Teknologi Reproduksi

KRIOPRESERVASI EMBRIO

Oleh :
TRI PUTRI PURNAMA SARI
1302101010079
KELAS B (02)

FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN

UNIVERSITAS SYIAH KUALA
BANDA ACEH
2015

BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Teknologi reproduksi merupakan satu kesatuan dari teknik-teknik rekayasa
sistem reproduksi hewan yang dikembangkan melalui suatu proses penelitian dalam
bidang reproduksi hewan secara terus menerus dan berkesinambungan dengan hasil
berupa alat, metoda ataupun alat dan metoda yang dapat diaplikasikan dengan tujuan
tertentu. Terdapat banyak sekali teknologi reproduksi yang bisa diterapkan dalam
pelaksanaan kegiatan usaha peternakan yang ditujukan untuk meningkatkan populasi
dan produksi. Beberapa diantaranya telah dipakai di Indonesia namun sebagian besar
masih merupakan teknologi yang langka yang umumnya dikarenakan biaya
perlakuannya dan peralatannya sangat mahal.
Beberapa jenis ternak yang ada di bumi saat ini dalam keadaan hampir punah
atau

mendekati

kepunahan,

bahkan

sebagian

sudah

punah.

Keberadaan

keanekaragaman hayati (biodiversity) sangat terkait dengan konservasi sumberdaya

genetik ternak, namun demikian strategi konservasi yang ada masih belum
dilaksanakan dengan baik.
Inseminasi Buatan sangat populer pada ternak saat ini. Keberhasilan yang lebih
besar dari pada kawin alami merupakan salah satu faktor. Pada sapi, kambing, babi,
kuda telah dilakukan begitupula pada ayam. Permintaan semen beku dari pejantan
unggul menjadi semakin tinggi. Metode pembuatan semen beku berkualitas pada sapi
dan kambing menjadi topik di Indonesia. Namun pembuatan semen beku untuk babi
jarang sekali dilakukan. Oleh karena itu saya akan mengangkat topik mengenai
Kriopreservasi.

Teknik kriopreservasi merupakan suatu teknik penyimpanan sel hewan,

tumbuhan ataupun materi genetika lain (termasuk semen) dalam keadaan beku
melalui reduksi aktivitas metabolisme tanpa mempengaruhi organel-organel di dalam
sel sehingga fungsi fisiologis, biologis, dan morfologis tetap ada. Teknik
kriopreservasi merupakan teknik penyimpanan yang dilakukan pada suhu yang sangat
rendah (-196oC) dalam nitrogen cair (Boediono, 2003). Teknik kriopreservasi juga
sebagai faktor pendukung tambahan yang sangat baik untuk konservasi in situ dan
mungkin juga digunakan dalam program seleksi (Danchinburge dan Hiemstra, 2003).
1.2 Rumusan Masalah
1.
2.
3.
4.

Apa itu kriopreservasi?

Apa saja prinsip dan teknik kriopreservasi?
Apa saja faktor yang mempengaruhi kriopreservasi?
Apa kelebihan dan kekurangan kriopreservasi?

BAB II

PEMBAHASAN

2.1 Pengertian Kriopreservasi

Secara teoritis, kriopreservasi berasal dari kata krio yang berarti beku, dan
preservasi yang berarti penyimpanan pada temperatur rendah. Jadi kriopreservasi
adalah teknik penyimpanan materi genetik dalam keadaan beku pada temperatur
rendah atau suatu teknik penyimpanan sel hewan, tumbuhan dan materi genetika
lainnya (termasuk semen dan oosit) dalam keadaan beku melalui reduksi aktivitas
metabolisme tanpa mempengaruhi organel-organel di dalam sel, fungsi fisiologi,
biologi, dan morfologi (Suprianata dan Pasaribu, 1992).
Metode kriopreservasi sel spermatozoa dibedakan atas pembekuan lambat
(slow freezing), pembekuan cepat (rapid freezing), dan pembekuan sangat cepat
(ultra rapid freezing). Prinsip yang terpenting dari kriopreservasi sel spermatozoa
ialah pengeluaran air dari dalam sel (dehidrasi) sebelum membeku intraseluler. Bila
tidak terjadi dehidrasi akan terbentuk kristal es besar dalam sel yang dapat merusak
sel dan bila terjadi dehidrasi yang sangat hebat maka sel akan mengalami kekeringan
sehingga sel mati (Supriatna dan Pasaribu 1992). Prinsip perpindahan air keluar
masuk membran, baik dehidrasi sebelum deep freezing maupun rehidrasi pada saat
pencairan kembali (thawing) menjadi perhatian khusus.
Pada dasarnya tujuan utama kriopreservasi sel spermatozoa ialah melestarikan
plasma nutfah yang mendekati kepunahan dan mendukung program teknologi
inseminasi buatan (IB) pada ternak. Keuntungan kriopreservasi sel spermatozoa ialah
sel spermatozoa dapat disimpan dalam waktu yang tidak terbatas dan dapat digunakan
kapan saja bila diperlukan (Toelihere 1985).

2.2 Prinsip Kriopreservasi

Prinsipnya adalah pengeluaran sebagian besar air dari sel-sel sebelum terjadinya
pembekuan, sehingga terjadi penurunan volume air dalam sel, perubahan air menjadi
es, dan peningkatan konsentrasi larutan di dalam dan di luar sel. Mekanisme fisika
kriopreservasi meliputi penurunan suhu dalam keadaan tekanan normal disertai
dehidrasi sampai tingkat tertentu dan mencapai suhu jauh dibawah suhu beku (deep
freezing), misalnya suhu 196 oC. Proses ini harus bersifat reversible ke kondisi
fisiologis awal.
2.3 Teknik Kriopreservasi
Teknik kriopreservasi dapat dibedakan atas teknik lama (klasik) dan teknik baru :
A.

Teknik lama (klasik)

Teknik ini didasarkan pada freeze-induced dehydration, yaitu dehidrasi yang

diinduksi dengan pembekuan pada suhu di bawah titik beku air hingga -40C. Teknik
lama juga disebut teknik pembekuan lambat atau teknik pembekuan dua tahap.
Teknik pembekuan dua tahap meliputi inkubasi sel pada krioprotektan dengan total
konsentrasi 1-2 M yang menyebabkan dehidrasi moderat dan diikuti oleh pembekuan
lambat, misalnya dengan kecepatan 1C per menit hingga suhu -35C, lalu
pembekuan dalam nitrogen cair dan selanjutnya thawing (pelelehan) (Ika Roostika
dan Ika Mariska, 2003).
B.

Teknik baru
Teknik ini didasarkan pada vitrification, yaitu dehidrasi yang diinduksi pada

suhu di atas titik beku air.Vitrification (vitrifikasi) adalah fase transisi air dari bentuk
cair menjadi bentuk nonkristalin atau amorf, tembus pandang (glassy) karena elevasi
ekstrim dari larutan yang viskos selama pendinginan. Teknik vitrifikasi didasarkan
pada dehidrasi sel pada suhu non-freezing (tidak beku), yaitu dengan merendam
bahan dalam larutan krioprotektan dengan total konsentrasi 5-8 M pada suhu 0-25C
dan diikuti oleh pembekuan dan selanjutnya pelelehan. Macam-macam teknik baru
antara lain (1) vitrifikasi, (2) enkapsulasidehidrasi, (3) enkapsulasi-vitrifikasi, (4)

desikasi, (5) pratumbuh, (6) pratumbuh-desikasi, dan (7) dropplet-freezing (Ika

Roostika dan Ika Mariska, 2003).
Adapun penjelasannya sebagai berikut:
a. Pada teknik vitrifikasi, bahan diperlakukan dengan senyawa krioprotektif dan
dehidrasi dengan larutan vitrifikasi, lalu diikuti dengan pembekuan cepat,
pelelehan, dan pembuangan krioprotektan serta pemulihan kultur.
b. Teknik enkapsulasidehidrasi didasarkan pada teknologi yang telah dikembangkan
pada produksi benih sintetik. Pada teknik tersebut, bahan dienkapsulasi pada
kapsul alginat, lalu ditumbuhkan pada medium yang diperkaya dengan sukrosa
dan dikeringkan secara parsial dalam laminar air flow cabinet atau gel silika
hingga kandungan air sekitar 20% dan diikuti oleh pembekuan cepat (Ika
Roostika dan Ika Mariska, 2003).
c. Teknik enkapsulasi-vitrifikasi merupakan kombinasi antara teknik vitrifikasi dan
enkapsulasidehidrasi, yaitu bahan dienkapsulasi dengan kapsul alginat, lalu
dibekukan dengan teknik vitrifikasi.
d. Teknik desikasi merupakan teknik yang paling sederhana, yaitu mengeringkan
bahan dalam laminar air flow cabinet, gel silika atau flash drying hingga
kandungan air 10-20%, kemudian diikuti oleh pembekuan cepat (Ika Roostika dan
Ika Mariska, 2003).
e. Teknik pratumbuh meliputi penanaman bahan ke dalam media yang mengandung
krioprotektan, lalu diikuti oleh pembekuan cepat.
f. Teknik pratumbuh-desikasi dilakukan dengan menanam bahan ke dalam media
yang mengandung krioprotektan, lalu mengeringkannya dalam laminar air flow
cabinet atau gel silika dan diikuti oleh pembekuan cepat.
g. Droplet-freezing diawali dengan pra-perlakuan bahan ke dalam media cair yang
mengandung krioprotektan, lalu meletakkan pada Al-foil yang disertai dengan
droplet krioprotektan dan diikuti oleh pembekuan cepat (Ika Roostika dan Ika
Mariska, 2003).
Teknik lama memerlukan peralatan terprogram yang cukup mahal harganya,
sedangkan teknik baru tidak memerlukan peralatan canggih dan prosedurnya relatif
lebih mudah. Teknik lama memerlukan peralatan pembekuan, digunakan pada kultur

sel, dan lebih sulit diaplikasikan pada unit sel yang lebih besar seperti tunas apikal
atau embrio. Teknik lama berhasil diterapkan pada sistem kultur yang tidak
terdiferensiasi (suspensi sel dan kalus) dan spesies yang toleran terhadap suhu dingin,
namun tidak berhasil diterapkan pada spesies tropis. Teknik vitrifikasi telah berhasil
diterapkan pada spesies dengan skala yang lebih luas (tropis dan subtropis) dan
sistem kultur yang lebih kompleks (embriosomatik, suspensi sel, dan meristem
apikal) (Ika Roostika dan Ika Mariska, 2003).
2.4 Mekanisme Kriopreservasi
Merupakan perubahan bentuk fisik timbal balik dari fase cair ke fase padat
(fase beku) dan kembali ke fase cair
a. Mekanisme Fisik Kriopreservasi ini meliputi;

Penurunan temperatur dalam keadaan tekanan normal disertai dengan

dehidrasi

sampai

tingkat

tertentu

dan

mencapai

temperatur

deepfreezing

Proses ini harus revelsibel ke keadaan fisiologis

Tujuannya mempertahankan sesempurna mungkin sifat-sifat meterial

biologis, terutama viabilitasnya

2.5 Aspek-Aspek Praktis dari Kriopreservasi Semen

Pemrosesan semen pada kriopreservasi telah dijelaskan sebelumnya. Semen
dikemas dalam straw (0,25 dan 0,5 ml) untuk pembekuan dan penyimpanan, atau
dibekukan sebagai pelet pada depresi dangkal es kering. Straw dibekukan dalam fase
uap diatas nitrogen cair atau pada mesin pembeku dengan laju terkontrol.
Spermatozoa dikemas dalam bentuk straw 0,2 ml atau sekitar 10 15 juta sel
spermatozoa yang diinseminasikan langsung dari straw sesudah pencairan.

Sedangkan semen babi dapat dibekukan pada kuantitas yang lebih besar dengan
volume 200 l pada tabung 10 15 ml spermatozoa untuk satu kali inseminasi.
Hewan ternak seperti biri-biri, rusa dan hewan ruminansia eksotik lainnya dapat
menggunakan pipet khusus inseminasi laparoskopis yang telah dikembangkan dengan
ukuran straw 0,25 ml dan jumlah sperma lebih rendah dari metode inseminasi secara
trans servikal. Inseminasi dapat dilakukan setelah proses pencairan dalam waktu
beberapa detik dengan menggunakan pipet trans servikal. Cara yang lebih mudah
untuk mencairkan sampel semen dengan mengurangi konsentrasi simultan
krioprotektan yang dapat memberikan keunggulan secara cepat dan jelas setelah
proses pencairan basah dengan menuangkan pelet ke dalam larutan khusus. Pencairan
straw biasanya dilakukan dengan pencelupan dalam bak air hangat dengan suhu
optimum dan kombinasi waktu dapat digunakan dalam penelitan ini dengan pencairan
pada suhu maksimum (60-70C). Teknik pencairan dengan laju penghangatan yang
lebih cepat dan dapat menghasilkan kualitas sperma yang baik (Pursel dan Park.
1985). Penyimpanan volume sel lebih besar dapat menyebabkan membran pecah
(Bailey et al., 1994). Parkinson dan whitfield (1987) menyatakan bahwa periode
pendinginan dan pembekuan dapat mempengaruhi kelangsungan hidup sperma dan
meningkatkan fertilitas spermatozoa. Volume pembekuan yang lebih besar seperti
maxi-straw atau kantung plastik dapat mempengaruhi kebutuhan dan pengembangan
sistem control suhu yang lebih selektif.
2.6 Faktor yang Mempengaruhi Kriopreservasi
Sejumlah faktor yang mempengaruhi keberhasilan kriopreservasi dengan
teknik pembekuan lambat adalah (1) kecepatan pembekuan, (2) jenis dan konsentrasi
krioprotektan, (3) suhu akhir pembekuan, dan (4) tipe dan keadaan fisiologis bahan
yang akan disimpan. Jika pembekuan terlalu lambat maka sel terlalu terdehidrasi
sehingga konsentrasi zat elektrolit dalam sel menjadi tinggi. Jika pembekuan terlalu

cepat maka sel kurang mengalami dehidrasi sehingga terjadi formasi es intraseluler
yang bersifat letal.
Penambahan krioprotektan dapat memelihara keutuhan membran dan
meningkatkan potensial osmotik media sehingga cairan di dalam sel mengalir keluar
dan terjadi dehidrasi. Krioprotekan yang umum digunakan adalah DMSO, gliserol,
PEG, sorbitol, dan manitol. Senyawa dalam krioprotektan dapat dipisah menjadi dua,
yaitu senyawa yang dapat masuk ke dalam sel (permeating agent) seperti DMSO,
gliserol (pada suhu tertentu) dan yang tidak dapat masuk ke dalam sel (non
permeating agent) seperti sukrosa dan gula alkohol (manitol, sorbitol) (Ika Roostika
dan Ika Mariska, 2003).
Selama pembekuan dan pelelehan, sel dapat mengalami kerusakan sebagai
akibat dari (1) eksposur bahan pada suhu rendah, (2) formasi kristal es, (3) sel
terdehidrasi, dan (4) formasi radikal bebas. Eksposur pada suhu rendah dapat
menyebabkan inaktivasi protein yang sensitif terhadap suhu dingin. Sebagian besar
formasi es intraseluler bersifat letal dan pada dasarnya sel dapat mentolelir formasi es
ekstraseluler. Namun demikian, formasi es ekstraseluler juga dapat merusak sel
karena daya mekanis dari kristal es yang tumbuh, gaya adesi kristal es terhadap
membran, interaksi elektris yang disebabkan oleh perbedaan solubilitas ion pada fase
es dan cair, formasi gelembung udara intraseluler, luka khemis yang berhubungan
dengan peroksidase lipid dan perubahan pH pada lokasi tertentu (Ika Roostika dan
Ika Mariska, 2003).
Sel yang terdehidrasi terlalu kuat dapat mengalami plasmolisis yang kuat pula
sehingga berakibat terhadap perubahan pH, interaksi mikromolekuler, dan
peningkatan konsentrasi zat elektrolit. Pada saat pelelehan, kontraksi osmotik dapat
menyebabkan endositotik vesikulasi irreversibel yang mengakibatkan sel lisis karena
bahan membran yang baru tidak mampu memfasilitasi deplasmolisis (Ika Rostika dan
Ika Mariska, 2003).

2.7 Faktor-Faktor yang Dapat Merusak Spermatozoa Selama Pemyimpanan

Kejadian yang dapat merusak dan menurunkan viabilitas spermatozoa selama
proses penyimpanan dan pembawa materi genetik ternak (sel gamet) dengan teknik
kriopreservasi yaitu kejutan dingin (cold shock) dan pembentukan krista-kristal es.
Kejutan dingin terjadi karena adanya penurunan suhu secara mendadak dibawah suhu
0C. berkaitan erat dengan fase pemisahan dan penurunan sifat-sifat permeabilitas
secara selektif dan membran bioligik sel hidup (Watson, 2000).
Pengaruh kejutan dingin terhadap pembawa materi genetik ternak dapat
dilihat pada sel spermatozoa dan sel telur (oosit). Pada sel spermatozoa, kejutan
dingin menyebabkan terjadi penurunan motilitas, pelepasan enzim pada akrosom,
perpindahan ion melewati membran dan penurunan kandungan lipid (fosfolipid dan
kolestrol) yang berperan untuk mempertahankan integritas struktural-membran
plasma (Weitze dan Petzoidt, 1992; White, 1993).
Pembentukan kristal-kristal es berkaitan erat dengan perubahan tekanan
osmotik dalam fraksi yang tidak beku (Watson, 2000). Pengaruh pembentukan
kristal-kristal es terhadap pembawa materi genetik ternak selama proses
kriopreservasi dapat dilihat pada sel spermatozoa dan sel telur. Pada sel spermatozoa
dapat menyebabkan penurunan motilitas dan viabilitas spermatozoa, peningkatan
pengeluaran enzim-enzim intraseluler ke ekstraseluler dan kerusakan pada organelorganel sel, seperti mitokondria dan lisosom (Suprianata dan Pasaribu, 1992; Dhani
dan Sahni, 1992). Apabila mitokondria rusak dan rantai oksidasi putus akan
mengakibatkan spermatozoa berhenti bergerak karena tidak ada pasokan energi dari
organel mitokondria. Sumber energi mitokondria berperan untuk menggertak
mikrotubul sehingga terjadi pergesekan diantara mikrotubul sehingga spermatozoa
dapat bergerak secara bebas (motil).
2.8 Keuntungan dan kerugian

Keuntungan kriopreservasi embrio :

1. Embrio dapat disimpan dalam jangka waktu tidak terbatas
2. Embrio dapat dikoleksi sepanjang tahun dan ditransperkan pada musimmusim kawin
3. Surplus embrio dapat disimpan dan ditransferkan pada resifien yang akan
tersedia
4. Jenis-jenis embrio yang berada dalam ambang kepunahan dapat dipreservasi
atau pelestarian plasma nutfah
5. Sebagian embrio dapat dibekukan dan ditransferkan.
Kerugian kriopreservasi embrio :
1. Biaya tambahan untuk peralatan pembekuan dan tenaga teknisi terlatih,
trampil untuk mengoperasikan alat
2. Hanya embrio yang berkualitas bagus yang cocok dan dapat dibekukan
3. Sekitar 1/10 embrio beku yang telah dicairkan akan mengalami kerusakan
berat karena alasan kriopreservasi.

2.9 - Klasifikasi embrio Pre Pembekuan

Kualitas

Penampilan umum morfologi

A (+++)
Sangat baik

Stadium embrio sesuai dengan yang diantisifasi

( morula, blastosis awal, blastosis ) tidak cacat, zona
intak, bentuk bundar sperikal, ikatan antar blastomer
erat dan kompak, ukuran sama besar dan simetris,
warna agak gelap dan morfologi sel yang utuh

B ( ++ ) Baik

Stadum perkembangan agak retarded

banding

dengan sekelompok embrio yang terkoleksi bersama

tampak sdikit cacat, seperti keluarnya salah satu
blastomer dari ikatan kumpulan blastomer, bentuk
simetris,
C ( + ) Cukup

Staium perkembangan biasanya retarded , Cacat

bebrapa blastomer keluar, mulai berdegenerasi dan
berwarna pucat, ukuran blastomer tidak sama besar
atau asimetris

D ( - ) Jelek

Stadium perkembagan retarded , terlihat kerusakan

pada semua sel blastomer, sel blastomer sudah
mengalami degenerasi seluler seperti vakuolisasi,
granulasi dan debris, sedikit atau tidak ada sama
sekali organisasi sel
retak

Klasifikasi embrio Pasca Pembekuan

dan zona pellusida tampak

Kualitas

Penampilan umum morfologi

A (+++) Sangat baik

Embrio masih seperti segar, tidak dapat dibedakan

dari embrio yang belum dibekukan

B ( ++ ) Baik

Lebih gelap dari normal, masih memiliki ukuran dan

bentuk seperti embrio segar

C ( + ) Cukup

Tampak jelas lebih gelap dan lebih kecil dari normal,

material yang gelap keluar dari massa sel, vesikuler,
inclusion tampak jelas, zona kelihat retak dengan
batas jelas atau kabur

D ( - ) Jelek

Warna gelap, bentuk irreguler, 1 atau beberapa masa

hitam kecil, granular, vesiculer inclusion keluar besar,
zona retak dan bentuk irreguler, blastomer mebran
kabur, kadang kala blastomer bulat tetapi tidak saling
melekat dengan blastomer sekitarnya

E ( mati ) dead

Biasanya

bentuk

irreguler,

zona

rusak

berat,

blastomer-blastomer terlalu terang atau gelap, bentuk

embrio irregular karena sering kehilangan bagian luar
membran, masa sitoplasma sangat sedikit dan tidak
ada organisasi sel dengan jarak yang jauh dalam
sitoplasma

BAB III
PENUTUP

3.1 Kesimpulan

kriopreservasi berasal dari kata krio yang berarti beku, dan preservasi yang
berarti penyimpanan pada temperatur rendah. Jadi kriopreservasi adalah
teknik penyimpanan materi genetik dalam keadaan beku pada temperatur
rendah atau suatu teknik penyimpanan sel hewan, tumbuhan dan materi
genetika lainnya (termasuk semen dan oosit) dalam keadaan beku melalui
reduksi aktivitas metabolisme tanpa mempengaruhi organel-organel di dalam

sel, fungsi fisiologi, biologi, dan morfologi.

Metode kriopreservasi sel spermatozoa dibedakan atas pembekuan lambat
(slow freezing), pembekuan cepat (rapid freezing), dan pembekuan sangat

cepat (ultra rapid freezing).

Teknik kriopreservasi dapat dibedakan atas teknik lama (klasik) dan teknik

baru.
Faktor yang mempengaruhi keberhasilan kriopreservasi dengan teknik
pembekuan lambat adalah (1) kecepatan pembekuan, (2) jenis dan konsentrasi
krioprotektan, (3) suhu akhir pembekuan, dan (4) tipe dan keadaan fisiologis

bahan yang akan disimpan.

Pada penyimpanan in vitro jangka pendek dan jangka menengah diperlukan
tindakan subkultur yang berulang-ulang sehingga kurang efisien dalam hal

waktu, tenaga, ruangan, dan biaya.

Keuntungan lain dari kriopreservasi sel spermatozoa ialah sel spermatozoa
dapat disimpan dalam waktu yang tidak terbatas dan dapat digunakan kapan
saja bila diperlukan.
DAFTAR PUSTAKA

Bailey JL, Buhr MM. 1994. Cryopreservation alters the Ca2+ flux of bovine
spermatozoa. Can J Anim Sci 74.

Boediono, A. 2003. Vitrifikasi vs pembekuan lambat pada pembekuan embrio.

Symposium Perkumpulan Teknologi Reproduksi Indonesia (PATRI). Denpasar.
hlm. 24 32.

Ika Roostika Tambunan dan Ika Mariska. 2003. Pemanfaatan Teknik

Kriopreservasi

dalam

Penyimpanan

Penelitian Bioteknologi dan Sumberdaya

Plasma

Nutfah

Tanaman. Balai

Genetik Pertanian. Bogor

Suprianata, I. dan F.H. Pasaribu. 1992. In Vitro Fertization, Transfer Embrio

dan Pembekuan Embrio. Pusat Antar Universitas, Institut Pertanian Bogor.

Toelihere MR. 1985. Inseminasi Buatan pada Ternak. Bandung: Angkasa.

Watson, P.F. 2000. The Causes of reduced fertility with cryopreserved semen.
Anim. Reprod.

Weitze, K.F. and R. Petzoldt. 1992. Preservation of semen. Anim. Repord.