MIKROBIOLOGI LINGKUNGAN

TL 2203
TEKNIK DASAR LABORATORIUM UNTUK ISOLASI, PEMURNIAN DAN
KARAKTERISTIK BENTUK KOLONI
Nama/NIM

: Tania Alpiani 15312030

Kezhia Theresia 15312032
Riama Maduma C 15312042

Kelompok/Shift

: Rabu Siang/10

Tanggal Praktikum

: Rabu, 29 Januari 2014

Tanggal Pengumpulan: Rabu, 5 Februari 2014

PJ Asisten

: Ulfi Muliane,S.T.

Asisten

: Amalia Rizki Rahmani,S.Si.

Teknisi

: Oleh

PROGRAM STUDI TEKNIK LINGKUNGAN

FAKULTAS TEKNIK SIPIL DAN LINGKUNGAN
INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG
2014

MODUL II
MIKROSKOP
Percobaan 4 : Pengamatan morfologi sel dengan mikroskop cahaya
I.

Tujuan
1. Mengetahui teori prinsip dan bagian-bagian komponen mikroskop cahaya
2. Mengetahui cara penggunaan praktis mikroskop cahaya untuk melihat
morfologi sel preparat mikroorganisme

II.

Prinsip
Mikroorganisme adalah organisme yang berukuran sangat kecil sehingga
untuk mengamatinya diperlukan alat bantuan. Mikroorganisme disebut juga
organisme mikroskopik. Mikroorganisme seringkali bersel tunggal (uniseluler)
maupun bersel banyak (multiseluler). Mikroskop merupakan alat untuk dapat

III.

melihat mikroorganisme.
Teori Dasar
Mikroskop terdiri atas bagian optik dan non optik. Bagian optik yaitu: kondensor,

lensa objektif, dan lensa okuler. Sedangkan bagian nonoptik yaitu: kaki dan lengan
mikroskop, diafragma, meja objek/meja preparat, pemutar halus dan kasar, penjepit
kaca objek (preparat), dan sumber cahaya.
Cara menggunakan mikroskop adalah sebagai berikut:
1. Keluarkan mikroskop dari dalam kotaknya lalu periksa kelengkapan bagian
alatnya. Bersihkan mikroskop. Nyalakan lampu sebagai sumber cahaya lalu atur
lensa supaya susunannya lurus dengan lubang yang ada pada meja mikroskop,
buka diafragma sehingga cahaya yang masuk maksimum.
2. Letakkan objek berupa preparat pada meja mikroskop lalu jepitkan. Pilih lensa
objektif dengan perbesaran lensa paling lemah. Carilah obyek sehingga terlihat
jelas dengan bantuan pemutar fokus halus dan kasar. Setelah obyek terlihat jelas
gantilah lensa obyektik dengan lensa yang memiliki perbesaran lebih tinggi.
3. Apabila menggunakan perbesara 100x maka harus digunakan minyak imersi.
Minyak imersi dipakai apabila obyek telah terlihat jelas pada perbesaran 40x,
teteskan minyak imersi pada obyek yang akan diamati.
4. Bila pengamatan telah selesai, bersihkan minyak imersi dengan menggunakan
kapas yang telah diberi xylol.

5. Setelah pengamatan selesai, bersihkan mikroskop. Letakkan lensa obyektif

dengan perbesaran paling lemah tepat di atas lubang meja mikroskop. Turunkan
meja mikroskop dan kondensor. Masukkan kembali mikroskop ke dalam
kotaknya.

MODUL III
PEWARNAAN

Percobaan 5 : Pewarnaan Sederhana

I.

Tujuan
Mengamati dan membedakan bentuk-bentuk morfologi dan susunan
atau rangkaian sel-sel bakteri.

II.

Prinsip
Bentuk morfologi dan susunan sel-sel bakteri akan teramati dengan menggunakan

mikroskop. Pada pewarnaan basa digunakan reagen methylen blue (1-2 menit), kristal
violet (30-60 detik), dan karbol fuchsin (10-30 detik), sedangkan pewarnaan asam
digunakan nigrosin atau tinta cina. Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya
ikatan ion antara komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna
yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada
komponen seluler maupun pada pewarna.
III.

Teori
Bakteri akan terwarna oleh satu jenis pewarna. Berdasarkan adanya muatan maka

dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna basa. Pewarna asam dapat tejadi karena
bila senyawa pewarna bermuatan negatif. Dalam kondisi pH mendekati netral dinding

sel bakteri cenderung bermuatan negatif, sehingga pewarna asam yang bermuatan
negatif akan ditolak oleh dinding sel, maka sel tidak berwarna. Pewarnaan basa yang
bermuatan positif akan mewarnai dinding sel bakteri yang bermuatan negatif. Pewarna
asam yang bermuatan negatif akan ditolak oleh dinding sel yang bermuatan negatif
sehingga sel yang tidak terlihat menjadi berwarna. Pewarna basa yang paling umum
adalah metilen biru, kristal violet, dan karbol fuchsin. Pewarna asam yang sering
digunakan adalah larutan nigrosin dan tinta cina. Bakteri hidup sulit untuk dilihat
dengan mikroskop cahaya terang biasa karena bakteri itu tampak tidak berwarna jika
diamati secara sendiri, walaupun biakannya secara keseluruhan mungkin berwarna.
Bakteri sering diamati dalam keadaan olesan terwarnai daripada dalam keadaan hidup.
Yang dimaksud dengan bakteri terwarnai adalah oganisme yang telah diwarnai dengan
zat pewarna kimia agar mudah dilihat dan dipelajari. Sel-sel mikroorganisme yang
tidak diwarnai umumnya tampak hampir tembus pandang (transparan) bila diamati
dengan mikroskop cahaya biasa hingga sukar dilihat karena sitoplasma selnya
mempunyai indeks bias yang hampir sama dengan indeks bias lingkungannya yang
bersifat cair. Kontras antara sel dan latar belakangnya dapat dipertajam dengan cara
mewarnai sel-sel tersebut dengan zat-zat warna.
Pada umumnya, olesan bakteri terwarnai mengungkapkan ukuran, bentuk,
susunan dan adanya struktur internal seperti spora dan butiran zat pewarna khusus
diperlukan untuk melihat bentuk kapsul ataupun flagella, dan hal-hal terperinci tertentu
di dalam sel.

IV.

Alat dan Bahan

A. Pewarnaan Basa

Alat

1. Kaca objek
2. Kertas isap
3. Jarum inokulasi

4. Pembakar bunsen
5. Mikroskop

Bahan

1. Biakan murni Bacillus cereus, Microrcoccus luteus, Escheria coli, dan

Pseudomonas yang berumur 24 jam
2. Reagen Methylen blue, karbol fuchsin, kristal violet
3. Minyak imersi

B. Pewarnaan Asam

Alat

1. Kaca objek
2. Mikroskop
3. Jarum inokulasi

Bahan

1. Biakan murni Bacillus cereus, Micrococcus luteus, Escheria coli, dan

Pseudomonas yang berumur 24 jam
2. Larutan nigrosin
3. Minyak imersi
V. Hasil Pengamatan
Gambar

Deskripsi

Bentuk bakteri bulat dan berwarna

merah

Tanggal percobaan : 29 Januari 2014

Tanggal pengamatan : 29 Januari 2014
Pewarnaan basa Staphylococcus aureus dengan karbol
fuschin
Perbesaran 1000x
Tanggal percobaan : 29 Januari 2014

Bentuk

Tanggal pengamatan : 29 Januari 2014

batang/silinder dan berwarna merah

bakteri

menyerupai

Pewarnaan basa Bacillus cereus

Perbesaran 1000x
Bentuk bakteri bulat dan tidak
berwarna

 Tanggal percobaan : 29 Januari 2014

Tanggal pengamatan : 29 Januari 2014
Pewarnaan

basa

Staphylococcus

aureus

dengan

menggunakan nigrosin
Perbesaran 1000x
Tanggal percobaan : 29 Januari 2014

Bentuk bakteri menyerupai batang

Tanggal pengamatan : 29 Januari 2014

dan tidak berwarna

Pewarnaan basa Bacillus cereus

Perbesaran 1000x
VI.

Analisis
Pada saat pembuatan apusan, lingkungan sekitar tempat praktikan
bekerja harus steril sehingga praktikan tidak boleh berpindah-pindah tempat
selama praktikum agar selama praktikum alat dan bahan tidak
terkontaminasi oleh bakteri dari luar.
Bakteri dioleskan secara tipis pada kaca preparat selebar 1-2 cm agar
pada saat mencari dan melihat bakteri di mikroskop, bakteri tidak terlalu
bertumpuk di satu titik saja sehingga dapat dicari pada sebaran olesan
bakteri.
Proses fiksasi dilakukan dengan pembakaran agar sel-sel bakteri
menempel pada kaca preparat sehingga kemungkinan sel-sel tersebut untuk
pindah kecil. Namun fiksasi ini dilakukan dengan jarak 25 cm dari sumber
panas, tidak dengan langsung pada sumber panas. Hal ini bertujuan agar sel
bakteri yang akan diamati tidak terlalu mengerut sehingga sulit untuk
diamati.
Pada proses pewarnaan pada apusan bakteri, pewarna dibiarkan
selama beberapa detik menggenang pada apusan agar pewarna dapat terikat
dengan dinding sel bakteri sehingga bakteri dapat terlihat dengan hasil
warna yang sesuai pada pemberian warna.

Pencucian pewarna yang diteteskan bertujuan agar pada saat

pengamatan di mikroskop sel bakteri yang telah terwarnai dapat dilihat
dengan jelas dan tidak hanya terlihat tumpukan pewarna. Jika pewarna lebih
tebal dan bertumpuk di satu titik maka bakteri akan sulit diamati. Oleh
karena sebelumnya pewarna telah dibiarkan terikat dengan dinding sel
maka pencucian pun boleh dilakukan karena tidak akan menghilakan
bakteri maupun zat warna.
Bakteri yang telah dicuci diamati dengan menggunakan mikroskop
dengan perbesaran 100x10 yang ditambahakan dengan minyak imersi.
Penambahan minyak imersi hanya dilakukan pada perbesaran 100x10
karena pada perbesarn ini jarak antara lensa dengan objek sangat dekat
sehingga cahaya dibiaskan tidak masuk ke dalam lensa akibatnya objek
tidak terlihat. Oleh karena itu perlu ditambahkan minyak imersi agar cahaya
yang dibiaskan masuk ke cahaya.

Hasil

pengamatan

terhadap

bakteri

Bacillus

sp

Staphylococcus eureus,
Pada pewarnaan basa bakteri terwarnai oleh reagen sehingga bakteri
berwarna merah. Hal ini disebabkan oleh dinding sel bakteri yang
bermuatan negatif terwarnai oleh reagen yang bermuatan positif sehingga
ada proses penarikan muatan. Warna dengan dinding sel akhirnya menyatu
dan dapat dilihat.
Sedangkan pada pewarnaan asam bakteri tidak berwarna akibat tidak
terwarnai oleh reagen namun lingkungan bakteri terlihat berwarna. Hal ini
disebabkan oleh terjadinya tolak-menolak muatan antara pewarna dan
dinding sel bakteri yang sama-sama negatif. Pewarna akhirnya tidak
menyatu dengan dinding sel sehingga bakteri tidak tewarnai melainkan
lingkungan di sekitar bakteri.
Bakteri yang terlihat memiliki bentuk yang sesuai dengan referensi.
Namun, oleh karena resolusi mikroskop yang digunakan tidak terlalu tinggi

maka struktur dan susunan dalam sel bakteri tidak terlihat. Hanya saja yang
dapat diamati yaitu bentuk morfologi bakteri yang berangkai dan berkoloni
antarbakteri.
VII.

Kesimpulan
A. Pewarnaan Basa

Bakteri Staphylococcus eureus

berwarna merah berbentuk

bulat

Bakteri Bacillus cereus berwarna merah berbentuk batang

B. Pewarnaan Asam

Bakteri Staphylococcus eureus tidak berwarna dan berbentuk

bulat

VIII.

Bakteri Bacillus cereus tidak berwarna dan berbentuk batang

Daftar Pustaka
Campbell, N. A. Dan Reece, J. B., 2005. Biologi Jilid 2. Jakarta: Erlangga.
Hadioetomo, R, S., 1990. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Jakarta: Gramedia.
Campbell, N. A. Dan Reece, J. B., 2005. Biologi Jilid 2. Jakarta: Erlangga.
Hadioetomo, R, S., 1990. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Jakarta: Gramedia.
www.google.com (30 Januari 2014 19.33)
http://wordbiology.wordpress.com (31 Januari 2014 19.25)
http://wapedia.mobi/id/Bakterit=8 (31 Januari 2014 20.05)

Percobaan 6 : Pewarnaan Gram

I.

Tujuan
1. Mengetahui dasar teori dan reaksi kimia dalam pewarnaan gram
2. Mengetahui perbedaan hasil pewarnaan gram dari dua kelompok
bakteri

II.

Prinsip
Pada pewarnaan Gram diperlukan 4 jenis reagen. Reagen pertama yang
disebut pewarna dasar, reagen kedua (larutan Mordant) yang mengikat pewarna
dasar, reagen ketiga yang mencuci warna dasar dan reagen keempat merupakan
pewarna pembanding. Teknik ini mengelompokkan bakteri berdasarkan
komposisi dinding sel bakteri. Bakteri terbagi atas 2 kelompok, yaitu bakteri
gram positif dan bakteri gram negatif. Pada sel bakteri gram positif akan tetap
terlihat ungu setelah diberi pewarna pembanding. Sedangkan pada bakteri gram
negatif akan terlihat warna merah.

III.

Teori Dasar
Pewarnaan Gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan
paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi karena merupakan

tahapan penting dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada
tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya
lapisan lemak pada membran sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan
gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif. Bakteri gram
positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan
baktri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis
membran.

Gram bakteri (www. hafizluengdaneun.multiply.com)

Sel-sel mikroorganisme yang tidak diwarnai umumnya tampak hampir tembus
pandang (transparan) bila diamati dengan mikroskop cahaya biasa hingga sukar
dilihat karena sitoplasma selnya mempunyai indeks bias yang hampir sama
dengan indeks bias lingkungannya yang bersifat cair. Kontras antara sel dan latar
belakangnya dapat dipertajam dengan cara mewarnai sel-sel tersebut dengan zatzat warna. Pada umumnya, olesan bakteri terwarnai mengungkapkan ukuran,
bentuk, susunan dan adanya struktur internal seperti spora dan butiran zat
pewarna khusus diperlukan untuk melihat bentuk kapsul ataupun flagella, dan
hal-hal terperinci tertentu di dalam sel. Zat pewarna adalah garam yang terdiri
atas ion positif dan ion negatif, yang salah satu diantaranya berwarna.
Teknik pewarnaan bukan pekerjaan yang sulit tapi perlu ketelitian dan
kecermatan bekerja serta mengikuti aturan dasar yang berlaku yakni

mempersiapkan kaca obyek. Kaca obyek ini harus bersih dan bebas lemak, untuk
membuat apusan dari bakteri yang diwarnai. Selain itu juga mempersiapkan
apusan. Apusan yang baik adalah yang tipis dan kering, terlihat seperti lapisan
yang tipis. Apusan ini dapat berasal dari biakan cair atau padat.

IV.

Alat dan Bahan

Alat

1. Kaca obyek
2. Jarum inokulasi
3. Mikroskop
4. Lampu bunsen
5. Kertas isap

Bahan

1. Biakan murni bakteri Staphylococcus aureus, Bacillus cereus

dan Eschericia coli
2. Larutan kristal violet
3. Larutan mordant
4. Alkohol 96%
5. Safranin

V.

Hasil Pengamatan

Gambar

Deskripsi
Bentuk
bakteri
bulat
berwarna
ungu

Tanggal percobaan : 29 Januari 2014

Tanggal pengamatan : 29 Januari 2014
Pewarnaan basa Staphylococcus aureus
Perbesaran 1000x
Tanggal percobaan : 29 Januari 2014
Tanggal pengamatan : 29 Januari 2014
Pewarnaan basa Bacillus cereus
Perbesaran 1000x

Bentuk
bakteri
batang
dan
berwarna
ungu

Bentuk
bakteri
batang
dan
berwarna
merah

Tanggal percobaan : 29 Januari 2014

Tanggal pengamatan : 29 Januari 2014
Pewarnaan basa
Bakteri Eschericia coli
Perbesaran 1000x

VI.

Analisis
Pada saat pembuatan apusan, lingkungan sekitar tempat praktikan bekerja harus

steril sehingga praktikan tidak boleh berpindah-pindah tempat selama praktikum agar
selama praktikum alat dan bahan tidak terkontaminasi oleh bakteri dari luar.

Bakteri dioleskan secara tipis pada kaca preparat selebar 1-2 cm agar pada saat
mencari dan melihat bakteri di mikroskop, bakteri tidak terlalu bertumpuk di satu titik
saja sehingga dapat dicari pada sebaran olesan bakteri.
Proses fiksasi dilakukan dengan pembakaran agar sel-sel bakteri menempel pada
kaca preparat sehingga kemungkinan sel-sel tersebut untuk pindah kecil. Namun fiksasi
ini dilakukan dengan jarak 25 cm dari sumber panas, tidak dengan langsung pada
sumber panas. Hal ini bertujuan agar sel bakteri yang akan diamati tidak terlalu
mengerut sehingga sulit untuk diamati.
Pada proses pewarnaan pada apusan bakteri, pewarna dibiarkan selama beberapa
detik menggenang pada apusan agar pewarna dapat terikat dengan dinding sel bakteri
sehingga bakteri dapat terlihat dengan hasil warna yang sesuai pada pemberian warna.
Pemberian pewarna pengikat warna dasar agar warna dasar yang telah diberikan
sebelumnya dapat terikat lebh kuat terhadap dinding sel sehingga pada saat pencucian
warna yang telah diberikan tidak hilang seluruhnya dan tetap terikat pada dinding sel
bakteri. Senyawa yang terkandung pada pewarna dasar mampu mengikat zat warna pada
dinding sel dengan kuat. Warna yang dihasilkan oleh pengikat pewarna dasar menjadi
lebih pekat daripada sebelumnya.
Sebagai uji selanjutnya, sel bakteri dicuci dengan menggunakan etil alkohol 95%
yang mampu melarutkan peptidoplikan dan mendehidrasi protein. Pelarutan ini
bertujuan agar dinding sel bakteri terlarut sehingga warna yang terikat pada dinding sel
juga ikut terlarut. Banyak sedikitnya warna yang ikut terlarut tergantung pada ketebalan
peptidoplikan dan lemak yang terdapat pada dinding sel bakteri. Sel bakteri yang
memiliki peptidoplikan dan lemak yang lebih banyak pada dinding selnya maka seluruh
warna yang terikat akan terlarut sehingga bakteri akan terlihat tidak berwarna. Hal ini
terjadi pada sel bakteri gram negatif. Sedangkan pada sel bakteri yang meiliki dinding
sel dengan peptidoplikan dan lemak yang tipis, maka zat warna yang terlarut pada
dinding sel tidak terlalu banyak sehingga warna sebelumnya masih terlihat. Hal ini
terjadi pada sel bakteri gram positif.

Pewarna pembanding diberikan sebagai bukti hasil pencucian warna di atas. Pada
percobaan digunakan safranin yang berwarna merah sebagai warna pembanding. Jika
warna yang teramati pada sel adalah merah berarti menandakan bahwa safranin
bertindak sebagai pewarna akhir dimana warna sebelumnya telah terlarut bersama etil
alkohol dan dinding sel. Ini terjadi pada sel bakteri gram negatif. Namun, jika warna
yag teramati pada sel adalah ungu, berarti menandakan bahwa safranin tidak
mengalahkan warna sebulumnya yang tidak ikut terlarut oleh etil alkohol. Ini terjadi
pada bakteri gram positif.
Pada percobaan, hasil bakteri yang teramati sesuai dengan referensi seperti pada hasil
pengamatan diatas. Hal ini berarti preparat pada setiap langkah percobaan tidak
terkontaminasi oleh bakteri dari luar karena sel bakteri yang teramati hanya sel yang
diambil dari biakan murni.
Preparasi pewarnaan gram terbaik adalah menggunakan kultur muda yang tidak
lebih lama dari 24 jam. Umur kultur akan berpengaruh pada kemampuan sel menyerap
warna utama (CV), khususnya pada gram positif. Mungkin akan menampakkan gram
variabel yaitu satu jenis sel, sebagian berwarna ungu dan sebagian merah atau mungkin
secara keseluruhan berwarna merah karena pengaruh umur.
VII.

Kesimpulan

Bakteri Staphylococcus aureus dan Bacillus cereus: bakteri

gram positif

VIII.

Bakteri Eschericia coli : bakteri gram negatif

Daftar Pustaka
Campbell, N. A. Dan Reece, J. B., 2005. Biologi Jilid 2. Jakarta: Erlangga.
Hadioetomo, R, S., 1990. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Jakarta:
Gramedia.
http://wordbiology.wordpress.com (3 Februari 2014 18.05)
http://wapedia.mobi/id/Bakterit=8 (4 Februari 2014 18.15).