LBM 3 DESAIN UJI FARMAKOLOGI DAN TOKSIKOLOGI PENGOBATAN HERBAL

STEP 1

In vitro : uji yang dilakukan di luar tubuh, di sel nya, atau bagian tubuh lain.
In = dalam , vitro = kaca, di letakkan di cawan petri atau tabung reaksi
In vivo : merupakan bahasa lain untuk organisme hidup, diujikan di dalam
makhluk hidup. (hewan coba)
Bixin : zat yang terkandung dalam selaput biji kesumba keling yang
mengandung tanin, steroid, terpenoid, flavanoid, dan zat pewarna

STEP 2
1. Apa saja macam2 desain uji farmakologi?
2. Apa saja kriteria yang menentukan in vitro atau in vivo, atau in vitro yang
dilanjutkan in vivo?
3. Apa kelebihan dan kekurangan dari uji in vitro dan in vivo, beserta
contohnya?
4. Bagaimana cara pemilihan subjek uji, parameter, serta uji analisis?
5. Bagaimana cara pengambilan sampel in vitro?
6. Apa saja faktor2 dari subjek uji yang berpengaruh dalam in vitro dan in vivo?
7. Bagaimana tahapan uji in vitro dan in vivo?
8. Aspek klinis?
STEP 3
1. Apa saja macam2 desain uji farmakologi?
- Single blind : peneliti mengetahui isi dari produk uji yang digunakan,
sementara subjek peserta uji klinik tidak mengetahui.
- Double blind : peneliti serta subjek peserta uji klinik tidak mengetahui isi
dari produk uji yang digunakan.
2. Apa saja kriteria yang menentukan in vitro atau in vivo, atau in vitro yang
dilanjutkan in vivo?
Uji preklinik : in vitro dan in vivo
In vitro- in vivo : stem sel

3. Jelaskan tentang exvivo?

Mengambil bagian tubuh dikeluarkan dan diteliti di luar tubuh. Bahasa Latin :
keluar dari hidup sengaja dikeluarkan. Mengubah lingkungan sekitar agar
tidak bias. Sebelumnya belum dilakukan perlakuan
Contoh : diambil sel dari organ makhluk hidup dan dikembang biakkan di luar
tubuh (stem cell)
4. Apa kelebihan dan kekurangan dari uji in vitro dan in vivo, beserta
contohnya?
In vitro
Kelebihan
Lebih cepat

Biaya murah

Sampel lebih sedikit

Kekurangan
Banyak percobaan biologi seluler di
luar tubuh tidak sesuai dengan di
dalam tubuh
Sering dijelaskan in vitro
bertentangan dengan in vivo studi
studi in vitro dilanjutkan dengan in
vivo
Tidak bisa untuk meneliti
farmakokinetik

Contoh : misal akan dilakukan uji dengan antibiotik dengan

mikroba
Malaria memakai plasmodium
In vivo
Kelebihan
Dalam lingkungan yang terkendali

Kekurangan
Kebutuhan sampel lebih banyak
Mahal biayanya
Lebih lama

Contoh : obat vertilitas : dengan tikus yang memiliki anak banyak -

pengamatan baik apabila sampel banyak
5. Apa saja persamaan dan perbedaan in vitro dan in vivo?
Persamaan
Uji preklinik

Perbedaan
In vitro : tidak bisa farmakokinetik
In vivo : bisa dengan farmakokinetik
In vitro : subjek uji tidak banyak
In vivo : banyak
In vitro : efek yang diamati parsial
In vivo : efek yg diamati cenderung total
In vitro : ke hewan coba
In vivo : lebih invasif ke subjek coba

In vitro : mengambil dari suatu sistem

organ
In vivo : subjek penelitian hewan hidup,
dalam keadaan sadar atau teranastesi
In vivo : mencerminkan kondisi tubuh
manusia
In vitro : tidak
In vitro : tidak bisa dilihat pengaruh
terhadap organ tubuh (farmakodinamik)
In vivo : bisa
6. Bagaimana cara pemilihan subjek uji, parameter, serta uji analisis?
Cara pemilihan subjek uji
- Random
- Kalau menguji secara in vivo :
o Uji obat fertilitas : menggunakan tikus SD
o Uji anti diabetik : menggunakan babi atau sapi (pankreas
mirip dengan manusia) , bisa dengan tikus
o Uji anti emetik : menggunakan merpati (bisa dirangsang
berkali2)
o Uji antihipertensi : menggunakan kucing atau anjing
(sistem respirasi dan cardio mirip dengan manusia)
o Uji antipiretik : kelinci ( bisa diukur duburnya setelah
disuntik pirogen )
o Uji asam urat : ayam atau burung (metabolisme mirip
manusia)
o Uji stamina : mencit dan tikus ( karena kuat )
o Uji libido : tikus dalam keadaan estrus
Cara pemilihan uji analisis
- Valid = ketepatan dalam pengukuran sesuai SOP
- Reliabel = konsisten
- Ekonomis = tidak perlu banyak biaya
- Relevan = sesuai dengan tujuan awal
- Objektif = mengacu pada hasilnya
Parameter
Efek farmakologi : dosis terapi ED50
7. Bagaimana cara pengambilan sampel in vitro?
1) Menumbuhkan sel hela atau sel yg lain dan kemudian dimasukkan
ke dalam tabung conical ditambah 5 ml media pencuci lalu di kocok
2) Panen sel
3) Hitung sel
4) Mengkultur sel dan pemberian sampel
5) Penetapan viabilitas sel
8. Apa saja faktor2 dari subjek uji yang berpengaruh dalam in vitro dan in vivo?
In vitro

In vivo
-

Kondisi lingkungan harus terkontrol (tabung reaksi, atau cawan

petri)
Variasi biologi :
o Faktor internal : umur, jenis kelamin, BB, ras, sifat genetik
o Faktor eksternal : pemeliharaan lingkungan ( kondisi kandang,
suasana asing atau baru, suhu, kelembaban, ventilasi
mencit )

9. Bagaimana tahapan uji in vitro dan in vivo?

In vitro
1) Menumbuhkan sel hela atau sel yg lain dan kemudian dimasukkan
ke dalam tabung conical ditambah 5 ml media pencuci lalu di kocok
2) Panen sel
3) Hitung sel
4) Mengkultur sel dan pemberian sampel
5) Penetapan viabilitas sel
In vivo
-

Pemilihan sampel
Pemberian perlakuan
pengamatan

STEP 4
Step 7
1.

Apa saja macam2 desain uji farmakologi?

Contohnya post test only group design melakukan perlakuan mengambil sampel diakhir , prepost melakukan pengambilan sampel pada awal dan akhir di banding kan, time series design
diambil secara berkala melihat efektifitas lama penggunaan obat.
Uji farmakodinamik : untuk melihat khasiat ada zat coba.
Uji farmakokinetik : untuk melihat ADME (absorbs, distribusi, metabolism, ekskresi )

Tahap tahap farmakologi :

Bisa dilakukan invitro dan in vivo

Disesuaikan pada model penyakit dengan subjek uji yang digunakan
Uji penapisan digunakan untuk petunjuk sebagai ada tidaknya khasiat terpaetik
Menghindari pemborosan pada uji lanjut
Sebisa mungkin dilakukan pada hewan mamalia
Bisa diperkirakan pada manusia jika hasil positif

Bisa diteruskan dnegan uji klinik I-IV

Nb : Terkadang terjadi ketidaksesuaian antara uji invivo dengan manusia.
Aspek yang dipertimbangkan untuk uji farmakologi ?
Ada penentuan judul penelitian
Penentuan masalah penelitian
Penentuan tujuan penelitian
Penentuan hipotesis
Penentuan populasi sampel penelitian
Penentuan metode dan teknik pengumpulan data
Penentuan cara mengolah dan analisis data

Pedoman Pelaksanaan Uji Klinik Obat Tradisional, terbitan Departemen Kesehatan RI, Edisi 1,
Departemen Kesehatan Jakarta, 2000
2.
Apa saja kriteria yang menentukan in vitro atau in vivo, atau in vitro yang
dilanjutkan in vivo?
Uji preklinik : in vitro dan in vivo
In vitro- in vivo : stem sel

3.

Jelaskan tentang exvivo?

Ex vivo
Ex vivo (Latin: keluar dari hidup) berarti yang terjadi di luar organisme . Dalam ilmu, ex vivo
mengacu pada percobaan atau pengukuran dilakukan di dalam atau pada jaringan dalam
suatu lingkungan buatan luar organisme dengan perubahan minimum kondisi alam; uji
eksperimen pada jaringan suatu organisme, dengan kondisi lingkungan buatan yang mirip
dengan kondisi alami. Kondisi ex vivo memungkinkan eksperimen dengan kondisi yang
terkendali lebih dari mungkin dalam organisme utuh, dengan mengorbankan mengubah "alam"
lingkungan.
Dalam biologi sel , ex vivo prosedur sering melibatkan sel hidup atau jaringan yang diambil
dari suatu organisme dan berbudaya dalam laboratorium aparat, biasanya dalam kondisi
steril dengan tanpa perubahan sampai 24 jam. Percobaan berlangsung lebih lama dari ini selsel hidup atau menggunakan jaringan biasanya dianggap in vitro. Satu banyak dilakukan
studi ex vivo adalah chick membran chorioallantoic (CAM) assay. Dalam uji ini, angiogenesis
adalah dipromosikan pada membran CAM dari ayam embrio di luar organisme (ayam).

Buku Ajar Analisis Hayati, Editor : Manurung Y, Edisi 3, EGC, Jakarta

2006
4.
Apa kelebihan dan kekurangan dari uji in vitro dan in vivo, beserta
contohnya?

Beberapa tipe pengujian :

INVIVO
-

in vivo (Latin: within the living) : uji eksperimen dengan menggunakan keseluruhan organisme
hidup
In vivo adalah eksperimen dengan menggunakan keseluruhan organisme hidup. Pengujian dengan
hewan coba ataupun uji klinis merupakan salah satu bentuk penelitian in vivo. Pengujian in vivo
lebih sering dilakukan daripada in vitro karena lebih cocok untuk mengamati efek keseluruhan
percobaan pada subjek hidup. Dalam biologi molekular, in vivo sering merujuk pada eksperimen
yang dilakukan dalam sel hidup terisolasi, bukan pada keseluruhan organisme, misalnya, berasal
dari sel-sel kultur biopsi. Dalam keadaan ini, istilah yang lebih spesifik adalah ex vivo. Setelah
sel terganggu dan bagian sel atau jaringan organisme yang diuji atau dianalisis, hal ini dikenal
sebagai in vitro.
KEUNTUNGAN DAN KERUGIAN :

Keuntungan dari uji in vivo ini adalah hasil yang diperoleh lebih akurat karena langsung
mengacu pada efek farmakodiamik dari sediaan tersebut.
Kerugian dari uji in vivo ini, adalah :

Tingkat kesulitan yang tinggi untuk mendetekdi bahan obat yang diabsorpsi dalam darah
Sulit menentukan seberapa jauh keterkaitan antara harga kadar darah dengan kerja klinik obat
Apabila zat aktif tidak lagi dapat dideteksi di dalam darah atau jaringan, efek farmakologi sulit
ditentukan

INVITRO
in vitro (Latin: within the glass) : uji eksperimen dengan menggunakan biakan di dalam tabung
reaksi atau cawan petri
Prosedur in vitro mengacu pada prosedur yang dilakukan dalam lingkungan yang terkendali di
luar organisme hidup, tidak dalam hidup organisme, tetapi dalam lingkungan terkontrol, misalnya
di dalam tabung reaksi atau cawan Petri. Banyak percobaan biologi seluler dilakukan di luar
organisme atau sel; karena kondisi pengujian mungkin tidak sesuai dengan kondisi di dalam
organisme, ini dapat mengakibatkan hasil yang tidak sesuai dengan situasi yang muncul dalam
organisme hidup. Akibatnya, hasil eksperimen tersebut sering dijelaskan dengan in vitro,
bertentangan dengan in vivo. Jenis penelitian ini bertujuan untuk menjelaskan pengaruh dari
variabel eksperimental pada bagian pokok suatu organisme. Hal ini cenderung untuk
memfokuskan pada organ, jaringan, sel, komponen sel, protein, dan/atau biomolekuler. Namun,
kondisi yang terkendali dalam sistem in vitro berbeda secara signifikan dengan in vivo, dan dapat
memberikan hasil yang menyesatkan. Oleh karena itu, dalam studi in vitro biasanya diikuti oleh
studi vivo.
KEUNTUNGAN DAN KERUGIAN :

Kondisi percobaan in vitro mempunyai beberapa keuntungan antara lain :

Kondisi percobaan dapat dikontrol

Faktor individual yang dapat mempengaruhi percobaan dapat dihilangkan
Metode in vitro dapat digunakan untuk percobaan fisika kimia seperti koefesien partisi dan
koefesien difusi.

Kejelekan dari metode ini adalah kondisi percobaan tidak sama dengan kondisi jaringan
kulit yang asli, terutama mengenai pengadaan aliran darah (Barry, 1983).

EX VIVO
ex vivo (Latin: out of the living) : uji eksperimen pada jaringan suatu organisme, dengan kondisi
lingkungan buatan yang mirip dengan kondisi alami
Ex vivo berarti terjadi di luar organisme. Secara ilmiah, ex vivo mengacu pada percobaan atau
pengukuran yang dilakukan di dalam atau pada jaringan pada suatu lingkungan buatan di luar
organisme dengan perubahan minimum terhadap kondisi alamiah. Kondisi ex vivo
memungkinkan eksperimen dengan kondisi yang lebih terkendali daripada eksperimen in vivo,
dengan cara mengubah lingkungan alamiah suatu organisme. Keuntungan utama menggunakan
jaringan ex vivo adalah kemampuan untuk melakukan tes atau pengukuran yang tidak mungkin
atau tidak etis dalam kehidupan subyek penelitian. Jaringan dapat dikeluarkan dengan berbagai
cara, baik sebagian organ, atau keseluruhan organ , atau sistem organ yang lebih besar.

Contoh penggunaan spesimen ex vivo meliputi:

-

pengukuran fisik, termal, listrik, mekanik, optik, dan kandungan yang terdapat pada jaringan,
terutama di berbagai lingkungan yang mungkin tidak mendukung kehidupan (misalnya, pada
tekanan atau suhu yang ekstrim)
model yang realistis untuk prosedur bedah
sebagai phantom dalam pengembangan teknik pencitraan (imaging)

Dalam biologi sel, prosedur ex vivo sering melibatkan sel atau jaringan hidup yang
diambil dari suatu organisme dan di kultur pada laboratorium, biasanya dalam kondisi
steril dengan tanpa perubahan sampai 24 jam. Percobaan yang berlangsung lebih lama
dari ini (dengan menggunakan sel-sel atau jaringan hidup juga) biasanya dianggap
sebagai percobaan in vitro. Suatu studi ex vivo
yang banyak dilakukan
adalah
pengujian terhadap chick membran chorioallantoic (CAM). Dalam uji ini, proses
angiogenesis dirangsang pada membran CAM dari embrio ayam di luar organisme.

IN SILICO :
in silico (Latin: within the silicon) : uji eksperimen dengan metode simulasi di komputer

Buku Ajar Analisis Hayati, Editor : Manurung Y, Edisi 3, EGC, Jakarta

2006

IN VITRO
In vitro : primary bioasssay
adalah penelitian yang dilakukan dalam tabung uji atau media kultur di laboratorium;
Terletak di dalam suatu system tetapi di luar tubuh manusia
Kebutuhan sample yang digunakan lebih sedikit
Murah dan cepat
dilakukan mikroorganisme pada tidak hidup tetapi dalam lingkungan terkontrol, misalnya di
dalam tabung reaksi atau cawan Petri
Jenis penelitian ini bertujuan untuk menjelaskan pengaruh dari variabel eksperimental pada
subset dari bagian pokok suatu organisme. Hal ini cenderung untuk memfokuskan pada
organ , jaringan , sel , komponen sel, protein , dan / atau biomolekul
in vitro lebih cocok untuk mengamati efek keseluruhan percobaan pada subjek hidup
(KEPUTUSAN MENTERI KESEHATAN REPUBLIK INDONESIA
NOMOR 761/MENKES/SK/IX/1992 TENTANG PEDOMAN FITOFARMAKA)

In vitro :
Terletak di dalam suatu system tetapi di luar tubuh manusia
dilakukan mikroorganisme pada tidak hidup tetapi dalam lingkungan terkontrol, misalnya di
dalam tabung reaksi atau cawan Petri
Jenis penelitian ini bertujuan untuk menjelaskan pengaruh dari variabel eksperimental pada
subset dari bagian pokok suatu organisme. Hal ini cenderung untuk memfokuskan pada
organ , jaringan , sel , komponen sel, protein , dan / atau biomolekul
tingkat penyederhanaan sistem yang diteliti lebih besar , sehingga peneliti dapat fokus pada
sejumlah komponen. Sebagai contoh , identitas protein dari sistem kekebalan tubuh ( misalnya
antibodi ) , dan mekanisme yang mengenali dan mengikat antigen asing akan tetap sangat jelas
jika tidak untuk penggunaan ekstensif kerja in vitro untuk mengisolasi protein ,
mengidentifikasi sel-sel dan gen yang memproduksi mereka , mempelajari fisik sifat interaksi
mereka dengan antigen , dan mengidentifikasi bagaimana interaksi mereka menyebabkan
sinyal seluler yang mengaktifkan komponen lain dari sistem kekebalan tubuh
Respon seluler adalah spesies - spesifik , lintas analisis - bermasalah spesies . Metode baru
spesies - sasaran yang sama - , studi multi- organ yang tersedia untuk memotong hidup ,
pengujian lintas-spesies
kekurangan :
- Banyak percobaan biologi seluler dilakukan di luar organisme atau sel ; karena kondisi
pengujian mungkin tidak sesuai dengan kondisi di dalam organisme, ini dapat mengakibatkan
hasil yang tidak sesuai dengan situasi yang muncul dalam organisme hidup. Akibatnya, hasil
eksperimen tersebut sering dijelaskan dengan in vitro, bertentangan dengan in vivo.
- Namun, kondisi yang terkendali hadir dalam sistem in vitro berbeda secara signifikan dari
yang in vivo, dan dapat memberikan hasil yang menyesatkan. Oleh karena itu, dalam studi in
vitro biasanya diikuti oleh studi vivo.

Contohnya termasuk:

Dalam biokimia, fisiologis stoikiometri konsentrasi non-aktif dapat mengakibatkan

enzim dalam arah terbalik, misalnya beberapa enzim dalam siklus Krebs mungkin
tampak memiliki tata-nama, salah.

DNA dapat mengadopsi konfigurasi lainnya, seperti A DNA .

Protein lipat mungkin berbeda seperti dalam sel ada kepadatan tinggi protein lain dan
ada sistem untuk membantu lipat, sementara in vitro, kondisi kurang bergerombol dan
tidak membantu.

Kelebihan
Kebutuhan sample yang digunakan lebih sedikit
Murah dan cepat
Dalam penelitian in vitro yang lebih cocok dibandingkan in vivo untuk menyimpulkan
tindakan mekanisme biologis. Dengan variabel yang lebih sedikit dan perseptual diperkuat
menyebabkan reaksi halus, hasil yang umumnya lebih jelas.
in vitro lebih cocok untuk mengamati efek keseluruhan percobaan pada subjek hidup

IN VIVO
In vivo : secondary bioassay
Terletak di dalam tubuh manusia
Kebutuhan sample yang digunakan lebih banyak
Mahal dan lama
dalam lingkungan yang terkendali
Sedangkan uji in vivo digunakan hewan utuh dan kondisi hidup (baik sadar atau teranestesi).
Syarat hewan yg digunakan sangat banyak tgt jenis obatnya, missal yang jelas harus
dilakukan control terhadap galur/spesies, jenis kelamin, umur, berat badan (mempengaruhi
dosis), dan harus dilakukan pada minimal 2 spesies yakni rodent/hewan mengerat dan non
rodent. Alasannya krn system fisiologi dan patologi pada manusia merupakan perpaduan antara
rodent dan non rodent
(KEPUTUSAN MENTERI KESEHATAN REPUBLIK INDONESIA
NOMOR 761/MENKES/SK/IX/1992 TENTANG PEDOMAN FITOFARMAKA)

In vivo :

Terletak di dalam tubuh manusia digunakan hewan utuh dan kondisi hidup (baik sadar atau
teranestesi)
dalam lingkungan yang terkendali
Syarat hewan yg digunakan sangat banyak tgt jenis obatnya, missal yang jelas harus
dilakukan control terhadap galur/spesies, jenis kelamin, umur, berat badan (mempengaruhi
dosis)
harus dilakukan pada minimal 2 spesies yakni rodent/hewan mengerat dan non rodent.
Alasannya krn system fisiologi dan patologi pada manusia merupakan perpaduan antara rodent

dan

non

rodent.

kekurangan

Kebutuhan sample yang digunakan lebih banyak

Mahal dan lama

(KEPUTUSAN MENTERI KESEHATAN REPUBLIK INDONESIA

NOMOR 761/MENKES/SK/IX/1992 TENTANG PEDOMAN FITOFARMAKA)
5.

Apa saja persamaan dan perbedaan in vitro dan in vivo?

Sama-sama salah satu uji evaluasi sediaan fisik, kimia dan biologis agar sediaan yang dibuat

dapat memiliki efek teurapetik zat aktif yang diharapkan.

Sama-sama merupakan uji yang digunakan untuk mengetahui farmakokinetik dan
farmakodinamik dari suatu sediaan.

Anonim, 2005, Uji In Vitro dan In Vivo Sediaan Semisolid dan Liqud.
6.

Bagaimana cara pemilihan subjek uji, parameter, serta uji analisis?

Spesies yang ideal untuk uji toksisitas sebaiknya memenuhi criteriakriteria sebagai berikut:
Berat badan lebih kecil dari 1 kg
Mudah di ambil darahnya dan jumlah darah yang dapat diambil cukup
banyak
Mudah dipegang dan dikendalikan
Pemberian materi mudah dilakukan dengan berbagai rute (oral,
subkutan)
Mudah dikembangbiakan dan mudah dipelihara di laboratorium
Lama hidup relative singkat
Fisiologi diperkirakan sesuai/identik dengan manusia/hewan yang
dituju
(Kusumawati.2004.Bersahabat dengan hewan coba.Yogyakarta:Gadjah
Mada University Press)
Kesehatan hewan bebas dari penyakit
Disesuaikan dengan tujuan penelitian
Kebutuhan bahan makanan di sesuaikan berat badan
BB disesuaikan dengan rancangan penelitian
(Bersahabat dengan hewan coba UGM)
Penelitian yang memanfaatkan hewan coba, harus menggunakan hewan
percobaan yang sehat dan berkualitas sesuai dengan materi penelitian.

Hewan tersebut dikembang-biakkan dan dipelihara secara khusus dalam

lingkungan yang diawasi dan dikontrol dengan ketat. Tujuannya adalah
untuk mendapatkan defined laboratory animals sehingga sifat genotipe,
fenotipe (efek maternal), dan sifat dramatipe (efek lingkungan terhadap
fenotipe) menjadi konstan. Hal itu diperlukan agar penelitian bersifat
reproducible, yaitu memberikan hasil yang sama apabila diulangi pada
waktu lain, bahkan oleh peneliti lain.
Berbagai hewan kecil memiliki karakteristik tertentu yang relatif serupa
dengan manusia, sementara hewan lainnya mempunyai kesamaan
dengan aspek fisiologis metabolis manusia.
Dalam penelitian kesehatan yang memanfaatkan hewan coba, juga harus
diterapkan prinsip 3 R dalam protokol penelitian, yaitu: replacement,
reduction,dan refinement.
Replacement adalah keperluan memanfaatkan hewan percobaan sudah
diperhitungkan secara seksama, baik dari pengalaman terdahulu maupun
literatur untuk menjawab pertanyaan penelitian dan tidak dapat
digantikan oleh mahluk hidup lain seperti sel atau biakan jaringan.
Replacement terbagi menjadi dua bagian, yaitu: relatif (mengganti hewan
percobaan dengan memakai organ/jaringan hewan dari rumah potong,
hewan dari ordo lebih rendah) dan absolut (mengganti hewan percobaan
dengan kultur sel, jaringan, atau program komputer).
Reduction diartikan sebagai pemanfaatan hewan dalam penelitian
sesedikit mungkin, tetapi tetap mendapatkan hasil yang optimal. Jumlah
minimum biasa dihitung menggunakan rumus Frederer yaitu (n-1) (t-1)
>15, dengan n adalah jumlah hewan yang diperlukan dan t adalah jumlah
kelompok perlakuan. Kelemahan dari rumus itu adalah semakin sedikit
kelompok penelitian, semakin banyakjumlah hewan yang diperlukan,
serta sebaliknya. Untuk mengatasinya, diperlukan penggunaan desain
statistik yang tepat agar didapatkan hasil penelitian yang sahih.
Refinement adalah memperlakukan hewan percobaan secara manusiawi
(humane), memelihara hewan dengan baik, tidak menyakiti hewan, serta
meminimalisasi perlakuan yang menyakitkan sehingga menjamin
kesejahteraan hewan coba sampai akhir penelitian.
(http://indonesia.digitaljournals.org/index.php/idnmed/article/viewFile/123
7/1210)

In vivo :
Analgesik

(http://lib.ui.ac.id/file?file=digital/20311589-S42961-Uji%20efek.pdf
In
1.
2.
3.
4.
5.
6.

vitro:
Uji aktivitas antiaskaris (anticacing)
Uji antifungi
Uji antikalkuli
Uji efek mukolitik
Uji farmakodinamik dg organ terisolir
Uji toksisitas in vitro
- metode Brain Shrimp Test (BST)

- metode Sitotoksisitas
EFEK SITOTOKSIK IN VITRO DARI EKSTRAK BUAH MAHKOTA DEWA
(PHALERIA MACROCARPA) TERHADAP KULTUR SEL KANKER
MIELOMA
Uji Aktivitas Sitotoksik. Sediaan uji dan sediaan kontrol pelarut masingmasing sebanyak 0,1 ml dimasukkan dalam sumur microwell plateyang
telah berisi 0,9 ml suspensi sel hasil inisiasi. Replikasi dilakukan sebanyak
dua kali. Selanjutnya diinkubasi dalam inkubator CO2 suhu 37C selama
24 jam. Kemudian dari masing-masing sumur diambil sebanyak 0,1 ml
dimasukkan dalam tabung reaksi dan ditambah dengan larutan tripan
blue 0,5% sebanyak 0,1 ml (perbandingan 1:1) dan dihomogenkan. Dari
campuran tersebut dipipet dan diletakkan diatas ruang hitung
hemositometer. Perhitungan dilakukan dibawah mikroskop dengan
pembesaran 100 kali. Viabilitas sel dihitung dengan rumus:

(http://journal.unair.ac.id/filerPDF/06%20vol%207%20april
%202008%20(48-54).pdf)
Antifungi
UJI AKTIVITAS ANTIJAMUR EKSTRAK ETANOL KULIT BATANG
RAMBUTAN (Nephelium lappaceum L.) TERHADAP JAMUR Candida
Albicans SECARA IN VITRO
Pengujian Aktivitas Antijamur
a. Media dasar PDA dituang ke dalam cawan petri dan dibiarkan
mengeras.
b. Pada permukaan lapisan dasar diletakkan 6 pencadang dan diatur
sedemikian rupa
sehingga terdapat daerah yang baik untuk mengamati zona hambat yang
terjadi.
c. PDA yang mengandung suspensi jamur uji dituang ke dalam cawan
petri di sekeliling
pencadang.
d. Dikeluarkan pencadang dari cawan petri sehingga terbentuk sumur
yang akan digunakan untuk larutan uji, larutan kontrol positif (+) dan
larutan kontrol negatif (-).
e. Diteteskan larutan uji ekstrak sampel kering etanol, ekstrak sampel
basah etanol, larutan kontrol positif (+) dan larutan kontrol negatif (-).
f. Dilakukan pengulangan secara triplo dengan cara yang sama.

g. Diinkubasikan dalam inkubator pada suhu 37 C selama 1x24 jam.

h. Diamati zona hambat yang terjadi di sekitar sumuran kemudian diukur
diameter zona hambat secara horizontal dan vertikal dengan
menggunakan penggaris berskala.
(http://download.portalgaruda.org/article.php?article=123510&val=5543)
Organ Terisolasi
EFEK EKSTRAK DAUN CIPLUKAN (Physalis minima L) TERHADAP
RELAKSASI OTOT POLOS TERPISAH TRAKEA MARMUT (Cavia
porcellus)
METODOLOGI
Percobaan dilakukan dengan menggunakan hewan coba marmut jantan
(n=5). Percobaan dilakukan dengan metoda organ terpisah yaitu
menggunakan rantai cincin trakea yang dimasukkan ke dalam organ
bathdan dihubungkan dengan rekorder macLab. Selama percobaan rantai
cicin trakea di dalam organbath direndam cairan fisiologis Krebs yang
selalu diganti setiap 15 menit, temperatur dipertahankan 35-37 C dan
terus menerus dialiri gas karbogen (9). Daun ciplukan (Physalis minima L)
dibuat ekstrak dengan menggunakan etanol. Untuk melihat respon
relaksasi dari pemberian ekstrak daun ciplukan, dilakukan stimulasi
kontraksi otot polos trakea terlebih duludengan menggunakan histamin
10-5 M (9,10), jika sudah terjadi kontraksi yang stabil, kemudian baru
ditambahkan ekstrak daunciplukan secara kumulatif dengan dosis 0,3 %,
0,5 %, 0,7 % dan diamati respon relaksasi otot polos trakea dari
penurunan kurva yang terekam di komputer mac lab dan dapat diukur
besar kontraksi dan relaksasi dalam satuan mv. Ekstrak daun ciplukan
diberikan secara kumulatif berdasar penelitian pendahuluan yang
didapatkan hasil bahwa efek relaksasi ekstrak daun ciplukan bertahan
lama dan baru hilang responsnya setelah dilakukan pencucian. Data yang
diperoleh adalah besar kontraksi dari otot polos trakea setelah pemberian
histamin (kontrol) dan penurunan kontraksi (relaksasi) otot polos trakea
setelah pemberian ekstrak daun ciplukan (perlakuan). Besar kontraksi
yang terekam pada komputer maclab menggunakan satuan mili volt Data
yang didapatkan dianalisis dengan uji anova, dan uji korelasi regresi.
(http://jkb.ub.ac.id/index.php/jkb/article/viewFile/237/229)
7.

Bagaimana cara pengambilan sampel in vitro?

1)
Menumbuhkan sel hela atau sel yg lain dan kemudian dimasukkan ke dalam
tabung conical ditambah 5 ml media pencuci lalu di kocok
2)

Panen sel

3)

Hitung sel

4)

Mengkultur sel dan pemberian sampel

5)

Penetapan viabilitas sel

8.

Apa saja faktor2 dari subjek uji yang berpengaruh dalam in vitro dan in vivo?

Ada beberapa faktor yang dapat mempengaruhi hasil percobaan diantaranya:

1. Faktor internal
Meliputi variasi biologik, yaitu usia (berpengaruh pada dosis yang harus diberikan) dan
jenis kelamin (ada obat-obat yang lebih peka untuk jantan dan untuk betina). Kemudian
ras dan sifat genetic, faktor-faktor tersebut sangat berpengaruh terhadap hewan yang akan
di jadikan percobaan karena akan memepengaruhi hasil dari percobaan disebabkan oleh
pengaruh dosis dan cairan tubuh hewan tersebut sehingga hasil dari pengamatan akan
berbeda-beda, sehingga memepengaruhi efek farmakologinya. Selain itu, status kesehatan
dan nutrisi, bobot tubuh serta luas permukaan tubuh akan berpengaruh pada dosis yang
harus diberikan.
2. Faktor eksternal
Meliputi suplai oksigen, pemeliharaan lingkungan fisiologik (keadaan kandang, suasana
asing atau baru, pengalaman hewan dalam penerimaan obat, keadaan ruangan tempat
hidup seperti suhu, kelembaban, ventilasai, cahaya, kebisingan serta penempatan hewan),
pemilihan keutuhan struktur ketika menyiapkan jaringan atau organ untuk percobaan.
Faktor-faktor tersebut dapat mempengaruhi hasil percobaan, dan mempengaruhi efek
farmakologinya, apabila hewan yang sudah biasa di beri obat maka akan terlihat lebih
rilex dan santai berbeda dengan hewan percobaan yang masih baru dan masih asing
makan akan lebih berontak dan agresif, sehingga kita membutuhkan penelitian dan
perawatan yang baik terhadap hewan percobaan sebelum melakukan percobaan.
9.

Bagaimana tahapan uji in vitro dan in vivo?

3.b.1. PRINSIP
Sekelompok hewan uji dengan jenis kelamin yang sama diberikan dosis bertingkat
menggunakan metode fixed doses antara lain: 5, 50, 300 dan 2000 mg/kg (dosis
dapat ditambah hingga 5000 mg/kg). Dosis awal dipilih berdasarkan uji
pendahuluan sebagai dosis yang dapat menimbulkan gejala toksisitas ringan tetapi
tidak menimbulkan efek toksik yang berat atau kematian. Prosedur ini dilanjutkan
hingga mencapai dosis yang menimbulkan efek toksik atau ditemukan tidak lebih
dari 1 kematian, atau tidak tampak efek toksik hingga dosis yang tertinggi atau
adanya kematian pada dosis yang lebih rendah.
3.b.2. PROSEDUR

3.b.2.1. Penyiapan Hewan Uji

Hewan yang digunakan adalah rodensia tikus putih (strain Sprague Dawley atau
Wistar) atau mencit (strain ddY atau BALB/c dan lain-lainnya). Umumnya
digunakan tikus betina karena sedikit lebih sensitif dibandingkan tikus jantan.
Namun bila bahan uji (menurut literatur) secara toksikologi atau toksikokinetik
menunjukkan bahwa tikus jantan lebih sensitif, maka jenis kelamin jantan harus
digunakan untuk uji. Secara prinsip jika hewan jantan digunakan maka diperlukan
alasan yang kuat. Hewan diseleksi secara acak, diberi tanda untuk identifikasi tiaptiap hewan, dan dilakukan aklimatisasi sekurang-kurangnya 5 hari sebelum diberi
perlakuan.
3.b.2.2. Penyiapan Sediaan Uji
Sediaan uji dilarutkan dengan bahan pembawa yang sesuai
(misalnya
aquadestilata, minyak nabati). Tergantung dari formulasi bahan uji, pemilihan
cairan untuk suspensi/emulsi yang aqueous lebih dianjurkan dari pada larutan
suspensi/emulsi yang larut dalam minyak (minyak jagung) dan apabila
menggunakan pelarut non aqueous maka karakteristik toksisitas cairan pembawa
sudah harus diketahui.
3.b.2.3. Pemberian Sediaan uji dan Volume Pemberian
Hewan uji harus dipuasakan sebelum diberikan perlakuan (tikus dipuasakan selama
14-18 jam, namun air minum boleh diberikan; mencit dipuasakan selama 3-4 jam,
air minum boleh diberikan). Setelah dipuasakan, hewan ditimbang dan diberikan
sediaan uji. Sediaan uji diberikan dalam dosis tunggal dengan menggunakan sonde.
Pada keadaan yang tidak memungkinkan untuk diberikan dosis dengan satu kali
pemberian, sediaan uji dapat diberikan beberapa kali dalam jangka waktu
pemberian zat tidak boleh melampaui 24 jam. Setelah diberikan perlakuan, pakan
boleh diberikan kembali setelah 3-4 jam untuk tikus dan 1-2 jam untuk mencit. Bila
sediaan uji diberikan beberapa kali, maka pakan boleh diberikan setelah perlakuan
tergantung pada lama periode pemberian sediaan uji tersebut. Volume cairan
maksimal yang dapat diberikan tergantung pada ukuran hewan uji. Pada rodensia,
jumlah normalnya tidak melampaui 1 mL/100
g berat badan, namun bila
pelarutnya air (aqueous) dapat diberikan hingga 2 mL/100 g berat badan.
Umumnya sediaan uji diberikan dalam volume yang tetap selama pengujian
(konsentrasi berbeda), akan tetapi jika bahan uji berupa cairan atau campuran
cairan, sebaiknya digunakan dalam bentuk tidak diencerkan (konsentrasi tetap).
3.b.2.4. Uji Pendahuluan
Tujuan dari uji pendahuluan adalah mencari dosis awal yang sesuai untuk uji utama.
Dosis awal pada uji pendahuluan dapat dipilih dari tingkatan fixed dose: 5, 50, 300
dan 2000 mg/kg BB sebagai dosis yang diharapkan dapat menimbulkan efek toksik
(Lampiran 1, 2). Pemeriksaan menggunakan dosis 5000 mg/kg hanya dilakukan

bila benar-benardiperlukan. Diperlukan informasi tambahan yaitu data-data

toksisitas in vivo dan in vitro dari zat-zat yang mempunyai kesamaan secara
kimiawi dan struktur. Jika informasi tersebut tidak ada, maka dosis awalnya
ditentukan sebesar 300 mg/kg BB. Interval waktu pengamatan sekurang-kurangnya
24 jam pada setiap dosis dan semua hewan harus diamati sekurang-kurangnya
selama 14 hari. Bila kematian terjadi pada dosis 5 mg/kg BB, sehingga nilai cutt-of
LD50 adalah 5mg/kg BB (masuk kategori 1 GHS) maka penelitian sudah harus
dihentikan tanpa perlu melakukan uji utama. Namun, jika diperlukan penegasan
nilai LD50 maka prosedur tambahan dapat dilakukan sbb: Pada hewan uji kedua
diberikan dosis 5 mg/kg. Jika hewan kedua ini mati, maka kategori 1 GHS
terkonfirmasi dan percobaan dihentikan. Jika hewan ini hidup, maka pemberian
bahan uji dosis 5 mg/kg BB secara berurutan dilanjutkan kepada 3 hewan uji
lainnya. Interval waktu pemberian antara satu hewan dengan hewan berikutnya
harus cukup agar dapat dilakukan penilaian apakah hewan tersebut akan tetap
hidup atau tidak. Jika hewan ke-3 mati (jika dihitung dari awal merupakan kematian
kedua hewan uji), maka pemberian bahan uji dihentikan dan tidak diteruskan
kepada hewan ke-4 dan ke-5. Berdasarkan Lampiran 2, maka bahan uji masuk
kelompok A (kematian 2 atau lebih), dan berlaku klasifikasi pada dosis 5 mg/kgBB
(Kategori 1 jika ada 2 atau lebih kematian atau Kategori 2 jika hanya ada 1
kematian).
3.b.2.5. Uji Utama
Uji utama dilakukan dengan memperhatikan tingkat dosis dimana terjadi kematian
pada uji pendahuluan. Penentuan dosis antara setiap tingkatan didasarkan pada
waktu terjadinya gejala toksik. Pengujian tidak diteruskan pada dosis selanjutnya
sampai diketahui apakah hewan masih bertahan hidup atau mati (Lampiran 3, 4).
Secara umum terdapat 3 pilihan yang akan diambil: menghentikan uji, melanjutkan
uji dengan dosis yang lebih tinggi atau melanjutkan uji dengan dosis yang lebih
rendah. Pada umumnya, klasifikasi bahan uji sudah dapat ditentukan pada dosis
awal dan uji selanjutnya tidak diperlukan. Pada uji ini diperlukan sejumlah 5 ekor
hewan uji untuk tiap tahapan dosis uji. Kelima ekor hewan tersebut terdiri atas 1
ekor hewan dari uji pendahuluan dan 4 ekor hewan tambahan. Interval waktu
antara dosis uji ditentukan oleh onset, lama dan beratnya toksisitas. Peralihan
pemberian bahan uji pada tahap dosis berikutnya harus ditunda sampai diperoleh
petunjuk bahwa hewan uji tersebut bertahan hidup. Umumnya diperlukan interval
waktu peralihan selama 3-4 hari, namun dapat diperpanjang bila hasilnya tampak
meragukan. Sehubungan dengan animal welfare, bila akan menggunakan dosis
diatas 5000 mg/kg, dipertimbangkan bahwa dosis tersebut sangat relevan dengan
kepentingan untuk melindungi manusia, hewan atau lingkungan.
3.b.2.6. Uji Batas

Jika pada uji pendahuluan tidak ada kematian pada tingkat dosis 2000 mg/kg dan
pada uji utama hanya 1 ekor atau tidak ada hewan yang mati pada tingkat dosis
2000 mg/kg, maka tidak perlu diberikan dosis melampaui 2000 mg/kg.
3.b.2.7. Pengamatan
Hewan uji diobservasi secara individual sekurang-kurangnya pada 30 menit
pertama setelah pemberian sediaan uji, dan secara periodik setiap 4 jam selama 24
jam pertama dan sehari sekali setelah itu selama 14 hari. Namun
durasi
pengamatan dapat bervariasi dan diperpanjang tergantung dari reaksi toksik dan
waktu onset serta lama waktu kesembuhan. Waktu timbul dan hilangnya gejala
toksisitas (khususnya jika ada kecenderungan tanda-tanda toksik yang tertunda)
harus dicatat secara sistematis dalam catatan individual yang dilakukan untuk
setiap hewan.
Pengamatan tambahan perlu dilakukan jika hewan menunjukkan gejala toksisitas
secara terus-menerus. Pengamatan yang dilakukan termasuk pada: kulit, bulu,
mata, membran mukosa dan juga sistem pernafasan, sistem syaraf otonom, sistem
syaraf pusat, aktivitas somatomotor serta tingkah laku. Selain itu, perlu juga
pengamatan pada kondisi: gemetar, kejang, salivasi, diare, lemas, tidur dan koma.
Hewan dalam kondisi sekarat dan hewan yang menunjukkan gejala nyeri yang
berat atau tampak menderita harus dikorbankan. Hewan uji yang dikorbankan atau
ditemukan mati, waktu kematiannya harus dicatat. Hal- hal yang harus diamati
dalam periode observasi adalah:
a. Tingkah laku hewan seperti jalan mundur, jalan menggunakan perut
b. Berat Badan
Berat badan masing-masing hewan harus dimonitor pada saat sebelum diberikan
sediaan uji dan sekurang-kurangnya seminggu setelahnya. Perubahan berat badan
harus dianalisis. Pada akhir penelitian, hewan yang masih bertahan hidup ditimbang
dan kemudian dikorbankan.
c. Pemeriksaan Patologi
Seluruh hewan (termasuk yang mati selama penelitian maupun yang dimatikan)
harus dinekropsi. Semua perubahan gross patologi dicatat untuk setiap hewan uji.
Pemeriksaan mikroskopik dari organ yang menunjukkan adanya perubahan secara
gross patologi pada hewan yang bertahan hidup selama 24 jam atau lebih setelah
pemberian dosis awal dapat dilakukan untuk mendapatkan informasi yang berguna.
3.b.2.8. Pengumpulan dan Analisis Data
Data masing-masing hewan harus tersedia dan semua data harus diringkas dalam
bentuk tabel yang menunjukkan dosis uji yang digunakan; jumlah hewan yang
menunjukkan gejala toksisitas; jumlah hewan yang ditemukan mati selama uji dan

yang mati karena dikorbankan; waktu kematian masing-masing hewan; gambaran

dampak toksik dan waktu dampak toksik; waktu terjadinya reaksi kesembuhan; dan
penemuan nekropsi.
(PERATURAN KEPALA BADAN PENGAWAS OBAT DAN MAKANAN REPUBLIK INDONESIA
NOMOR 7 TAHUN 2014 TENTANG PEDOMAN UJI TOKSISITAS NONKLINIK SECARA IN
VIVO, http://jdih.pom.go.id/showpdf.php?u=816