Anda di halaman 1dari 12

LAPORAN PRAKTIKUM

SDS PAGE
Tugas Mata Kuliah Instrumentasi

Oleh:
Adilah Ulfiati

PROGRAM MAGISTER ILMU BIOMEDIK


FAKULTAS KEDOKTERAN
UNIVERSITAS BRAWIJAYA
MALANG
2014

BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
PAGE (Polyacrylamide Gel Electrophoresis) merupakan metode analisis
yang digunakan untuk memisahkan komponen campuran protein berdasarkan
ukurannya. Teknik ini berdasarkan prinsip bahwa molekul yang bermuatan
akan bermigrasi pada daerah elektrik ke elektroda yang berlawanan tandanya.
Dengan kata lain teknik ini menggunakan prinsip perbedaan kemampuan
migrasi dari setiap molekul.
Teknik elektroforesis umum tersebut tidak bisa digunakan untuk
menentukan berat molekul dari molekul biologis karena pergerakan zat
bergantung pada tidak hanya ukuran tapi juga muatan. Untuk mengatasi ini,
sampel biologis membutuhkan perlakuan khusus yaitu penyeragaman muatan
yang dapat menyebabkan pergerakan zat bergantung hanya pada ukuran.
Untuk protin-protein yang memiliki ukuran dan bentuk yang berbeda, harus
didenaturasi terlebih dahulu dengan menggunakan bantuan SDS (Sodium
Dodecyl Sulphate).

SDS merupakan detergen anionic yang berfungsi mendenaturasikan


protein, memberikan muatan negative pada protein dan molekul hidrofobik.

Hal tersebut akan menyebabkan protein kehilangan struktur secondary,


tertiary atau quaternary nya. Protein dengan SDS akan bermuatan negatif dan
ketika dimasukkan ke dalam tempat elektrik, protein tersebut akan bermigrasi
ke elektroda yang bermuatan positif dan terpisahkan berdasarkan ukuran.
SDS-PAGE menggunakan gel berupa gel poliakrilamid yang bersifat
neurotoksik. Gel poliakrilamid terbentk dari hasil polimerasi monomer
akrilamid dan bisakrilamid. Polimerasi tersebut dapat diinisiasi oleh
ammonium persulsat (APS) yang dapat membentuk radikal bebas.
Gambar 1. Struktur Protein Setelah diberi SDS
Sistem buffer terdiri dari continous system dan discontinuous system .
Continous system menggunakan satu jenis gel yaitu menggunakan resolving
gel,

sementara discontinous

system

menggunakan

dua

jenis

gel

berupa resolving gel dan stacking gel. Stacking gel berfungsi untuk menahan
sementara agar sampel bermigrasi pada waktu yang bersamaan. Resolving
gel berfungsi untuk memisahkan molekul-molekul yang ada berdasarkan berat
molekulnya.
Pewarnaan gel pada teknik SDS-PAGE terdiri dari commasie blue
staining dan silver salt staining. Commasie blue straining adalah pewarna
tekstil trifenilmetana, dan lebih sering digunakan di dalam teknik SDS
PAGE. Commasie blue straining banyak beberapa kelebihan yaitu harga yang
relatif murah, mengikat protein secara spesifik, bekerja cepat. Silver salt

staining memiliki

kelebihan

yaitu

hasilnya

lebih

akurat

jika

dibandingkan coomassie blue staining. Kekurangan silver salt staining yaitu


harga yang lebih mahal dan membutuhkan waktu yang lebih lama.
1.2 Tujuan
1. Mahasiswa memahami prinsip elektroforesis

2. Mahasiswa mampu melakukan langkah-langkah kerja SDS-PAGE.


3. Mahasiswa mampu menganalisis hasil SDS-PAGE dengan Microsoft
excel.

BAB II
METODE PRAKTIKUM
2.1 Waktu dan Tempat
Praktikum SDS-PAGE ini berlangsung pada tanggal 14 Maret 2014 di
laboratorium biomedik FKUB.
2.2 Alat dan Bahan
Alat dan bahan yang digunakan dalam praktikum ini:
2.2.1 Preparasi Gel
1. Alat elektroforesis
2. Baker glass 2 buah
3. Micropipette
4. Comb
5. Aquades
6. Akrilamid
7. Gel buffer 2,5 ml
8. APS dan TEMED
9. ddH2O
Tabel 1. Formulasi gel
12%
ddH2O (ml)
Acrillamida/bis (ml)
Gel Buffer (ml)
10% SDS (ml)
Tris-HCL M
pH Tris-HCL
APS 10% (l)
TEMED (l)
2.2.2 Preparasi Sampel
1. 50 l b-mercaptoetanol
2. Sample Buffer terdiri dari

Separating Gel
3,4
4
2,5
0,1
1,5
8,8
50
5

Stacking Gel
3,4
4
2,5
0,1
0,5
6,8
50
10

a. 3,55 ml Deionized Water


b. 1,25 ml 0.5M Tris-HCL, pH 6.8
c. Glycerol 2,5ml
d. SDS 2,0 ml
e. Bromophenol Blue 0,2 ml
3. Air panas
4. Micropipete
5. Sampel (Purifikasi protein rekombinan Ag38 kDa Mycobacterium
tuberculosis)
6. Protein marker untuk mengetahui berat molekul
2.2.3 Elektroforesis Gel
1. Alat elektroforesis
2. Power Supply
3. Micropipete
4. Running Buffer
2.2.4 Staining dan Destaining
1. Wadah plastik bertutup 1 buah
2. Staining Solution
3. Coomassie Briliant Blue
4. DestainingSolution (100 ml) :
-

Methanol 20 cc

As. Ac. Glacial10 cc

Aquades 100 cc

2.3 Prosedur Kerja


2.3.1 Preparasi Gel
1. Pasang kaca pada penjepitnya.

2. Masukkan gel akrilamid ke dalam 2 buah baker glass. Gelas yang pertama
untuk separating gel dan gelas yang kedua untuk stacking gel.
3. Masukkan gel buffer 2,5 ml.
4. Masukkan APS dan TEMED ketika akan dimasukkan ke dalam gel caster
atau loyang. Masukkan terlebih dahulu pada campuran separating gel.
5. Masukkan campuran separating gel tadi ke dalam loyang dengan bantuan
mikropipet. Beri aquades agar permukaan gel rata. Tunggu hingga
separating gel membentuk gel. Buang sisa aquades.
6. Masukkan APS dan TEMED pada campuran stacking gel ketika akan
dimasukkan ke dalam loyag elektroforesis.
7. Masukkan campuran stacking gel dengan menggunakan micropipete.
8. Pasang comb diatas stacking gel.
9. Setelah gel mengeras, kaca dilepas dari penjepit.
10. Gel pada kaca dipasang pada alat elektroforesis.
11. Tuangkan running buffer.
2.3.2 Preparasi Sampel
1. Sebelum dimasukkan ke dalam well, sampel diberi perlakuan terlebih
dahulu.
2. Tambahkan 50 l b-mercaptoetanol ke dalam 950 l buffer sample
dengan dilusi 1:2
3. Panaskan sampai dengan 950C dalam waktu 4 menit.
4. Sampel didinginkan dalam suhu ruangan
2.3.3 Elektroforesis Gel
1. Sampel dimasukkan ke dalam well-well dengn menggunakan pipet
khusus sebanyak 2 l / well.
2. Hubungkan alat elektroforesis dengan power supply.
3. Running dengan tegangan listrik sebesar 120 V selama 60-90 menit.
4. Gel dilepas dari kacanya

2.3.4 Pewarnaan
1. Gel direndam dalam staining solution Coomasie Brilliant Blue.
2. Letakkan dalam shaker selama 20-30 menit.
2.3.5 Destaining
1. Pewarna pada gel dihilangkan dalam rendaman destaining solution 1-2
jam dalam keadaan tetap di shaker.
2. Gel siap discan dan dianalisa hasilnya.
3. Hitung BM protein pada band protein yang tampak pada gel
menggunakan grafik regresi linear.

BAB III
HASIL DAN PEMBAHASAN
3.1 Hasil Praktikum
Berikut merupakan hasil SDS PAGE dari sample hasil purifikasi protein
rekombinan Ag36 kDa Mycobacterium tuberculosis menggunakan urea 2 M.

Gambar 2. Hasil SDS PAGE


Tabel 2. Hasil Pengukuran dengan panjang lintasan 62 mm
BM

Log BM

Tracking

RF

40

1.602059991

28

0.451613

35

1.544068044

33

0.532258

29

0.467742

Keterangan:
BM
Tracking
RF
x
y

: BeratMolekul
: batas stacking protein berhenti
: tracking/panjanglintasan (rrelative migration distance)
: Beratmolekul protein sampel (10log BM sampel)
: Logaritma BM

Untuk mencari berat molekul protein yang dituju maka dimasukkan ke


rumus berikut:

(Rf kecilRf Sampel)


(Rf KecilRf Besar )
x(log BM besar-log BM kecil))+log BM kecil
BM sample=
RF kecil RF sampellog
= 0,532258 0,467742
= 0,064516
RF kecil RF besar

= 0,532258 0,451613
= 0,080645

Log BM besar Log BM kecil

= 1,602059991 1,544068044
= 0,057991947

Log BM sampel (x)

0,057991947)+1,544068044
( 0,064516
0,080645
X

= 1,5905461602

BM

= 101,5905461602

BM

= 38,94588723kD

Dari perhitungan diatas maka didapatkan hasil running dari SDS PAGE adalah
38,94588723 kD

3.2 Pembahsan
Dalam preparasi gel, konsentrasi gel yang akan dibuat disesuaikan dengan
berat molekulnya semakin berat maka persenan gel yang dibuat semakin kecil.
APS dan TEMED merupakan katalisator dan harus diberikan terakhir dalam
pencampuran pada tahap preparasi gel. Konsentrasi katalis sangat penting.
Anyaman gel yang tidak baik dapat diakibatkan konsentrasi katalis yang tidak

akurat. Pemberian APS dan TEMED dilakukan ketika akan dimasukkan ke dalam
loyang atau gel caster. PAda campuran stacking gel jangan dulu diberikan APS
dan TEMED sebelum separating gel karena akan cepat mengeras atau sudah
terlebih dahulu membentuk gel. Jika demikian, akan sulit untuk memasukkan
campuran stacking gel tersebut ke dalam Loyang. Stacking gel dimasukkan
apabila sisa separating gel pada baker glass sudah mulai membentuk gel. Itu
tandanya campuran separating gel yang dimasukkan ke dalam loyang sudah mulai
mengeras.
Pada tahap preprasi sampel, campuran RSB atau b-mercaptoetanol
digunakan untuk memotong ikatan disulfide agar mudah bermigrasi dan
menunjukkan bentuk migrasi yang linier pada gel. Sedangkan pemanasan
dilakukan dengan tujuan mengoptimalkan pengkatalisnya agar benar-benar linier.
Pewarnaan bisa dilakukan dengan berbagai staining atau pewarnaan.
Pewarna silverstain digunakan jika berat protein kurang dari 4 nanogram. Protein
glikoprotein tidak bisa menggunakan pewarnaan kromasin. Pewarna yang
digunakan untuk protein gikoprotein adalah PAS. Gel yang didalam chamber
disiram dengan larutan biru kemudian diberi destaining. Destaining digunakan
untuk memberikan latar putih agar kromasi yang diserap protein dapat terlihat.
Ketika dialiri listrik, proteinnya luruh.

BAB IV
PENUTUP
4.1 Kesimpulan
1. Mahasiswa memahami prinsip elektroforesis

2. Mahasiswa mampu melakukan langkah-langkah kerja SDS-PAGE.


3. Mahasiswa mampu menganalisis hasil SDS-PAGE dengan Microsoft
excel.
4.2 Saran
1. Pada praktikum berikutnya keberadaan alat dan bahan dijaga dengan baik
dan melakukan prosedur dengan memperhatikan hal-hal khusus pada
setiap prosedur praktikum.