dengan puncak dari senyawa yang dihasilkan.

Area yang berada dibawah puncak sebanding dengan jumlah X yang melalui
detektor, dan area ini dapat dihitung secara otomatis melalui layar komputer. Area
dihitung sebagai bagian yang berwarna hijau dalam gambar (sangat sederhana).
Jika larutan X kurang pekat, area dibawah puncak akan berkurang meskipun
waktu retensi akan sama. Misalnya,

Ini berarti dimungkinkan mengkalibrasi instrumen sehingga dapat digunakan

untuk mengetahu berapa jumlah substansi yang dihasilkan meskipun dalam jumlah
kecil.
Meskipun demikian, harus berhati-hati. Jika anda mempunyai dua substansi
yang berbeda dalam sebuah campuran (X dan Y), dapatkah anda mengatakan jumlah
relatifnya? Anda tidak dapat mengatakannya jika anda menggunakan serapan UV
sebagai metode pendeteksinya.
Dalam gambar, area di bawah puncak Y lebih kecil dibanding dengan area
dibawah puncak X. Ini mungkin disebabkan oleh karena Y lebih sedikit dari X, tetapi
dapat sama karena Y mengabsorbsi sinar UV pada panjang gelombang lebih sedikit

dibanding dengan X. Ini mungkin ada jumlah besar Y yang tampak, tetapi jika diserap
lemah, ini akan hanya memberikan puncak yang kecil.

An HPLC. From left to right: A pumping device generating a gradient of two different
solvents, a steel enforced column and an apparatus for measuring the absorbance.

Picture of an HPLC instrument

Gambar peralatan HPLC

DAFTAR PUSTAKA
R.A.Day dan Underwood.2002. Analisis kimia kuantitatif. Jakarta: Erlangga
Pecsok and LD Shields.1976. Modern Methods of Chemical Analysis.USA
www.wikipedia.org , diakses 1 maret 2010
Http://www.edu2000.org/portal/index. diakses 1 maret 2010
http://www.oc-praktikum.de/id/arKromatografi (HPLC).diakses 10 maret

2010

http://www.chem-is-try.org/materi_kimia/instrumen_analisis/kromat.diakses 10
maret 2010