Anda di halaman 1dari 14

LAPORAN PRAKTIKUM GENETIKA (BI-2105)

POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

Tanggal Praktikum

: 18 November 2013

Tanggal Pengumpulan :

2 Desember 2013

Disusun Oleh:
Andreas Vetra
10612068
Kelompok 16

Asisten:
Khrisna Putera
10611054

PROGRAM STUDI BIOLOGI


SEKOLAH ILMU DAN TEKNOLGI HAYATI
INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG
BANDUNG
2013

BAB I
PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang


Polymerase Chain Reaction atau PCR adalah teknik in vitro yang meniru reaksi
penggandaan atau replikasi DNA yang terjadi dalam makhluk hidup. Secara
sederhana PCR merupakan reaksi penggandaan daerah tertentu dari DNA cetakan
(template) dengan batuan enzim DNA polymerase. PCR terdiri atas beberapa siklus
yang berulang-ulang, biasanya 20 sampai 40 siklus. Proses tersebut mirip dengan
proses replikasi DNA secara in vivo yang bersifat semi-konservatif. Pada proses
PCR dibutuhkan DNA untai ganda yang berfungsi sebagai cetakan yang
mengandung DNA target untuk pembentukan molekul DNA baru, enzim DNA
polymerase,

deoksinukleosida

trifosfat

(dNTP),

dan

sepasang

primer

oligonukleotida. Dua primer oligonukleotida pendek digunakan untuk mengapit


daerah DNA yang akan direplikasi. PCR merupakan suatu teknik perbanyakan
molekul DNA dengan ukuran tertentu secara enzimatik melalui mekanisme
perubahan suhu (Muladno, 2002).
Teknik PCR dapat biasanya digunakan dalam analisis gen. Sebagai contoh
teknik dan aplikasi PCR dapat disebutkan sebagai berikut: kloning hasil PCR,
sekuensing hasil PCR, kajian evolusi molekular, deteksi mutasi (penyakit genetik,
determinasi seks pada sel prenatal, kajian forensik (tersangka kriminal, tersangka
ayah pada kasus paternal), dan masih banyak lainnya. Dengan demikian, penemuan
dan manfaat teknik PCR ini berdampak sangat luas terhadap kemajuan sains dan
teknologi secara umum. (CSU,2000)
Aplikasi yang menarik dari PCR adalah analisis DNA dari fosil, seperti
penemuan fosil Gajah purba di belanda. Aplikasi PCR biasa digunakan dalam
mempelajari susunan dari ekspresi gen. Jaringan (sel tunggal) dapat di analisa pada
tahap berbeda untuk melihat gen mana yang telah aktif atau yang telah dimatikan.
Aplikasi ini dapat juga menggunakan Q-PCR untuk mengetahui tingkat ekspresi gen
yang sebenarnya (Muladno, 2002).

1.2 Tujuan
Menghitung panjang fragmen ACO

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Pengertian dan Prinsip PCR


Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah teknik sintesis dan amplifikasi DNA
secara in vitro. PCR dapat mengamplifikasi segmen DNA dalam jumlah jutaan kali
hanya dalam beberapa jam. PCR adalah teknik yang melibatkan beberapa tahap
yang berulang (siklus) dan disetiap siklus terjadi duplikasi DNA untai ganda
(Handoyo, 2001).
Hal ini bergantung pada siklus termal yang terdiri dari siklus-siklus yang
berulang. Mulai dari pemanasan dan pendinginan dari reaksi untuk mencari DNA
dan replikasi enzimatik DNA menggunakan DNA polimerase, primer
(komplementer ke wilayah target) dan dNTP. Dengan demikian dapat memperkuat
urutan tertentu DNA dengan sebanyak satu miliar kali. Metode PCR Kebanyakan
dapat mengamplifikasi fragmen DNA hingga ~ 10 pasangan basa kilo (kb),
meskipun beberapa teknik memungkinkan untuk amplifikasi fragmen hingga 40 kb
dalam ukuran (Hays, 2005).

2.2 Tahap-tahap PCR


Dalam kerja PCR ada tiga tahap yang terjadi. Tahap pertama adalah tahap
Denaturasi yaitu pemisahan DNA untai ganda menjadi DNA untai tunggal. Tahap
ini berlangsung pada suhu berkisar antara 93 95oC, tergantung pada panjang DNA
yang digunakan dan juga pada panjang fragmen DNA target. Suhu denaturasi yang
terlalu tinggi akan menurunkan aktivitas polimerase DNA yang akan berdampak
pada efisiensi PCR. Selain itu juga dapat merusak DNA template, sedangkan suhu
yang terlalu rendah dapat menyebabkan proses denaturasi DNA template tidak
sempurna. Pada umumnya suhu denaturasi yang digunakan adalah 94oC. Tahap
kedua adalah tahap anneling yaitu tahap penempelan primer pada daerah tertentu
dari target DNA. Tahap anneling ini berlangsung ada suhu berkisar antara 37 - 60oC.
Pemilihan suhu annealing berkaitan dengan Tm primer yang digunakan untuk

proses PCR. Suhu annealing yang digunakan dapat dihitung berdasarkan (Tm 5)oC
sampai dengan (Tm + 5)oC. Dalam menentukan suhu annealing yang digunakan
perlu diperhatikan adanya miss priming pada daerah target dan nontarget. Tahap
ketiga adalah tahap extend primer yaitu tahap pemanjangan primer. Tahap extend
primer selalu dilakukan pada suhu 72oC karena suhu tersebut merupakan suhu
optimum polimerase DNA yang biasa digunakan untuk proses PCR (Handoyo,
2001).

Gambar 2.1 Proses PCR (Handoyo, 2001)

2.3 Fungsi Tiap Komponen Dalam PCR


Fungsi dari DNA template adalah sebagai cetakan untuk pembentukan molekul
DNA baru yang sama. Template DNA ini dapat berupa DNA kromosom, DNA
plasmid ataupun fragmen DNA apapun asal di dalam DNA template tersebut
mengandung fragmen DNA target yang dituju. Primer yang berfungsi sebagai
pembatas fragmen DNA target yang akan diamplifikasi dan sekaligus menyediakan
gugus hidroksi (-OH) pada ujung 3 yang diperlukan untuk proses eksistensi DNA.

dNTPs bertindak sebagai building block DNA yang diperlukan dalam proses
ekstensi DNA. Buffer PCR berfungsi untuk menjamin pH medium. MgCl2 bertindak
sebagai kofaktor yang berfungsi menstimulasi aktivitas DNA polimerase. Dengan
adanya MgCl2 ini akan meningkatkan interaksi primer dengan templat yang
membentuk komplek larut dengan dNTP (senyawa antara). Enzim polimerase DNA
berfungsi sebagai katalisis untuk reaksi polimerisasi DNA. Pada proses PCR, enzim
ini diperlukan untuk tahap ekstensi DNA (Handoyo, 2001).

2.4 Primer dan Ukuran Genom yang digunakan dalam PCR


Sampel DNA target yang digunakan adalah Gen Promoter Sekuens ACO yang
berasal dari buah pisang yang telah direkombinasi dengan plasmid E. coli. Daerah
yang disebut promoter pada sekuen gen ini berperan untuk mengatur ekspresi gen
yang mengakibatkan pematangan buah dan terletak pada daerah upstream atau ujung
5 pada coding area (Kipp dan May, 1997). Ukuran genom dari sampel DNA target
ini adalah 1526 base pairs (Wang dan Peng, 2000). Maka, primer yang digunakan
adalah primer untuk mengamplifikasi sekuens promoter gen ACO karena untuk
hasil PCR yang baik harus digunakan primer dengan panjang dan sekuens yang
komplementer dengan sampel DNA target yang dapat diketahui salah satunya
dengan menggunakan program PrimerQuest (Integrated DNA Technologies, 2011).

2.5 Faktor-Faktor yang Mempengaruhi PCR

A. Konsentrasi dan kualitas DNA


Konsentrasi DNA sebesar 0,01-0,1 g setiap l larutan template sudah
cukup baik untuk PCR namun yang paling penting adalah DNA harus bebas dari
pengotor seperti protein atau bahan-bahan yang tersisa saat purifikasi seperti
fenol atau alkohol. Purifikasi dapat dilakukan dengan menggunakan GFX DNA
Column. DNA yang digunakan sebagai cetakan dapat berupa rantai tunggal
maupun rantai ganda. Efisiensi amplifikasi biasanya dapat lebih tinggi jika

menggunakan molekul DNA yang sudah dilinearkan dengan suatu enzim


restriksi tertentu daripada menggunakan DNA yang berbentuk sirkular
(Sambrook et al., 1989).
B. Temperatur annealing dari kedua primer
Ukuran dan komposisi primer sangat mempengaruhi temperatur penempelan
primer terhadap untaian DNA target. Umumnya primer sebesar 17-30 basa
nukleotida dengan komposisi GC lebih dari 50% (Yuwono,2006).
C. Konsentrasi MgCl2
Konsentrasi MgCl2 sangat mempengaruhi spesifikasi produk PCR, aktivitas
serta kekhususan kerja enzim, penguatan primer mencapai suhu optimumnya
(primer annealing) dan penguatan fungsi primer dalam sintesis pemanjangan
rantai nukleotida. Konsentrasi optimumnya 1,5-4,0 mM. Namun, apabila
preparasi DNA banyak menggunakan EDTA untuk pengawetnya maka MgCl2
akan lebih tinggi dari keadaan normal (Sambrook et al., 1989).
D. Enzim polimerase
Konsentrasi enzim yang digunakan sangat tergantung dari jenis enzim. Pada
umumnya konsentrasi optimum berkisar antara 1,0-2,5 unit enzim setiap volume
reaksi 50 l. Sebaiknya pemakaian enzim tidak melebihi 2,5 unit karena malah
justru akan menurunkan spesifitasnya (Sambrook et al., 1989).
E. Konsentrasi dan kualitas primer
Kualitas primer sangat tergantung pada kualitas oligoprimer dan OD (optical
density). Namun demikian, konsentrasi primer sekitar 20 pmol sudah cukup
memadai untuk amplifikasi PCR. Konsentrasi primer yang lebih tinggi dari 1,0
M dapat menyebabkan terakumulasinya hasil polimerisasi yang nonspesifik.
Primer-primer yang akan digunakan (baik forward primer maupun reverse
primer sebaiknya mempunyai nilai Tm (melting temperature) yang serupa. Tm
adalah suhu pada saat setengah dari molekul DNA mengalami denaturasi. Nilai
Tm oligonukleotida dapat dihitung dengan menggunakan formula Tm = 2 (A+T)
+ 4 (G+C) (Sambrook et al., 1989).
F. Jumlah siklus PCR

Jumlah siklus terkait dengan konsentrasi awal DNA target dan


konsentrasi akhir yang diharapkan. Siklus yang terlalu banyak justru akan
meningkatkan konsentrasi produk yang tidak spesifik, sedangkan siklus yang
terlalu

sedikit

akan

mengurangi

kuantitas

produk

yang

diharapkan

(Yuwono,2006).
G. Deoksinukleotida triphosphate (dNTP)
Konsentrasi dNTP mix yang menghasilkan keseimbangan optimal terdiri
atas dATP, dCTP, dGTP, dTTP sebesar 10-20 M. Umumnya produk ini sudah
didapatkan dalam bentuk mix dan ready stock. Namun, jika masih dijumpai
dalam bentuk terpisah, sebaiknya keempat komponen tersebut memiliki
konsentrasi yang sama ketika akan digunakan untuk memperkecil kemungkinan
kesalahan penggabungan nukleotida selama proses polimerisasi. Konsentrasi
dNTP sebesar 20 M dalam 100 l secara teoritis cukup untuk mensintesis 2,6
g atau 10 pmol DNA yang mempunyai panjang 400 bp (Yuwono,2006).

BAB III
METODOLOGI

3.1 Alat dan Bahan


Tabel 3.1 Alat dan Bahan
Alat
Mesin Thermal Cycler PCR
Tabung Eppendorf 0,2 ml
Micropipet

Bahan
Gen Promotor ACO terisolasi 1
mikroliter
PCR Mix (Taq Polymerase, MgCl2,
dNTPs mix) 12,5 mikroliter dan

Pipet Tips

buffer reaksi

Sentrifuga

Primer 1 mikromolar
Air de-ion steril ditambahkan sampai
total reaksi 25 mikroliter

3.2

Cara Kerja
Bahan-bahan dimasukkan dalam tabung Eppendorf dengan urutan sebagai
berikut, air deion, DNA target, primer, dan PCR mix. Kemudian eppendorf yang
sudah berisi campuran bahan-bahan tersebut disentrifuga. Setelah disentrifuga,
Eppendorf dimasukkan ke mesin PCR yang telah dinyalakan sebelumnya.
Kemudian akan terjadi reaksi sesuai siklus yang diinginkan (Denaturasi awal pada
suhu 94oC 2 menit, diikuti 30 siklus: denaturasi selama 15 detik pada suhu 95oC,
penempelan primer 30 detik pada 55oC dan pemanjangan primer pada suhu 72oC
selama 2 menit; siklus ini diikuti pemanjangan primer pada suhu 72oC selama 7
menit). Ketika siklus telah selesai, didapatkanlah hasil.

BAB IV
HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Pengamatan


Foto Pengamatan

Hasil PCR
Kelompok 16
Gambar 4.1. Hasil Kompil Elektroforesis hasil PCR DNA
(Dokumentasi Pribadi, 2013)

Hasil Perhitungan

Gambar 4.2 Data Ladder DNA 1 kb, merk Fermentas.

Tabel 4.1. Perhitungan Rf dan Log Bp Ladder DNA 1kb, merk Fermentas
Ladder

10

11

12

13

14

Jarak
0,5
well ke
band

0,55 0,6

0,7

0,8 0,85 0,9

1,1 1,4

1,6

1,9

2,3

2,7

Panjang 2,7
total
gel

2,7

2,7

2,7 2,7

2,7

2,7 2,7

2,7

2,7

2,7

2,7

2,7

2,7

0,19 0,2

0,22 0,26 0,3 0,31 0,33 0,37 0,4 0,52 0,59 0,7

Ukuran
Bp
(x103)

10

Log Bp

3,9

3,78 3,7

Log Bp

Rf

3,5

3,6 3,54 3,5

0,85 1

2,5

1,5

0,75 0,5

0,25

3,4

3,3 3,2

2,88 2,7

2,4

4,5
4
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0

y = -1,8171x + 4,1599
R = 0,9661

Series1
Linear (Series1)

0,2

0,4

0,6

0,8

1,2

Rf

Grafik 4.1 Hasil Regresi dari Log Bp dan Nilai Rf Ladder DNA 1 kb

Berdasarkan grafik regresi linear Ladder, diperoleh persamaan


Hasil PCR kelompok 16 sebagai berikut :
Panjang Band = 0,6 cm
Panjang total = 1,7 cm
Rf Band
= 0,352
Bila dimasukkan ke persamaan, maka :
y = -1,8171x + 4,1599
Log Bp
= -1,8171 (Rf) + 4,1599
Log Bp
= -1,8171 (0,352 ) + 4,1599
Log Bp
= 3.51857
Bp
= 3300 bp.

y = -1,8171x + 4,1599.

4.2 Pembahasan
Pada akhir proses reaksi PCR akan terakumulasi hasil amplifikasi dari sekuens
spesifik yang berjumlah jutaan salinan yang disebut amplicons (National Center of
Biotechnology Informations, 2009). Pita-pita sejajar yang terlihat pada hampir
semua sumur gel elektroforesis merupakan bukti keberadaan amplicons dari Gen
Promoter ACO. Adanya pita-pita sejajar ini

berarti bahwa proses PCR telah

berhasil. Pita-pita sejajar ini menunjukkan posisi 1526 bp pada ladder karena ukuran
genom sampel gen promoter ACO adalah 1526 bp (Wang dan Peng, 2000). Namun,
ukuran panjang fragmen ACO yang teramati adalah 3300 bp. Perbedaan ini dapat
terjadi diakibatkan oleh adanya kontaminasi ,degradasi DNA ,kesalahan visual
pengamat saat pengukuran panjang band ,dll.
Adapun hasil dari elektroforesis yang lain, tidak begitu terlihat laddernya
disebabkan kesalahan pada saat pencampuran DNA, PCR mix, dan primer.
Kesalahannya bisa berupa volume yang dipakai kurang dari seharusnya ataupun
lebih. Dari pengamatan yang merupakan keanehan hanyalah garis-garis di bawah
fragmen ACO berada. Hal ini disebabkan terdapatnya senyawa lain yang berukuran
lebih kecil dari gen ACO.

BAB V
KESIMPULAN
Berdasarkan percobaan yang dilakukan didapatkan hasil panjang fragmen ACO adalah
3300 bp.

DAFTAR PUSTAKA
Colorado State University. 2000. Principles of Gel Electrophoresis.
http://www.vivo.colostate.edu/hbooks/genetics/biotech/gels/principles.html.
diakses tanggal 30 November 2012
Handoyo Darmo dan Ari Rudiretna.2001. PRINSIP UMUM DAN PELAKSANAAN
Hays, Lana. 2005. Introduction to DNA Extraction,
http://www.tsl.orst.edu.tgerc/dnaext.html, diakses pada 23 November 2012.
Integrated DNATechnologies. 2011. The Polymerase Chain Reaction. Online.
http://www.idtdna.com/pages/docs/educational-resources/the-polymerasechain-reaction.pdf (diakses pada tanggal 30 November 2013 pukul 11:55)
Kipp, Peter Barber dan Gregory Dewitt May. 1997. Gene promoter sequence from
banana. Online. http://patentscope.wipo.int/search/en/WO1997038106 (diakses
pada tanggal 1 Desember pukul 12.58)
Muladno.
2002.
Seputar
Pustaka Wirausaha Muda.

Teknologi

Rekayasa

Genetika.

Bogor:

Sambrook, J; Fritsch and Maniatis, T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual.


Second Edition. Cold Spring Harbour: Laboratory Press.
Wang dan Peng. 2000. Cloning and sequencing of the promoter region of banana
1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase (ACC oxidase) gene. Online.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AF221107.1 (diakses pada tanggal 1
Desember 2013 pukul 11.49)
Yuwono, T. 2006. Teori dan Aplikasi Polymerase Chain Reaction. Jogjakarta: Andi.